全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第1期
收稿日期:2007-09-26
基金项目:安徽省高校引进人才专项(ZRC200561)
作者简介:苗永美(1976-),女,山东临沂人,硕士,讲师;从事林木、园林植物、观赏花卉、中药材等生物技术研究;E-mail:mym416@163.com
菘蓝(Isaticindigotica)属十字花科菘蓝属二年生草本植物,是一种有重要开发前景的药用植物,为常
见的中药材,是大青叶及板蓝根的主要来源。菘蓝中含有多种氨基酸、靛青和靛玉红等多种药用成分,具有
清热、解毒、凉血的功效[1]。愈伤组织的诱导是实现细胞大规模培养和建立高产细胞系的前提和基础,利用
现代生物技术,通过组织培养、细胞培养探讨生产药物有效成分的设想已在红豆杉、西洋参、紫草、银杏等
多种药用植物上作了研究,并取得了一些有益的进展[2~5]。据研究板蓝根中不含有靛青和靛玉红,而叶和叶
柄中均含有靛青和靛玉红[6]。因此采用菘蓝叶柄和叶片两种外植体为培养材料,进行愈伤组织的诱导和增
殖,以期找到诱导愈伤组织能力强的最佳外植体和最佳培养基,为菘蓝细胞进行大规模培养和靛玉红工业
化生产方面提供实验材料。
1 材料和方法
1.1 实验材料
菘蓝的种子(安徽科技学院中药园提供)无菌发芽得到无菌苗,然后取无菌苗的叶片、叶柄进行培养。
1.2 实验方法
1.2.1 无菌苗的获得 菘蓝的种子先用无菌水反复冲洗,再用 0.1%的 HgCl2处理 10min,最后用无菌水冲
洗 4次,无菌条件下接种到 MS基本培养基中进行培养。
菘蓝两种外植体愈伤组织诱导研究
苗永美 简兴 石静
(安徽科技学院生命科学学院,凤阳 233100)
摘 要: 为寻找菘蓝愈伤组织诱导的最佳外植体,最佳培养基及愈伤组织继代增殖的最佳培养基,选用叶片和叶
柄两种外植体,在添加不同种类植物激素处理组合的培养基上,对不同外植体进行愈伤组织的诱导和继代增殖研究。结
果表明叶片比叶柄愈伤组织的诱导能力强,表现为出愈时间早,诱导率高,出愈多且质量好。叶片愈伤组织诱导培养基:
MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D0.3～0.5mg/L;继代增殖培养基:MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.3mg/L。因此,采用菘蓝叶片为外植
体,能高效的诱导出愈伤组织并能快速增殖。
关键词: 菘蓝 组织培养 外植体 愈伤组织
StudyonCalusInductionofTwoExplantsinIsatisindigotica
MiaoYongmeiJianXing ShiJing
(ColegeofLifeScience,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100)
Abstract: InordertoexplorethebestexplantsandmediumforcalusinductioninIsatisindigotica,thebestmediumfor
calusmultiplication,leafandpetioleusedasexplants,calusinductionandsub-culturewerestudiedonmediaoftreatment
combinationsofaddingdiferenthormones.Theresultsshowedthatleafcalusinductionabilitywasstrongerthanpetioleones
byearliertimetoproducecalus,higherinductionrate,moreandbetercalus.LeafcalusinductionmediumwasMS+6-BA1.
0mg/L+2,4-D0.3～0.5mg/L,calussub-culturalmediumwasMS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.3mg/L.SoleaffromI.indigotica
chosenasexplant,caluswasinductedeficientlyandmultipliedhighfrequently.
Keywords: Isatisindigotica Tisueculture ExplantCalus
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
1.2.2 菘蓝愈伤组织诱导 选择长势好、颜色深绿的叶片,切割成约 1cm2,叶柄剪成 2cm左右接种到初代
培养基上。基本培养基为 MS;激素组合处理:6-BA和 2,4-D两因素完全设计、6-BA和 IBA两因素完全设
计、6-BA和 NAA两因素完全设计,其中 6-BA设置四水平即 0,0.5,1.0,1.5mg/L;IBA、NAA及 2,4-D也分
别设置四水平即 0.1,0.3,0.5,1.0mg/L,共 48种激素组合处理。每处理 5瓶,每瓶接外植体 6个。45d后,统
计愈伤组织诱导率和重量。
1.2.3 愈伤组织继代培养 将初代培养的愈伤组织称重后接种继代培养。培养基的激素设置是两因素完
全设计即 6-BA(0,0.5,1.0mg/L)和 2,4-D(0.1,0.3,0.5,1.0mg/L)共 12种激素组合处理,一个月后称增殖
后的鲜重,然后将获取的鲜愈伤组织于 60℃烘干至恒重,并称其干重,每个处理重复 3次。
上述培养基均加琼脂粉4.5g/L,蔗糖30g/L,pH=5.8,培养温度25±1℃,光照强度2500Lx,光照周期12h/d。
1.2.4 结果统计
愈伤组织诱导率(%)=产生愈伤组织叶数 /接种的外植体数×100
平均每叶出愈重量(mg)=出愈总重量/出愈的外植体数
愈伤组织增殖倍数=继代增殖后鲜重/接种时鲜重
2 结果与分析
2.1 愈伤组织的诱导
2.1.1 不同生长素种类对愈伤组织诱导的影响 将叶片和叶柄接种在 IBA、NAA和 2,4-D三种生长素分
别与 6-BA进行组合设计培养基上,结果发现两种外植体在不同生长素的培养基上器官发生方式不同。两
种外植体在 IBA和 NAA两种生长素培养基上主要以器官型进行分化,接种 10d左右,叶片和叶柄长出很
多不定芽,愈伤组织的量极少。而在含 2,4-D的培养基上,没有出现不定芽,而是长出愈伤组织。这说明
2,4-D是适合愈伤组织诱导。
2.1.2 不同外植体对愈伤组织诱导的影响 两种外植体在不同处理培养基上表现不同。总体来看,叶片的
出愈时间要早于叶柄,接种约 7d切口处长出愈伤组织,而叶柄在接种约 10d才长出愈伤组织。两种外植体
愈伤组织诱导率和出愈量也存在差异,在 16种处理培养基上,叶片愈伤组织平均诱导率为 93.44%,平均
每叶产生的愈伤组织的重量为 434.45mg,呈绿色颗粒状;而叶柄的平均诱导率为 76.00%,平均每叶柄产生
的愈伤组织重量为 232.01mg,呈浅黄色透明状。从出愈时间、诱导率、愈伤组织的质量和重量四方面考察,
叶片是愈伤组织诱导的适宜外植体。
2.1.3 6-BA浓度对愈伤组织诱导的影响 从图 1和图 2可以看出,在不加 6-BA即只附加 2,4-D的培养
基上,两种外植体都能产
生愈伤组织,但是附加一
定浓度的 6-BA不仅能提
高两种外植体愈伤组织的
诱导率,还能促进愈伤组
织的生长。在所试浓度范
围内,随着 6-BA浓度的升
高两种外植体愈伤组织诱
导率和平均出愈重量先升
高后降低,6-BA浓度为 1.0mg/L时效果最好,叶片和叶柄愈伤组织诱导率分别为 96.25%和 80.00%,比最
差水平即 6-BA为 1.5mg/L时诱导率分别提高 6.25%和 6.67%;平均每外植体出愈重量是 561.91mg和
393.70mg,比最差水平即不加 6-BA时平均出愈重量分别增加了 107.98%和 223.71%,这说明虽然添加一定
浓度的 6-BA对两种外植体愈伤组织的诱导率影响不大,但对愈伤组织的生长非常有利。
图 1 6-BA浓度对愈伤组织诱导率的影响 图 2 6-BA浓度对愈伤组织重量的影响
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2.1.4 2,4-D浓度对愈伤组织诱导的影响(图3,图4) 随着2,4-D浓度的升高两种外植体愈伤组织诱导率和
出愈重量先增加后降低,
0.3mg/L的 2,4-D对愈伤组
织的诱导效果最好,叶片
和叶柄的愈伤组织诱导率
分别为 97.50%和 80.00%,
比最差水平分别提高了
8.50%和 10.74%;但当培
养 基 中 添 加 0.5mg/L的
2,4-D时,两种外植体产
生的愈伤组织最多,平均
每外植体出愈重量分别是 471.08mg和 292.78mg,比最差水平即加 0.1mg/L的 2,4-D时,平均出愈重量分
别增加了 23.76%和64.63%,总体来看,0.3mg/L～0.5mg/L2,4-D为诱导愈伤组织的合适浓度。
2.2 愈伤组织继代增殖
将初代培养的愈伤组织分别称重接种于附加有不同浓度的 2,4-D和 6-BA两种植物生长调节剂 MS
培养基上。培养 30d后统计愈伤组织鲜重与干重,结果见表 1。
图 3 2,4-D浓度对愈伤组织诱导率的影响 图 4 2,4-D浓度对愈伤组织重量的影响
表 1 不同培养基对叶片、叶柄愈伤组织增殖的影响
从表 1可以看出,不同的激素处理对两外植体愈伤组织增殖的影响不同,但总的来说两种来源的愈伤
组织表现出一样规律,增殖倍数和干重/鲜重比值两指标均随着 6-BA和 2,4-D浓度的升高先增大后降
低,其中 0.5mg/L的 6-BA和 0.3mg/L的 2,4-D是两种愈伤组织增殖的最佳激素浓度,即 6号处理最好。叶
片愈伤组织在此处理上增殖了 3.229倍,干重/鲜重的比值达到了 0.143,考察的两指标比最差处理上分别
提高了 74.55%和32.41%;叶柄愈伤组织在 6号处理上增殖了 3.419倍,干重/鲜重的比值为 0.148,比最差
处理上分别提高了 157.26%和55.79%。因此合适的激素浓度配比不仅有利于愈伤组织的生长,还促进了干
物质的积累。
3 讨论
植物愈伤组织的诱导主要受外植体本身、培养基和培养环境三大因素的调控。不同植物的器官和组
织,其形态发生能力大不相同,即使同种植物不同部分作外植体时,所需要的营养和植物激素的用量也不
相同,培养效果差异的原因可能是由于它们的生理状态和所处的生育时期不同,其内源激素浓度和比例不
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同[7]。在研究中,两种外植体产生愈伤组织的能力不同,叶片比叶柄愈伤诱导能力强,表现在叶片出愈时间
早,且产生的愈伤组织多、质量也好,这与许多植物的表现一样[8,9]。植物生长调节剂的种类对愈伤组织的
诱导具有十分复杂而重要的影响,本研究表明 IBA和 NAA两种生长素促使叶片和叶柄以器官型进行分
化,而 2,4-D使两种外植体以器官发生型进行分化。通常条件下,生长素和细胞分裂素对诱导和保持愈伤
组织的高速生长是必要的,尤其是当生长素和细胞分裂素配合使用时效果更好,在本实验中也同样证明了
这一点。但在只含有 2,4-D的培养基上,愈伤组织的诱导率较低,产生的量也较少,愈伤的增殖倍数低,并
且不利于干物质的积累。当和一定浓度的 6-BA一起使用时,愈伤组织的诱导率大大提高,产生的愈伤组
织较多且质量好,而且有利于愈伤组织的增殖和干物质的积累。
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