全 文 ：生物杖术通报
研 究报 告 刀爪口r E 曰阴以兀口 6 Y B UJ 比 E TI N 2 X为 年 增 刊
胁迫诱导型启动子 rd29 A 的克隆及其序列分析
段青 王博 刘禅 樊国盛 黄海泉
(西南林学院园林学院 ,昆明 65 02 24 )
摘 要: 采用 c T AB 法提取拟南芥(人月石d卿 山涵如:)叶片总 D N A ,设计并合成一对引物 ,通过 PC R 扩增得到一特异
片段 ,并连接至 pGE M 一 T Easy ve cto r上进行克隆测序 结果表明该片段全长为74 4 bP ,与报道序列(A Y 97 36 35 )存在三个碱基
的差异 , 同源性达 9 .6% ;且该片段含有 1 个 TA TA box (T AT A AA )1 个 C AA T box (G C c从 T )4 个干早 高盐和低温响应
o肛 (dehy如 tion resv onsive elem ent binding pro te in )顺式作用元件(核心序列为 C C G A e ),从而为后期胁迫诱导型植物表达载体
的构建及遗传转化莫定了基袖
关. 询 : 拟 南荞 rd2 9A 基 因克隆 序列分析
C lo城 n g an d S eq u en ee A n a ly si s o f th e s概 55一in d u ced
P ro m o ter rd 2 9 A
D uan Q ing W an g B o Li u C han Fan G uo sheng H uan g H 缸quan
(声板以仃of L翻ds e甲 e A rc h汤er , 肠以人叼est Fo 咫:叮肠之肠邵, K unm i咭 650224)
A bstra ot : G eno 而 e D N A was 150址ed fro m 乃月加d户P廊 山习盛公a by C TA B m eth od.A pr of speei6e prim eo w o desi, ed an d
syn th es is ed ac eo rdi ng to the re po 电 d sequ en ee o f the s S 一indu ced Promo te r rd2 9A in G enB an k . Th e P C R P ro du et w as arn plifi ed ,
li 乎 ted in to PG E M 一T E as y Ve etor an d sequ en eed . Th e re sul 匕 sh ow ed tha t th e sP ee近e 血脚 ent w as 744 bP : tha t th ere w ere three
di 玉 re nt bas es betw een th e sequ enee test ed in thi s PaPer an d th e one rePorted in G enB ank (AY 9736 35), w hose hom olo盯 in nueleotide
sequenees re ac hed 99.6% , 山at it eo咖 ned one T AT A bo x , one C AA T box an d fo ur D R E eis一ac tion eleme nts re sP ons ive to dro ugh t,
hi gh salt an d low te mP e枷 re ; w hi eh 加d th e fo unds don fo r th e fu tu re Part of i匕eonstru etion of Plan t exPre,sion veetor an d 罗netic
口, nsfo nl以匕O IL
K e y wo rd s : 乃月玩汰护s 叻 胡. rd2 9A G ene do ni 明 sequenee an 习 15
干早 高盐 低温等逆境胁迫是影响植物生长
发育的重要限制因子 1.21 据统计 , 目前全世界约
20% 的耕地受到盐害威胁 , 43% 的耕地为干早 半
干早地区 ,而我国有近 1.7 亿人口受到土地过度盐
碱化和荒摸化的威胁 13 因此 ,提高植物抗早能力
已经成为现代植物育种工作急需解决的关键问题
之一 特别是近年来随着现代分子生物学技术的飞
速发展 , 许多受逆境胁迫的基因被相继鉴定与克
隆 ,如 m tlD PS C S 比A H V A I CBF I D RE B IA 等141
本研究拟通过分离克隆胁迫诱导型启动子
司29A ,并对其结构进行分析 ,为下一步植物表达载
体的构建 , 以及选择适宜的花卉进行遗传转化 ,培
育综合抗性强 优质 高产的转基因花卉新品系奠
定基础
1 材料与方法
1.1 材料
拟南芥哥伦 比亚 型 (A汕 id叩515 叻习ia n L. ,
Co lu mb ia ec otype ) 由云南师范大学杨红玉教授提
供 大肠杆菌受体菌株 E .Col i.D H 5a 由本实验室保
存 EX Taq D N A Po lym eras e D N ^ M aker D皿侧购
收稿 日期:2以刃一03 一20
基金项 目:云南省自然科学基金项 目(Zo 7C Z1 3M ),西南林学院校重点项 目(2仪旧肠Z )
作者简介:段青(19 84 一),女.硕士研究生 ,研究方向:园林植物遗传育种 ;E-. u:du an qi ng 123 @ 12 6. o m
通讯作者:黄海泉 ,男 ,博士 ,主要从事园林植物基因工程和遗传育种研究工作;E一耐 l:hai qu 耐 @ 163 .co m
2 8 8 生物杖术通报 B to te ehnolo盯 2(X卫) 年 增 刊
自大连宝生物工程有限公司 ; dNTP M ix D N A 片段
胶 回收试 剂盒 pG E M T 一 Eas}l V eetor T4 D N A 连接
酶均购自Pro m ega ; 质粒小量提取试剂盒购 自云科
生物 工程 公 司;l 盯G X 一G al 以及其它常规试剂 均
为国产分析纯 ,购自北京鼎国生物技术有限公司
1.2 方 法
1.2.1 拟南芥叶片总 D N A 的提取 采用 CTA B 法
提取拟南芥叶片总 D NA 囚
1.2.2 PC R 扩 增 根据 G enBank 中报道的序列161,
设计一对引物 , 由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成 ,引物序列为 :
上游引物 Pr d29A I:5 一GC ,A G C竹 C( 二A( 汀CA A A A
C A A A C I, r A C G 一 3
下 游 引物 Prd 29A Z :5 一G CG G ATC C A T A C A G A G A
C T G A G A G A G A T 一 3
以拟南芥总 DN A 为模板 , 以 Prd 29A I 和 Prd
29A 2 为引物进行 PC R 扩增反应 , 其反应体系:模
板 n NA 1.0林l 10xTa q D N A 即lym erase Bufe r (M 扩
Plus)2.5林l EX Ta q D N A 即lym erase (SU/林l) 0.5林l
dN TPs(IOm M ) 0.5卜l Prd29A I (10m M )1.0林l Prd 29A
2 (10m M ) 1.0林l ddH ZO 18.5林l,总体积 25卜l 反应条
件 :预变性 95 s m in ;循环参数为 95 45 5 , 56
45 5 , 72 1m in30s , 2 9 循环 ;72弋 10m in : 电泳 照
相并切下目的条带回收 ,于一20 保存备用
1.2. 3 克隆一与测序 回收后 PCR 产物与 pG EM 一T
Easy V eetor 进 行连接 ,并转化 E.Co li.D H 5a 感受态
细胞 ,随机挑取 3 个自色菌落 (同时挑取蓝色菌落
为对照 ),进行重组子的鉴定
(l) PC R 扩增鉴定 :以菌液为模板进行 PCR 扩增鉴
定 其反应体系及条件同 1.2.2
(2 ) 重组质粒的酶切鉴定 :采用碱法提取质粒 D N A
l7. },进行酶切鉴定分析
经上述鉴定均呈阳性的克隆菌落送交上海生
工生物工程技术服务有限公司进行测序 ,测序结果
用 D N A siS 软件进行序列分析
2 结果与分析
2 .1 P C R 产物鉴定
PC R 产物经凝胶 电泳后发 现该片断约 75 0 bp
左 右 , 与 预计 的结果 相符 (图 l) 经 回收后 与
pG EM 一 r Easy veeror 连接 , 并转化 E .O Ii.D H 5a 感
受态细胞 ,经 PCR 检测呈阳性 (图 2 ) ,进一步验证 ,
将其经 Hi nd l 和 Bam H I 双酶切后能切下约 750
bp 的 目的片段 , 说明该 目的片段 已成功插入
p G E M 一 T E asy V ec to r
图 , 启动子 rd29A 基因的克隆
图 2 皿组子菌落 rd 29A 基因的 PC R 检侧
图 3 宜组质粒 prd2 9A 经 州们d l + Ba m H I 酶切分析
2 (X 沟 年 增 刊 段青等 :胁迫诱导型启动子记29 A 的克隆及其序列分析 289
2. 2 序列浏定及分析
测序结果与 Ge nBank 报道序列 (A Y 973635 )的
比对结果如下(图 4 )
A 丫 973 63 5 CGA CTCA人冉A C冉泊A CTTACGAAA们门 A GGnAGAA C们认TATACATr, 口A Tt
cGA cTc~ c~ ~ c~ GGTA GA ~ c~ IT
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7 56护
科礴护
圈 4 本实脸竟隆的吐四A 启动子核普酸序列与报道序列 A丫973 丈巧 的比较
经测序后发现该片段全长为 74 如 , 与报道序列
(A Y 97 36 35 )仅存在三个碱基的差异(分别为第 51
位 G 缺失 第 197 位 G * A 第 20 5 位 A * C ) ,同源
性达 9 .6% 经分析后发现该片段含有该启动子所
必需的几个调控元件 , 如在第 367 ~372 如 之间有
一个 TA TA box (TATA AA A) ;在第 48 9一494 帅 之间
有一个 CA AT box (G cc AAT );在第 5以一50 8 帅 第
552一560 坤 第 创为一617 bP 第 64 8一652 bP 处各有
一个千早 高盐和低温响应 D RE 顺式作用元件 ,是
D R EB 转录因子结合的保守序列 , D RE 核心序列为
G CCG A CIA CCG A CIT A CCG A CA T , 它是 目的基因在
植物受胁迫时诱导表达或被反义抑制所必需的元
件
3 讨论
克隆的 rd2 9A 基因全长为 7科 bP ,而且几次测
序结果完全一致 , 与报道序列的同源性达9 .6 % ,
经 DN A ai 软件分析发现 , 该片段含有 1 个 TA TA
场x 1 个 CAA T bo x 和 4 个干早 高盐和低温响应
D RE 顺式作用元件 , 已具备该启动子所有的必需
调控元件 ,推测其功能与报道序列是一致的 ,从而
为后期胁迫诱导型植物表达载体构建及遗传转化
研究莫定了墓础
外源基因在导人到植物体后 ,其表达受诸多因
素的影响 ,尤其是启动子在决定基因表达方面具有
决定性的作用 目前大部分转基因研究主要采用花
椰菜花叶病毒(CaM V) 的 35 启动子 , 由于该启动子
属于组成型表达启动子 ,致使 目的基因在植物所发
育的任何阶段以及任何组织器官中均会表达 ,其对
转基因植物来说容易产生不利的一面 ,造成内部资
源浪费 ,同时还容易造成植物生长缓慢 植株变小
产量下降等不 良农艺性状 而胁迫诱导型启动子
rd2 9A 启动子只有在受到逆境胁迫 ,如干早 高盐
低温时才驱动目的基因表达 ,一则不会造成植物内
部资源浪费 ,二则不致于由于目的基因过量表达给
植物带来的一些不利影响
, 考文献
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