全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-09-02
基金项目：内蒙古自然科学基金项目（200208020307）
作者简介：张立全（1978-），男，内蒙古锡盟人，实验师，在读博士生，研究方向：植物分子生物学及基因工程；E-mail：zhangliquan430@eyou.com
肝脏是哺乳动物机体内少有的具强大再生能
力的器官之一，肝再生增强因子 （augmenter of liver
regeneration，ALR） 是一种特殊的促肝细胞分裂原，
在肝损伤修复过程中起重要作用。 因此，利用生物
反应器生产人肝再生增强因子（hALR）用于肝病的
治疗具有重要的研究意义。例如，Hagiya 等 [1]首次报
道克隆了鼠 ALR；杨晓明等 [2]首次获得了 hALR cDNA
克隆，全长 1.5 kb，含有 3 个外显子和 2 个内含子，
编码 125 个氨基酸残基蛋白质， 与鼠 ALR 编码序
列有 87%的同源性， 且 hALR mRNA 在胎儿肝脏、
肾脏和睾丸中的表达丰度较高 [2，3]。 Polimeno 等 [4]发
现 ALR 可诱导大鼠肝中线粒体基因的表达， 并增
强肝脏线粒体的氧化磷酸化能力；Thasler 等 [5]研究
表明 hALR 对肝硬化和肝癌发生的肝细胞再生有
重要作用。
花粉管通道法 （pollen tube pathway）是由我国
周光宇教授在对远缘杂交分析的基础上正式创立
的，并被广泛应用。 目前，花粉管通道法已在水稻 [6]，
河套蜜瓜花粉管通道法转化 hALR基因
张立全 哈斯阿古拉 扈廷茂 刘明秋
（内蒙古大学生命科学学院生物工程中心 内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，呼和浩特 010021）
摘 要： 为利用河套蜜瓜为生物反应器生产可用于治疗肝病的蛋白因子，以人胎肝 mRNA为模板，经 RT-PCR
扩增获得了 471 bp cDNA片段。克隆到 pMD18-T 载体，命名为 pMD-ALR，测序分析结果与 GenBank中报道的 hALR
编码序列完全相同。酶切回收 hALR 片段，插入到含有甜瓜果实黄瓜素（Cucumisin）基因启动子的果实特异性表达载体
pPZP-CGN 中，构建了 hALR 甜瓜果实特异性表达载体 pPZP-CAN。花粉管通道法转化试验大田自花授粉花 63朵，收获
T0代果实 27颗，结实率为 42.9%。提取 T0代种子无菌苗 DNA，经 PCR、PCR -southern和斑点杂交检测有 13株呈阳性。
关键词： 人肝再生增强因子 果实特异性 花粉管通道法 河套蜜瓜
Transforming hALR Gene into Cucumis melo L. cv Hetao via
Pollen-tube Pathway
Zhang Liquan Hasi Agula Hu Tingmao Liu Mingqiu
（Biotechnology Center，College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Inner Mongolia Key Laboratory of Herbage &
Endemic Crop Biotechnology，Huhhot 010021）
Abstract： In order to use Cucumis melo L. cv Hetao as a bioreactor for production of human augmenter of liver
regeneration（hALR） protein，471 bp cDNA hALR was amplified from the human fetal liver mRNA by RT-PCR with
two artificially synthesized primers，then ligated into vector pMD18-T to construct pMD-ALR. The sequence analysis of
pMD-ALR showed that the sequence was completely identical with that of hALR cDNA in GenBank. The fruit-specific
expression vector pPZP-CAN was constructed by inserting hALR which was obtained from pMD-ALR by HindⅢ and
SacⅠ restrictive digesting，into plant expression vector pPZP-CGN which contains Cucumis melo L. cv cucumisin gene
promoter. 63 hand-pollinating flowers were obtained via pollen-tube pathway transformation method in testing-farm，by
which 27 fruits were achieved with 42.9 percentage of fruit-set. The DNA from T0 seedings were analyzed by PCR，
PCR -southern and Dot boltting analysis and 13 positive were obtained.
Key words： hALR Fruit-specific Pollen-tube pathway Cucumis melo L. cv Hetao
2009年第 3期
小麦 [7，8]，玉米 [9，10]，棉花 [11~16]，烟草 [17]，大豆 [18~20]，马铃
薯 [21]和甜瓜 [22，23]等多种作物上获得了转基因植株 ，
并取得了一些重要的成果。 同时 ，Peffey 报道了花
粉管通道法转基因洋葱的研究，并在美国申请了专
利（US6583335B1）。
甜瓜（Cucumis melo L.）是世界上广泛种植的作
物，主栽于内蒙古河套地区巴彦淖尔市的河套蜜瓜
（cucumis melo L. cv Hetao） 是其独特品种之一。 本
研究构建了 hALR 果实特异性表达载体，并通过花
粉管通道法将其导入河套蜜瓜 ， 成功获得了转化
hALR 的转基因种子， 为以河套蜜瓜为生物反应器
生产可用于治疗肝病的蛋白因子奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
人肝组织； 河套蜜瓜原种； 大肠杆菌（E.coli）
DH5α、质粒 pPZP-CGN （含 Cucumisin 启动子/GUS/
NOS 终止子 ） 为本实验室保存 ；SuperScriptTM first-
Strand Synthesis System for RT-PCR 购于 GIBCO 公
司。
1.2 hALR cDNA 的克隆
提取人肝组织总 RNA，用 SuperScriptTM first Str-
and Synthesis System for RT-PCR 进 行 合 成 hALR
cDNA 第 1 条链。 根据 GenBank 中报道的 hALR m-
RNA 全长序列设计一对引物，P1：5′-GAC CTC CGA
TTC TCC TGT-3′ ，P2：5′ -CTC TGG CTG ACC ACC
CTC T-3′，以获得的单链 cDNA 为模板进行扩增反
应 。 PCR 扩增条件 ：94℃预变性 5 min；94℃变性
1 min，60℃退火 1 min，72℃延伸 45 s，35 个循环 ；
72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物与 pMD18-T 质粒载
体连接、转化、质粒提取参照分子克隆 [24]进行。 鉴定
阳性克隆命名为 pMD-ALR， 委托上海生工生物工
程公司测序分析。
1.3 果实特异性表达载体的构建
HindⅢ酶切 pMD-ALR 质粒后参照上海生物工
程公司回收试剂盒说明书进行回收 ， 两端经 T4
DNA ploymerase 补平后 SacⅠ酶切回收 hALR 片
段， 与经 SacⅠ与 SmaⅠ双酶切 pPZP-CGN 后回收
的大片段连接，转化感受态 E.coli DH5α，挑取壮观
霉素 （Spe）抗性菌落 ，BamHI 鉴定阳性质粒命名为
pPZP-CAN。
1.4 花粉管通道法转化
2006 年 6~8 月份在内蒙古自治区巴彦淖尔市
实验田进行花粉管通道发转化试验。转化方法依照
哈斯阿古拉等 [23]报道的方法进行。 在授粉后 7 h 切
去柱头上端 1/3 部分，立即滴加溶于 0.1×SSC 中的
pPZP-CAN （0.3 μg/μl）质粒 DNA 溶液 10 μl，并迅
速套纸帽隔离 。 以导入 0.1×SSC 溶液作为阴性对
照。 约 40 d 后，在果实成熟期统计结果率，采摘成
熟果实，收集种子，记为 T0 代。
1.5 PCR 检测
取 T0 代种子， 消毒去壳后种在 1/2MS 固体培
养基中， 置于人工气候养箱内 16 h 光照/8 h 黑暗，
27±1℃培养待真叶长至 3~5 片时，黑暗条件下处理
72 h 摘集真叶 ，SDS-酚法提取总 DNA。 以总 DNA
为模板进行 PCR 检测。
1.6 PCR-Southern 及 Dot blotting 检测
将 PCR 扩增产物及 PCR 检测阳性植株总 DNA
20 μg 分别转移至尼龙膜上 ，α-32P-dCTP 缺口平移
法标记 hALR cDNA 探针， 进行 PCR-Southern 及斑
点杂交检测。 杂交依照 BioDev-Tech 公司杂交试剂
盒进行，-80℃曝光 2 d。
2 结果与分析
2.1 hALR cDNA 的克隆
RT-PCR 获得的 DNA 片段 （图 1），克隆到 pM-
D18-T 载体 ，PstⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定 （图 2）后测序
分析，确定获得了 471 bp hALR ORF，并与 GenBank
中报道完全一致。
M.DNA MarkerⅠ；1.PCR 扩增片段；2.阴性对照
图 1 hALR PCR 产物
M: λDNA/ HindⅢ Marker;1.阳性对照 （cDNA 为模版 ）；2.
PstⅠand EcoRⅠ消化；3.PstⅠ消化；4.pMD-ALR 质粒
图 2 pMD-ALR 酶切分析
张立全等：河套蜜瓜花粉管通道法转化 hALR基因
471 bp
M 1 2
M 1 2 3 4
71
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
2.2 表达载体 pPZP-CAN 的检测
挑取壮观霉素（Spe）抗性 E.coli DH5α 菌落，提
取质粒， 经 PCR 筛选后 ，BamHⅠ酶鉴定结果显示
与预期相符。 从而证明 hALR cDNA 按照预期设想
正确插入到含有果实特异性启动子的下游，成功构
建了 hALR cDNA 果实特异性表达载体（图 3）。
2.3 PCR 检测
导入 63 朵人工授粉花， 获得了 27 颗果实，结
果率为 42.9%。 种植 T0 代种子，提取了 273 个无菌
苗真叶 DNA 进行 PCR 检测，阳性率为 28%。 点样
PCR 产物在尼龙膜上进行 PCR-Southern 检测（图 4），
说明 PCR 反应是真实的。
2.4 Dot blotting 分析
取 16 株 PCR 阳性植株总 DNA 进行斑点杂交
检测（图 5），同时以未转基因植株 DNA 和 pPZP-CAN
为阴性对照。 结果显示，A-5、A-6、B-1 对应的转化
种子为阴性，说明此 3 株 PCR 检测出现假阳性，其
余均为阳性转化种子。进一步表明外源基因已成功
整合到植物基因中，并得了 T0 代转化种子。
3 讨论
人肝再生增强因子（hALR）是一种重要的肝增
殖刺激因子， 对肝损伤后修复和再生起重要作用。
且具有以下调控作用，包括抑制线粒体转录因子 A
的表达，调控干扰素 γ 的表达水平来减少 NK 细胞
的活性 [25，26]，调节离子平衡的作用 [27]，同时还具有巯
基氧化酶活性 [28]。 研究表明，ALR 是通过与免疫因
子和生长因子的双重机制来刺激增加肝线粒体的
细胞色素含量和氧化磷酸化的能力，进而影响肝的
再生过程 。 另外 ，ALR 还可以通过降低细胞色素
P450（CYP）异构酶活性来调节肝的代谢 [29]。 hALR
对肝再生的增强和肝病的逆转作用已被人们认可
并得到了充分的证实，因此开发 hALR 蛋白药物倍
受科学家的关注。
通常的植物转基因方法有农杆菌介导法、电穿
孔法和显微注射法，这些方法要求被试植物具有高
效的组织培养再生能力，但是有些植物（例如甜瓜）
的再生体系还没有达到基因转化的要求，因而限制
了以上转基因方法的使用。花粉管通道法适用于所
有开花植物，是一种不依赖于植物细胞和组织培养
的转化体系 ，不受被试植物基因型限制，转化效率
高，具有遗传工程和传统育种相结合的优势。 虽然
在分子水平上证实花粉管通道法遗传转化的相关
报道还很少，但它仍是人们更可取的转化手段。
影响花粉管通道法转化率的因素很多，如转化
时间、DNA 浓度、质粒大小、转化时的温度和湿度，
且相关研究表明， 授粉后导入的时间是主要因素。
本研究在授粉后 7 h 转化 ，PCR、PCR-Southern 和
Dolt bolting 检测显示转化阳性率约为 28%。 说明已
成功获得了转基因 T0 代种子， 为进一步以河套蜜
瓜作为生物反应器生产 hRLA 蛋白药物的研究提
供了种质资源。
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图 3 pPZP-CAN 载体结构图
1.EcoRⅠ消化 pPZP-CAN 为阳性对照 ；2.pPZP-CAN PCR 产
物为阳性对照；3.未转基因植株；4~10.供试植株
图 4 PCR-Southern 分析
A-1.pPZP-CAN 质粒 DNA；A-2.未转化植株；其他为供试植株
图 5 Dot blotting 分析
HindⅢ
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
72
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