全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
北极海泥菌群的分离鉴定及生物学特性的初步研究
刘军 张帅帅 杨娜 杜宗军
(山东大学威海分校海洋学院,威海 264209)
摘 要: 对从北极冰川海面下 1 500- 4 000 m处的海泥样品中分离的 8株冷适应细菌进行了生理特征和分子生物学研
究。其中 5株嗜冷菌、3株耐冷菌, 利用 16S rDNA通用引物对 5株嗜冷菌基因组 DNA进行扩增, 测序得到其部分 16S rDNA
序列。经 B last调出与菌株 16S rDNA同源的序列, 按照 Ne ighborJoining方法构建 16S rDNA系统发育树。对 8株细菌进行酶
检测试验, 结果表明其中有部分细菌产低温酶: N014产淀粉酶, R151产明胶酶, P371产纤维素酶。研究结果为进一步开发利
用冷适应微生物产物提供参考依据。
关键词: 嗜冷菌 耐冷菌 16S rDNA 低温酶
Isolation, Identification and Physiology ofMarine Bacteria
from MarineMud of the North Pole
L iu Jun Zhang Shua ishuai YangNa Du Zong jun
(College of M arine Science, Shandong University atW eihai, W eihai 264209)
Abstrac:t E ight co ldadaptation bacte ria stra ins iso lated from the m arine mud sam ples wh ich we re located 1 500 - 4 000 m etres
be low the sea leve l o f theNo rth Po le g lac ierw ere selected to study the ir physiolog ica l and mo lecu lar bio logy character istics. Among the
eight bacter ia stra ins, five stra ins are psychrophiles, and the o thers are psychrotrophs. The 16S rDNA sequence o f the five psychrophiles
w ere am plified w ith un iversa l prim er, and part of their 16S rDNA sequences we re obta ined by sequenc ing. The sequences wh ich w ere
hom o logues to the five ones w ere redeployed by blasting. 16S rDNA phy logenetic dendrogram w ere bu ilt according to the w ay o fN eigh
borJo in ing by so ftw areM EGA 4 0. The resu lts o f the bacter ia, s enzym e detection show ed that part of the bacter ia cou ld produce cold
active enzym e, inc luding N014 wh ich cou ld produce am y lase, R151 that cou ld produce ge latinase, and P371 that could produce ce llu
lase. Th is work prov ides reference fo r further deve lopm ent and use o f co ldadaptation m icrob io log ical product.
Key words: Psychrophiles Psychrotrophs 16S rDNA Co ldactive enzym e
收稿日期: 20091012
基金项目:国家科技基础条件平台工作项目 ( 2005DKA21209 )
作者简介:刘军,男,专业方向:生物技术; Em ai:l liu jun sdu@ 163 com
通讯作者:杜宗军,理学博士,主要研究方向:海洋细菌分类鉴定; Em ai:l duzongjun@ sdu edu cn
地球上冷适应微生物的资源丰富,近年来欧美
及日本的科研人员对极地微生物的潜在应用性方
面,尤其低温酶的理化性质、适冷机制及其应用研究
作了大量的工作,取得了较大的进展,而国内对此方
向的研究进展较为缓慢 [ 1]。应用低温微生物具有
以下优势:有利于防止微生物污染,尤其是在连续运
转系统中同源的中温酶不活泼;经过温和的热处理
即可使低温酶的活力丧失, 而且低温或适温处理不
会影响产品的品质 [ 2]。对北极海泥菌群的初步鉴
定及研究,以期为国内冷适应微生物资源开发利用
提供部分参考。
1 材料与方法
11 供试海泥的获得
采集自北极海域的海洋沉积物样品, 由中国极
地研究中心惠赠: B12 ( 2024 m )、N01 ( 3 333 m )、
P23 ( 2 028m )、R15 ( 1 732 m )、P37 ( 2 216m )。
12 菌体的分离
2216E海洋细菌培养基:蛋白胨 5 g、酵母粉 1 g、
柠檬酸铁 01 g、琼脂 18 g、陈海水 1 000mL、pH8。将
5个海泥样品稀释后涂布在 2216E培养基上, 4 倒
2010年第 1期 刘军等:北极海泥菌群的分离鉴定及生物学特性的初步研究
置培养 7 d左右挑取形态不同的单菌落,在 2216E培
养基上纯化后得到 8株菌,保种转入 - 80 保存。
13 细菌鉴定
131 形态观察和生理生化试验 [ 3] 菌株的生理
生化特征根据伯杰氏细菌鉴定手册进行。
132 温度生长试验 将 8株菌接入 2216E培养
基分别放到 4 、15 、28 培养箱培养 10 d左右,
观察生长状况 (表 1)。
表 1 8株细菌的温度生长试验
N011 N 013 N014 P231 R151 R152 P371 P372
4 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
15 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
28 + - - - - - + + + + +
注: + 生长; - 不生长
冷适应微生物根据其生长温度特性可细分为两
类,一类是必须生活在低温条件下且其最高生长温
度不超过 20 、最适生长温度在巧 15 、在 0 可生
长繁殖的微生物称嗜冷菌;另一类其最高生长温度高
于 20 、最适温度高于 15 、在 0- 5 可生长繁殖的
微生物称为耐冷菌。根据此为判断依据: N011、P371、
P372为耐冷菌, P231、R151、R152、N013、N014为嗜
冷菌 [ 4]。
134 基因组 DNA的提取和 16S rDNA系统发育
分析 提取细菌染色体 DNA[ 5, 6] , 菌株 16S rDNA序
列 PCR扩增参照文献 [ 7, 8]进行。扩增 16S rDNA的
正向引物为 27F: 5!AGAGTTTGATC ( C /A ) TGGCT
CAG3!(对应于 E. coil 16S rDNA序列的第 8- 27个
碱基位置 ), 反向引物 1492R: 5!TACGG ( C /T ) TAC
CTTGTTACGACTT3!(对应于 E. coli 16S rDNA的第
1 492- 1 510个碱基位置 )。
100 L 的 PCR 反应体系: 1 ∀ PCR缓冲液,
15mmol /LM gC12, 4 ∀ dNTP混合物各 200 mo l/L,引
物各 05 mo l/L, Taq DNA聚合酶 1 L( 5 U /L), 2
L DNA原液。 PCR反应条件: 96 预变性 6 m in;
94 变性 1m in, 50 复性 lm in, 72 延伸 2m in, 30个
循环;最后 72 温育 6m in。PCR扩增产物经电泳检
测后, 直接交由上海生工生物工程技术公司进行纯
化和序列测定。将测定的基因序列输入 GenBank,
获得收录号。并运用 B last程序与数据库中已存在
的细菌 16S rDNA核酸序列进行相似性比较分析。
序列的比较采用 MEGA ( 40)软件, 用 Ne ighbor
Jo in ing法得到系统进化发育树。
2 结果与分析
21 生理生化试验结果
生理生化试验结果表明, 细菌生活在高盐高辐
射的南极,其耐盐的能力强, 并且有多株细菌产低温
酶类: N014产淀粉酶, R151产明胶酶, P371产纤维
素酶 (表 2)。
22 序列分析
5株嗜冷菌经 PCR测序分别获得部分序列:
P231( 910 bp)、R151( 888 bp)、R152( 909 bp)、N013
( 893 bp)、N014( 896 bp)。通过与 GenBank核酸序
列库中的序列进行局部同源性比较 ( BLAST ), 结果
表明, P231与 Colw ellia rossensis的 16S rDNA序列有
较高的同源性, 其中与 Colw ellia sp. EM 0379有
988%的同源性; R151与 P sychrobacter frigidicola的
16S rDNA序列有较高的同源性,其中与 P sychrobacter
celler stra in 23有 989% 的同源性; R152与 Mari
nobacter guineae的 16S rDNA序列有较高的同源性,
其中与Marinobacter sp. BSi20018有 992%的同源性;
N013与 P ibocella ponti的 16S rDNA序列有较高的同
源性,其中与P ibocella sp. MOLA 312有 997%的同源
性; N014与 Marinobacter segnicrescens的 16S rDNA序
列有较高的同源性,其中与 Marinobacter sp. ANT8277
有 992%的同源性。
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表 2 生理生化试验结果
N011 N013 N014 P231 R151 R152 P371 P372
菌落颜色 乳白色 橙色 白色 灰色 透明 乳白色 黄色 透明
细胞形态 杆状 杆状 杆状 杆状 杆状 杆状 杆状 杆状
革兰氏染色 G- G- G - G - G- G- G - G -
5% Nacl + + + + + + + +
7% Nacl + - + + - + - +
是否产色素 - + - - - - + -
氧化酶 + - + + - + - +
过氧化氢酶 + + + + + _ + +
藻胶酶 - - - - - - - -
淀粉酶 - - + - - - - -
明胶酶 - - - - + - - -
脂酶 - - - - - - - -
纤维素酶 - - - - - - + -
注: + :阳性反应, - :阴性反应
一般认为, 16S rDNA序列同源性大于 99% ,可
以认为属于同一个种; 16S rDNA序列同源性小于
98%,可以认为属于不同的种;同源性小于 95% ,可
以认为属于不同的属 [ 8]。通过构建五株嗜冷菌的
进化树可以确定 P231属于科尔维尔氏菌属 ( Col
w ellia) (图 1)、R151属于嗜冷杆菌属 (P sychrobact
er ) (图 2)、R152属于海杆菌属 (Marinobacter ) (图
3)、N 013属于极地杆菌属 ( P ibocella ) (图 4)、N014
属于海杆菌属 (Marinobacter ) (图 5)。
图 1 P231基于 16S rDNA序列构建的系统进化树
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3 讨论
冷适应细菌由于生活环境的特殊 低温高盐,所
产酶在较低温度时具有较高的活性, 由于反应温度
较低, 不但在低温条件下可以高效反应,而且在生产
工艺中可以通过较低温度的热处理使酶失活, 节约
能量与费用,成为人们研究开发的热点 [ 9, 10 ]。近年
来对于低温酶结构方面的研究普遍认为低温酶的结
构柔韧性强和分子表面的离子对含量少是其能在低
温维持高活性的主要原因 [ 1]。
淀粉酶在食品、医药、洗涤、造纸、纺织方面有着
非常广泛的应用前景,酶在较低温度具有较高活性,
具有开发的现实意义 [ 11 ]。明胶酶在肿瘤抑制、脱色
工艺上有着良好作用 [ 12, 13] , 纤维素酶在食品、洗涤
方面的应用广泛且其结构、性质得到了较为深入的
研究 [ 14, 15 ]。
以上的初步研究结果均表明这 3株产酶菌具有
进一步研究的价值,可以对其产酶条件及活性、酶的
结构等进行深入研究。随着低温酶类在生产应用中
的发展,冷适应微生物在生物技术及生命科学研究
中的地位将会越来越重要。
参 考 文 献
[ 1] 林学政,侯旭光,李光友.南极微生物低温酶的研究进展.海洋科
学, 2002, 26 ( 10) : 3842.
[ 2] Sm als AO, LeirosHK, OsV, W il lassen NP, et a1. Cold adapted en
zym es. B iotechnology Annual Review, 2000, 6: 157.
[ 3 ] 布坎南 RE,吉本斯 NE.伯杰细菌鉴定手册 (第 8版 ) [M ] .北京:
科学出版社, 1984, 450495.
[ 4] 辛明秀,马延和.嗜冷菌和耐冷菌.微生物学通报, 1999, 26 ( 2 ):
140
2010年第 1期 刘军等:北极海泥菌群的分离鉴定及生物学特性的初步研究
155, 109.
[ 5] Kuw ah ara T, Norim atsu L, Nakayama H, et a1. Gen et ic variat ion in
16S- 23S rDNA in tern al tran scribed spacer regions and the poss ib le
u se of th is gen et ic variation for m olecu lar d iagnosis of B acteroid es
species. M icrob iol hnnumo,l 2001, 45 ( 3) : 191.
[ 6] L ee YK, K im HW, L iu CL, et a.l A s imp le m ethod for DNA extrac
tion from m arine bacteria that produ ce extracellu lar. J M icrob iol
M ethods, 2003, 52( 2) : 245250.
[ 7] 雷敬超, 李传浩,黄惠琴,等. 杀线虫海洋放线菌的筛选及菌株
HA07011的鉴定.生物技术通报, 2007( 6 ): 146149.
[ 8] 杜宗军,赵苑,李美菊,等.青岛近海琼胶降解细菌的筛选和多样性
分析.中国海洋大学学报 (自然科学版 ) , 2007, 37 ( 2) : 277282.
[ 9] H ou YH, W ang TH, Long H, et a.l Novel co ldadap tive P enici llium
strain FS010 secreting therm o lab ile xylanaseiso lated from yellow
sea. A cta B ioch im ica et B iophys ica S in ica, 2006, 38( 2 ): 142149.
[ 10] Feller G, N arinx E, A rp igny JL, et a1. Enzym es from psych roph ilic
organ ism s. FEM SM icrob iology Review s, 1996, 18 ( 23) : 189202.
[ 11] 王淑军,刘红飞,李华钟,等.海洋细菌 pseudoal teromona s sp. G23
产低温淀粉酶发酵条件的研究.中国酿造, 2008( 23): 912.
[ 12 ] 杨明 ,侯敢 , 黄迪南. 明胶酶与恶性肿瘤. 现代肿瘤医学,
2008, 16( 1 ) : 130133.
[ 13] 瞿应良,王孝英,刘汉灵.明胶酶解液脱色工艺研究. 粮油食品
科, 2007, 15 ( 4) : 3335.
[ 14] 张明霞,段长青,张文娜.纤维素酶在食品工业中的应用与展
望.酿酒科技, 2005, 130 ( 4) : 99105.
[ 15] 刘刚,余少文,孔舒,等.碱性纤维素酶及其应用的研究进展生
物加工过程, 2005, 3 ( 2) : 914.
141