全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
毛竹 1, 4糖苷酶基因 cDNA克隆与表达分析
吴林森 1 金晓春 1 杨勇春 1 黄海松 1 陈世通2 姚伟峰 3 姚丰平 4
( 1丽水职业技术学院,丽水 323000; 2丽水市林业局,丽水 323000; 3德清县林业局,德清 313200; 4庆元县林业局,庆元 323800 )
摘 要: 根据水稻 1, 4糖苷酶 ( korrigan)基因的保守区序列设计引物,以毛竹 cDNA为模板,采用 PCR方法,成功扩增
出 1个含有完整阅读框架的 cDNA序列, 长度为 2 191 bp,共编码 617个氨基酸,将其命名为 PeKOR基因。其氨基酸序列分析
的结果表明, P eKOR与其他 1, 4糖苷酶有较高的同源性,同水稻序列相似性高达 91% , 且其序列具有典型的 Glycosy l hydro
lase 9 super fam ily结构域, 推测此 PeKOR为毛竹 1, 4糖苷酶基因。在竹笋中采用半定量方法研究该基因的表达情况, 结果
表明该基因在高温条件下表达量较低温条件下明显升高。
关键词: 毛竹 1, 4糖苷酶 克隆 表达分析
收稿日期: 20091130
作者简介:吴林森,男,副教授,研究方向:森林培育技术; Em ai:l w lsqy6629@ 163. com
cDNA Cloning and Expression Analysis ofPhyllostachys
edulis Beta1, 4G lycosidase Gene
Wu L insen
1
Jin X iaochun
1
Yang Yongchun
1
HuangH aisong
1
Chen Shitong
2
YaoW eifeng
3
Yao Fengping
4
(
1
L ishui Vocational T echnological Co llege, L ishui 323000;
2
Forestry Bureau of LishuiC ity, Lishui 323000;
3
Forestry Bureau of D eqing, D eqing 313200;
4
Forestry Bureau of Q ingyuan, Q ingyuan 323800)
Abstrac:t A beta1, 4g lyco sidase pro tein gene from phy llostachy s edu lis, nam ed as PeKOR, w as c loned through PCR using prim
e rs designed acco rd ing to the be ta1, 4g lycosidase pro tein genes conserved reg ion of other plan t. The coding reg ion of the genom ic c lone
o f PeKOR is continuous. The cDNA o f PeKORcon tains an open read ing fram e o f 2 191 bp and codes fo r a pro te in o f 617 aa. The data
base sea rch using the am ino ac id sequence as que ry showed h igh homo logy to severa l beta1, 4g lyco sidase pro teins, espec ia lly the Pe
KOR sequence show ed them ax im um hom o logy( 91% iden tity) toOry za sativa subspec ies beta1, 4g lyco sidase prote in gene), and it has
a typica lly conserved dom a in o fG ly cosy l hydro lase 9 supe r fam ily. Thereforew e pred icted that the PeKOR cou ld be an beta1, 4g lycos i
dase gene in bamboo. The resu lt of sem iquantitative RTPCR in bamboo shoo ts showed that express ion o f PeKOR gene w as regu lated by
tem pera ture, and the expression leve l on h igh temperature is larg er than the one on low tem pe rature.
Key words: P hy llostachy s pubescens Be ta1, 4 g lycosidase pro te in C lon ing Expression ana lys is
毛竹 (Phy llostachys pubescens)属禾本科竹亚科
刚竹属,耐瘠薄, 较抗寒, 是我国竹类植物中分布范
围最广、栽培面积最大、蓄积量最多、经济价值最高
的一个材用和笋用竹种, 在我国林业生产中占有非
常重要的地位。而毛竹的竹材和竹笋的形成与毛竹
纤维的多少密切相关, 因此研究与毛竹纤维合成相
关的基因,具有很重要的意义。毛竹笋以其特有的
粗纤维、丰富的微量元素以及多种维生素和氨基酸,
无污染的生长环境等被公认为是最佳的绿色食
品 [ 1] , 经济价值高 [ 2] , 但是鲜嫩竹笋采后在常温保
存条件下,几天内会快速出现 纤维化! [ 3] , 这种竹
笋的快速 纤维化!极大地影响竹笋的营养和品质。
目前,对于竹笋老化过程中纤维素变化,特别是
竹纤维素生物合成及快速纤维化的内在分子机制还
未见到相关报道 [ 4- 6] , 而 1, 4糖苷酶基因 ( Korrig
an)在纤维素合成途径中具有重要作用 [ 7 ] , 它控制
着聚合在多聚链上的固甾醇 葡糖苷的切除,使纤
维素的合成进入结晶过程 [ 8, 9] , 并最终合成纤维素。
2010年第 3期 吴林森等:毛竹 1, 4糖苷酶基因 cDNA克隆与表达分析
本研究以毛竹为材料, 获得了一条与水稻 1, 4糖
苷酶基因同源的全长克隆, 命名为 PeKOR, 并对其
进行了序列和表达谱的分析,为进一步阐明竹笋纤
维化分子机理奠定基础。
1 材料与方法
11 材料
以浙江林学院竹类培育基地的毛竹一年生实生
苗为材料,取叶片 5 g, 采用改良的十六烷基三甲基
溴化铵 ( CTAB )法, 选用北京 T IANGEN的 RNA快
速提取试剂盒提取毛竹 RNA。
M arker, Taq p lus DNA聚合酶, dNTPs均购自上
海生物工程技术有限公司, 感受态细胞 DH5为实
验室自备, 载体 pMD18T、逆转录试剂盒 ( TaKaR a
AMV Ver 30)购自大连宝生物公司。其他试剂均
为国产分析纯。
12 PCR扩增
苷酶基因序列保守区的基础上, 设计一对长度
为 20 bp的兼并引物和一条 3∀端兼并引物,并递交
上海生物工程技术有限公司合成。
上游引物 P1: 5∀ATGTWCGGGMGGGACCCGT
3∀, 下游引物 P2: 5∀ACAYTACCASGRWGGHGTAT
3∀, P3: 5∀TYGTCAATGCRGCTTTCCTT3∀。提取的
毛竹 RNA经过逆转录合成毛竹 cDNA序列, 经过
PCR克隆目的片段。反应体系 ( 25 L)为 10 # PCR
buffer 25 L, M gC l2 ( 25 M ) 20 L, dNTP ( 10
M ) 05 L,引物 ( 10 M ) 05 L, Taq plus DNA聚
合酶 ( 834 # 105 kat /L ) 03 L, 模板 DNA20 L
( 100 ng) , ddH2O 167 L。反应程序: 94∃ 预变 5
m in, 94∃ 变性 30 s, 55∃ 退火 30 s, 72∃ 延伸 60 s, 30
个循环, 4∃ 保温。
13 目的片段的回收和重组
把 PCR扩增产物经 1%琼脂糖电泳检测后,利
用 Q IAGEN公司的离心柱型琼脂糖凝胶 NA回收试
剂盒从琼脂糖凝胶上回收目的片段; 纯化产物与
pMD18T载体 16∃ 连接过夜, 并转化感受态细胞
DH5,挑取白色单菌落, 37∃ 摇菌过夜;以微量菌液
为模板进行 PCR验证是否为阳性克隆。
14 目的片段的测序及生物信息学分析
将含有目的片段的重组质粒寄交上海生物工程
技术有限公司进行测序。测定的序列用 BLAST进
行同源序列比对; 蛋白的亲疏水性使用 ( http: / /
www. expasy. org / too ls/protscale. htm l)程序分析; 分
子进化树的构建使用软件 MEGA41软件中 NJ法
完成。用 Protparam分析 PeKOR编码蛋白的氨基酸
序列组成、相对分子质量、等电点等理化性质 ( ht
tp: / /au. expasy. org / too ls/protparam. htm l ); 利用
PB IL LYONGERLAND信息库对蛋白质序列进行二
级结构预测 ( http: / /npsapb i.l ibcp. fr /cg ib in /npsa_
automa.t p?l page = /NPSA /npsa _hnn. htm l) ; 利用
TMHMN软件进行蛋白质跨膜区预测 ( http: / /www.
cbs. dtu. dk /serv ices/TMHMM 2. 0 / ) ; 利用 S ignal P
程序分析 N末端信号肽序列 ( http: / /www. cbs. dtu.
dk /serv ices/SignalP / ) ;利用 Pro tFun分析分析预测
PeKOR蛋白的功能 ( http: / /www. cbs. D tu. dk /serv
ices /ProtFun / )。运用 scratch prote in对蛋白质的二
硫键做出分析 ( http: / /www. ics. uc.i Edu /baldig /
scratch / index. hem l)。
2 结果与分析
2. 1 PeKOR基因克隆
以毛竹 cDNA为模板, 通过设定的兼并引物进
行 PCR扩增,得到长度为 1 600 bp和 900 bp左右的
条带, 目的片段进行测序后经拼接获得了长度为 2
191 bp的序列, 经验证无误 (图 1)。
M. DNA分子量标记; 1, 2.从 cDNA中扩增出的 PeKOR基因产物
图 1 PCR扩增结果
2. 2 生物信息学分析
2. 2. 1 毛竹 PeKOR蛋白结构分析、同源比对和进
化树的构建 毛竹 PeKOR基因长 2 191 bp, 具有完
整的开放式阅读框 ( ORF, 1- 1 851 bp) ,编码 617个
氨基酸, 3∀端尾巴长 340 bp(图 2)。在 NCB I上对其
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机构域进行分析发现,在其 110- 560氨基酸位点之间
具有 G lycosyl hydro lase 9 super fam ily功能域。利用
BLAST比对,显示其与以下几种 PeKOR蛋白序列类
似,包括粳稻 1, 4糖苷酶蛋白 (NP 001051192, 91% )、
高粱 1, 4糖苷酶蛋白 ( XP 002463915, 90% )、玉米
1, 4糖苷酶蛋白高粱 (ACN 28577, 90% ),甘蔗 1, 4糖
苷酶蛋白 ( CBB 36505, 89% ), 大麦 1, 4糖苷酶蛋白
( BAA 94257, 86% ), 小麦 1, 4糖苷酶蛋白 ( AAM
13693, 86% ), 食用芋 1, 4糖苷酶蛋白 (AB P96983,
75% ),棉花 1, 4糖苷酶蛋白 ( AAQ 08018, 73% ),番
茄 1, 4糖苷酶蛋白 (AAC 49704, 72% )。
图 2 PeKOR基因及其编码蛋白序列
在此基础上构建的系统进化树结果 (图 3)表
明,毛竹 PeKOR蛋白与水稻、大麦、玉米等的 1, 4
糖苷酶蛋白在进化关系上都具有很近的亲缘关系。
由此可以推断, PeKOR蛋白是毛竹中的 1, 4糖苷
酶蛋白。
2. 2. 2 Pekor蛋白的结构特点和理化性质 用 Pro
tparam预测 PeKOR蛋白的理化性质, 推测该蛋白相
对分子质量为 688625 kD, 等电点为 887; 理论推
导半衰期大于 20 h,不稳定参数为 3178, 属于稳定
蛋白。PeKOR蛋白的二级结构由 3566% a螺旋,
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1361%的延伸和 5073%的随意卷曲 3种结构模
块组成。二级结构中预计可形成 3个二硫键, 分别
在第 468- 527、245- 261、264- 414aa, 参与维持蛋
白质构象的稳定。PeKOR蛋白的疏水性 /亲水性分
析结果表明, 疏水性最大值为 2933, 最小值为 -
2722,总体看来具有较强的疏水性 (图 4)。跨膜结
构预测表明 PeKOR蛋白拥有一个跨膜区, 1- 71位
于膜内, 72- 94为跨膜结构, 95- 617位于膜外,无
信号肽, 存在磷酸化位点 36个 ( 18、25、136、141、
155、181、183、217、235、263、285、311、418、484、536、
79、151、221、234、305、373、463、475、607、60、110、
191、210、244、254、259、288、326、346、488、525) , O
型糖基化修饰位点有 2处 ( 607、613) , N型糖基化修
饰位点 5处 ( 216、313、322、407、566)。通过蛋白质
亚细胞定位软件 PSORT预测发现 PeKOR蛋白无核
定位信号,是一种膜蛋白, 主要存在于细胞质膜、细
胞微体中,以及可能存在于叶绿体类囊体膜和高尔
基体中。
图 3 毛竹 P eKOR与其他植物 1, 4糖苷酶蛋白的系统发生分析
图 4 PeKOR蛋白氨基酸序列的疏水性分析
22 毛竹 PeKOR基因的半定量 RTPCR和表达
分析
取新鲜出土的毛竹笋,分别采用高低温处理,高
温处理样品放于 30∃ 的恒温箱中,低温处理样品放
于 4∃ 冰箱中,于 1, 2, 3 d取毛竹笋中部可食部分,
采用 RNA快速提取试剂盒提取毛竹笋的总 RNA,
并对总 RNA完整性和浓度进行检测,结果 (图 5)表
明 RNA的完整性和浓度符合半定量 RTPCR的要
求。 1 g RNA取用逆转录试剂盒合成 cDNA, 运用
已有的毛竹 A ction引物调整半定量反应模板的起
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始量。根据已测序的 PeKOR 基因的序列, 运用
Primer Prem ier 5软件设计半定量引物, 交由上海生
工合成。分别是上游引物 P1: 5∀TTAGGAAGAGC
CGCAACC3∀, 下游引物 P2: 5∀CAACAGGGAACA
CATCATACC3∀。对 PeKOR基因半定量结果 (图 6)
表明, 在不同温度的保存条件下, PeKOR基因均有
表达,但表达量存在着较为明显的差异。相同的储
存时间,高温条件下 PeKOR基因的表达量明显高于
低温条件下 PeKOR基因的表达量,高温 2 d时的样
品的 PeKOR基因的表达量明显高于 1 d和 3 d的样
品, 高温 3 d的样品 (笋体明显软化 )表达量较低可
能是由于笋体细胞的衰亡造成的; 在低温条件下,
PeKOR基因的表达量变化则不明显。这可能是由
于外界环境的温度影响着 PeKOR基因的表达量。
这一结果与低温可以延长竹笋的保鲜期的研究结果
一致 [ 2]。
图 5 不同毛竹笋处理样品总 RNA的提取
图 6 毛竹 PeKOR基因的半定量 RTPCR
3 讨论
竹笋采后不易储存与其采后快速木纤化紧密相
关,而在植物木纤化过程中 1, 4糖苷酶 ( korrigan)
基因起着重要的作用,目前研究认为,它控制着聚合
在多聚链上的固甾醇 葡糖苷的切除,使纤维素的
合成进入结晶过程 [ 8, 9] ,并最终合成纤维素。
本研究首次从毛竹中获得了 PeKOR基因, 序列
分析表明其与水稻等的 1, 4糖苷酶基因同源性很
高,其蛋白序列具有 G lycosy l hydrolase 9 super fam ily
功能域,在 N端具有一个跨膜结构, 推测其可能与
固甾醇 葡糖苷的切除有关。通过半定量 RTPCR
分析不同储藏条件下的毛竹笋 PeKOR基因的表达
发现, PeKOR的表达量的高低与储藏温度有着直接
联系, 高温促进它的表达,低温条件下变化不明显。
这与竹笋在低温条件下的储藏期明显长于常温
( 25∃ )条件下的储藏期相一致。从而推测 PeKOR
基因的表达量与植物组织纤维素的含量高低有关。
植物纤维素的合成是一个复杂的过程, 竹笋的快速
纤维化又是竹笋采后保鲜过程中一个亟待解决的问
题,现阶段在分子水平上对这个问题的研究还很少,
PeKOR基因的成功克隆为进一步在分子水平上研
究竹笋的保鲜打下了基础。
参 考 文 献
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