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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
血管钠肽 ( VNP)在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析
李鹏 1 于军2 陈健康2 陈蕴 1 房聪 1 邱爽 1 丁月娣 1 金坚 1
( 1江南大学医药学院 药物设计与分子药理学实验室,无锡 214122; 2第四军医大学基础部生理学教研室,西安 710032)
摘 要: 利钠肽家族成员在维持机体心血管平衡等方面发挥着重要的生理作用。人工设计的新型利钠肽分子血管钠
肽 ( VNP )由 C-型利钠肽和 A-型利钠肽的功能结构域嵌合组成,具备两种利钠肽分子的优势功能。采用分子生物学方法,构建
了 BL21( DE3) /pGEX-4T-1-VNP原核表达系统, 在大肠杆菌中实现了融合蛋白 GST-VNP的可溶性表达。经离心、超声波破
碎、GST亲和层析、G25凝胶过滤和肠激酶酶切后超滤离心便可获得电泳纯的目的产物 VNP, 最终每升发酵液可获得 20 mg重
组 VNP蛋白。大鼠离体血管环张力法和去膀胱尿液收集法活性评价显示, VNP具有扩张血管和利尿双重功效。
关键词: 血管钠肽 利钠肽 融合蛋白 纯化 活性
The Expression, Purification and Activity Analysis of a
New Natriuretic Peptide( VNP) inE . coli
L iP eng
1
Yu Jun
2
Chen Jiankang
2
Chen Yun
1
Fang Cong
1
Q iu Shuang
1
D ing Yuedi
1
J in Jian
1
(
1
School of M edicine and Pharmaceutics, J iangnan University, W uxi 214122;
2
D epar tment of Phy siology, Fourth M ilitary M edical University, X i. an 710032)
Abstrac:t Them em bers o f the natriuretic peptides fam ily p layed an important ro le in m a inta in ing cardiovascu la r hea lth. A new
ch im eric peptide) ) ) VascularNatriuretic Peptide( VNP ), w as com posed o f the function doma in of CNP and ANP. Acco rd ing to the art-i
fic ially designed sequence o f the VNP, w e constructed the expression plasm id pGEX-4T-1-VNP. VNP w as expressed in E. coli BL21
( DE3) as a so lub le prote in w ith a c leavable N- term inal GST tag. E lectropho resis-pure VNP w as obta ined from ferm entation broth by
centr ifugation, sonication, GST affin ity chroma tog raphy, G25 ge l filtration, and centr ifuga l ultra filtration after enterok inase c leavage reac-
tion. The y ield o f recom binantVNPw as about 20 mg /L by ferm en tation bro th. The iso lated rat arte rial ringm ethod and the b ladder ur ine
co llection m e thod based eva luation show ed tha t b iosynthesis VNP possessed good activ ity of the vasod ilator as w ell as the d iuretic effect.
Key words: VNP Natriuretic peptides Fus ion prote in Pu rifica tion in vitro activ ity
收稿日期: 2011-01-19
基金项目:国家重大新药创制资助课题 ( 2009ZX09103 )
作者简介:李鹏,男,硕士研究生,研究方向:基因工程制药; E-m ai:l lp2270020@ 126. com
通讯作者:金坚,男,教授,博士生导师,研究方向:细胞与分子药理学; E-m ai:l jin jian31@ 126. com
心脑血管疾病是世界公认的人类健康的 /第一
杀手0, 其中心力衰竭是多数器质性心脏病人如心
肌梗死、肺源性心脏病和肥厚型心肌病等几乎不可
避免的结局 [ 1] ,心衰的 2年死亡率达 20%, 5年死亡
率高达 40%。目前,我国心衰患者已达到 500万人
以上, 随着人口老龄化及高血压、高血脂、糖尿病和
冠心病等患者的人数不断增加, 在未来 5年我国心
衰患者预计将达到 700万人以上。在我国,临床上
治疗心力衰竭的药物有强心剂、利尿剂、扩张血管
剂、血管紧张素酶抑制剂和肾上腺素阻滞剂等几大
类药物,但这些药物存在剂量不稳定、毒副作用大等
缺点,因此开发一种效果优良、剂量稳定且毒副作用
小的新药是非常迫切和必要的。近年来,通过对心
衰发病过程及神经激素激活的研究, 人们逐渐认识
到通过调节神经激素激活水平以改变心衰的发生、
发展进程才是治疗关键。
钠尿肽家族是近年来发现的一个多肽家族, 具
有由两个半胱氨酸通过二硫键形成的一个 17个氨
基酸的环形结构域。钠尿肽家族在维持机体水盐平
衡、血压稳定、心血管及肾脏等器官功能方面具有重
2011年第 5期 李鹏等:血管钠肽 (VNP )在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析
要意义 [ 2]。近年来,随着人们逐渐对钠尿肽家族成
员的认识, 利钠肽也成为了研究热点。人脑钠肽
( human brain natriure tic peptide, hBNP)是钠尿肽家
族成员之一,其基因重组药物 ) ) ) 奈西利肽 ( nesiri-t
ide)已于 2001年被美国 FDA批准作为治疗急性失
代偿性心力衰竭的临床用药。我国也于 2005年上
市了国家生物制品Ñ类新药 /新活素0 (即 rhBNP) ,
同样用于治疗急性充血性心衰。
随着人们对利钠肽家族成员研究的深入, 发现
ANP具有强烈的利钠、利尿和扩张动脉效应, 但扩
张静脉的效应很弱。而 CNP的利钠、利尿及扩张动
脉的活性很弱,但有强烈的扩张静脉作用。ANP与
CNP在结构及生物活性上的差异表明,天然钠尿肽
氨基酸环及其羧基端延伸的氨基酸残基序列可能对
其生物活性有重要影响。若将 ANP氨基酸环羧基
端的 5个氨基酸残基加到 CNP的相应部位,可能会
得到一种具有新活性的钠尿肽 (图 1)。基于上述设
想, W e i等 [ 3]于 1993年首先设计并人工合成了具有
新的生物活性的钠尿肽 ) ) ) 血管钠肽 ( V asonatrin
peptide, VNP)。这样做的目的是使得 VNP既具有
CNP的扩张血管作用又具有 ANP的利钠利尿的双
重作用。
图 1 血管钠肽 ( VNP)的结构示意图 [ 4]
VNP是具有新型生物活性的钠尿肽家族的新
成员, 共有 27个氨基酸残基, 是 CNP和 ANP组成的
嵌合体。其氨基酸序列为: G ly-Leu-Ser-Lys-G ly-Cys-
Phe-G ly-Leu-Lys-Leu-Asp-A rg-Ile-G ly-Ser-M e-t Ser-G ly-
Leu-G ly-Cys-A sn-Ser-Phe-A rg-Tyr, 分子量约为 218
kD。二级结构中有一对二硫键。已有的研究表明,
VNP可能在慢性心力衰竭、高血压等疾病治疗上较
天然钠尿肽更具应用前景 [ 5]。但具有独特生物活
性的 VNP目前似乎并未引起人们重视, 究其原因,
首先是因为化学合成的 VNP成本昂贵、半衰期短,
严重制约了钠尿肽的大规模试验研究和临床应用;
其次, 通过生物法制备短肽的得率较一般大分子蛋
白要低,主要是因为其分离与纯化存在一定的难度。
本研究从生物法入手, 通过融合蛋白的表达形式以
增加短肽的最终得率。从分子构建开始, 在发酵表
达、纯化以及活性评价方面做了一定的研究。
1 材料与方法
111 材料
大肠杆菌宿主菌株 E. co li JM 109 ( recA1, en-
dA1, gyrA96, th-i 1, hsdR17, supE44, relA1, $( lac-pro-
AB) /F . [ traD36, proAB + , lacIq, lacZ$M15 ] )和
BL21( DE3)由本实验室保存。pGEX-4T-1质粒由本
实验室保存。VNP编码基因由上海生工生物工程技
术服务有限公司合成,并整合到质粒 pUC57中。
Taq DNA聚合酶和 2 @ Pfu PCR M asterM ix系
天根生化科技 (北京 )有限公司产品; 限制性内切酶
E coR Ñ、N ot Ñ和 T4 DNA L igase系 TaKaRa公司产
品; 胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒, T ryptone Pow-
der和 Yeast Extract系上海生工生物工程技术服务
有限公司产品; 还原型谷胱甘肽系 Am resco公司产
品; 去甲肾上腺素 ( norep inephrine, NE )和乙酰胆碱
( acetycho line, A ch)系美国 S igma公司产品; GST琼
脂糖凝胶 FF系北京韦氏博慧色谱科技有限公司产
品; Sephadex G25凝胶系 GE公司; 重组肠激酶 ( 4
U /LL)系上海启发生物科技有限公司产品; CNP单
抗 ( Rabb it an t-iC-Type N atriuretic Pept ide)购自瑞士
Bachem公司; HRP-DAB底物显色试剂盒购自天根
生化科技 (北京 )有限公司; pGEX通用引物 P3, P4
和 P1, P2目标产物引物均由上海生工合成; VNP
(化学合成 )由吉尔 (上海 )生化有限公司负责合成;
其他试剂均为国产分析纯,药品均系国药集团产品;
试验用 SD雄性大鼠, 体重 230 ? 20 g, ANP (A-型钠
191
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
尿肽 ), CNP( C-型钠尿肽 )由第四军医大学实验动
物中心提供。
基因扩增仪 (M yGeneTM series Peltier Thermal
Cycler) ;凝胶成像系统 ( SYNGENE ); 纯化系统为
GE公司 AKTAbasic纯化系统;蛋白检测系统 ( B IO-
RAD );冷冻干燥机 ( LABCONCO ); M ill-iQ B ioce l超
纯水系统 (M ILLIPORE )。
112 方法
11211 融合蛋白表达载体的构建 VNP是由 27个
氨基酸组成的短肽,分子量约为 218 kD。直接表达
不易检测并且纯化难度较大;而通过 GST-VNP融合
方式来表达,一方面由于原核表达体系是目前比较
成熟的体系,发酵周期短并且可以得到较高的表达
量;另一方面可以利用 GST亲和层析进行纯化, 降
低了纯化的难度。
1121111 引物设计及合成 针对 VNP编码基因,
从 5c端设计含有 E coRÑ和肠激酶酶切位点的上游
引物 P1,从 3c端设计含有 No t Ñ酶切位点的下游引
物 P2。此处肠激酶识别氨基酸序列为 DDDDK, 在
氨基酸 K处进行切割。
Forw ard ( P1 ) 5c-CTGAATTCGATGATGACGA-
CAAAGGCCTGAGCAAAGGCTGCTTC-3c(下划线部分
为 E coRÑ酶切位点,斜体部分为肠激酶的识别位点
A sp-A sp-A sp-A sp-Lys密码子 );
Reverse ( P2 ): 5c-TGTTAAGCGGCCGCTTAGTA-
ACGAAAGCTGTTACAACCCAGG-3c(下划线部分为
N otÑ酶切位点 )。针对 pGEX-4T-1质粒载体多克隆
位点处通用引物, pGEX ( P3) 5c-GGGCTGGCAAGC-
CACGTTTGGTG-3c, pGEX( P4) 3c-CCGGGAGCTGCAT-
GTGTCAGAGG-5c,作为鉴定使用。
1121112 VNP基因的 PCR扩增 分别利用上游引
物 P1和下游引物 P2,对含有目的基因的 pUC57进
行扩增,产物通过琼脂糖凝胶电泳分析。反应的体
系为模板 1 LL, 215mmo l/L的 dNTP m ix ture 2 LL,
10 @ PCR Buffer 2 LL, Taq DNA聚合酶 012 LL,上游
引物 P1和下游引物 P2各为 018 LL,加双蒸水补齐
20 LL。反应程序: 94e 预变性 3 m in; 94e 变性
30 s, 65e 退火 30 s, 72e 延伸 30 s, 循环 30次;
72e 最终延伸 10m in。
1121113 重组质粒 pGEX-4T-1-VNP的构建 用
DNA片段快速胶回收试剂盒对 PCR扩增产物进行
纯化。将纯化的 VNP基因和质粒 pGEX-4T-1各自
用限制性内切酶 E coRÑ和 N ot Ñ双酶切, T4DNA连
接酶 16e 过夜连接, 转化 JM 109感受态细胞转化
菌, 涂布在含 50 mg /L氨苄青霉素的 LB琼脂的平
板上, 37e 培养过夜; 随机挑取若干单菌落, 采用
pGEX-4T-1载体上通用引物 P3、P4, PCR扩增的方
法鉴定融合基因是否成功插入到了表达载体多克隆
位点中,对阳性菌进行 DNA测序鉴定。采用原核表
达体系,将重组质粒 pGEX-4T-1-VNP转化至大肠杆
菌 BL21( DE3)受体菌,涂布于含 50 mg /L氨苄青霉
素的 LB琼脂平板, 37e 培养过夜后,随机挑取若干
单菌落,采用 pGEX-4T-1载体上多克隆位点处 P3、
P4通用引物来验证, 进行 PCR反应并通过琼脂糖
凝胶电泳鉴定, 至此基因工程菌 BL21 ( DE3 ) /
pGEX-4T-1-VNP构建完成。
11212 融合蛋白 GST-VNP的表达 将 pGEX-4T-
1-VNP质粒转化大肠杆菌 BL21( DE3)感受态,得到
稳定表达菌株 BL21( DE3) /pGEX-4T-1-VNP, 于含
50 mg /L氨苄青霉素的 LB平板上划线分离得到单
菌落。将所挑取的单菌落接种于 10 mL的 LB培
养液中, 37e 、200 r/m in振摇培养 14 h,按 1B100的比
例接种至 1 000 mL LB培养液中, 37e 、200 r/m in培
养 2- 3 h至 OD600值为 018左右, 加入终浓度为 015
mmo l/L的 IPTG, 30e 、200 r /m in诱导表达 6 h。
11213 融合蛋白 GST-VNP的分离纯化
1121311 超声波破碎 发酵液于 10 000 r /m in下
离心 10m in,弃上清,收集菌体。将离心所得的菌体
重悬于 100 mL 0105 mo l/L Tris-HC l缓冲液 ( T ris
6109 g /L, N aC l 9 g /L, HC l调 pH813)。菌体在冰浴
条件下超声波破碎,条件为 200 V, 800W, 超声时间
8 s,间隙时间 5 s,工作次数 99, 收集超声后的液体,
混匀。随后在 4e , 14 000 r/m in下离心 20 m in, 收
取上清,并于 4e 保存。
1121312 GST 琼脂糖凝胶亲和层析及 Sephadex
G25凝胶过滤 用 GST琼脂糖凝胶亲和层析, 柱体
积为 20 mL, 径高比为 2B9( cm ), 用核酸蛋白检测仪
在波长 280 nm 下进行蛋白检测。缓冲液 A ( Tris
6109 g /L, N aC l 9 g /L, HC l调 pH813 )平衡, 流速
1mL /m in,上样;缓冲液 B( T ris 6109 g /L, GSH 3107
192
2011年第 5期 李鹏等:血管钠肽 (VNP )在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析
g /L, HC l调 pH813)洗脱, 流速 1 mL /m in, 收集洗脱
峰。对洗脱液用 B radford方法进行蛋白质定量, 取
部分样品进行 SDS-PAGE [ 6 ]分析。
对 GST亲和层析洗脱得到的融合蛋白 GST-
VNP用 Sephadex G25分子筛以除去融合蛋白中大
量盐分子。 Sephadex G25分子筛柱体积为 200 mL,
径高比为 3B40( cm ) ,缓冲液体系为 20mmol /L Tris-
HC ,l pH716,用 AKTA basic进行检测。
1121313 蛋白酶切及 GST标签去除 将 G25凝胶
过滤得到的融合蛋白样品进行冻干浓缩后, 按 1 LL
肠激酶可完全切割 014 mg融合蛋白用量加入肠激
酶。酶切缓冲液 20 mmo l /L Tris-HC ,l 100 mmo l /L
N aC ,l pH716, 于 25e 酶切 8 h,酶切后样品进行 GST
琼脂糖凝胶亲和层析除去多余的标签蛋白 GST,取
部分酶切产物进行 Tric ine-SDS-PAGE分析 [ 7]。
1121314 重组 VNP蛋白的纯化 酶切后除去标
签 GST后的样品仍存在少量的肠激酶及杂蛋白,
采用截留分子量为 10 kD的膜超滤离心管再对样
品进行纯化, 4 000 r /m in, 30 m in; 收集离心管下方
流穿液,此步可有效除去酶切后残留的肠激酶及
少量杂蛋白。取部分流穿液样品进行 Tric ine-SDS-
PAGE分析。
1121315 重组 VNP蛋白的鉴定 将纯化后的 VNP
蛋白用抗 CNP单克隆抗体进行 W estern b lo tting分
析;并采用质谱仪 (WATERSMALD ISYNAPT Q-TOF
M S)对样品测定, 结果采用 Masslynx 411软件进行
分析, 确定其分子量。
11214 体外药效学评价 [ 8]
1121411 离体血管环张力测试 大鼠以戊巴比妥
钠 ( 30 mg /kg )腹腔麻醉, 颈动脉放血后剖开胸、腹
腔, 剪取肺动脉、腹主动脉和腹腔静脉, 置盛有冷
K rebs液 ( mmo l/L: N aC l 11813, KC l 417, M gC l2 #
6H 2O 215, C aC l2 215, KH 2PO 4 112, N aHCO 3 2510,
C a-N a EDTA 0103, G lucose 1111 )的平皿中, 去掉
血管表面结缔组织, 制备成 3 mm长的环形血管标
本。在部分试验中, 取其中一段标本用细钢丝插
入管腔,经滚动破坏血管内皮。将血管环悬挂于
37e K rebs液的浴槽中, 通入 95% O2加 5% CO2的
混合气体。连接张力传感器, 用二道生理仪 ( LM S-
2B型成都 )记录血管环张力的变化。肺动脉、腹
主动脉血管环的基础张力均为 1 g, 经平衡 1 h后,
加入 10 Lmo l/L NE检验标本活性 (收缩幅度小于
300 mg者弃去 ),然后冲洗使血管张力恢复至基线。
稳定 30 m in后重复给予 NE, 待血管收缩达到稳定
值, 逐步增加样品的浓度 ( 10- 10 - 10- 6 mo l/L ), 以
制作累积浓度 -舒张反应曲线, 求出最大舒张反
应值 ( Rm ax )。用 10 Lmo l/L A ch对血管环是否
产生舒张效应作为判断血管内皮是否存在的
标准。
1121412 去膀胱尿液收集法检测钠尿肽的利尿作用
正常的健康成年 SD雌性大鼠,戊巴比妥 ( 40 mg /kg)
腹腔麻醉, 气管插管维持自主呼吸。以自制的聚
乙烯导管从下腹部正中切口插入, 由膀胱逆行尿
道插管, 以备记录尿量, 在膀胱根部结扎膀胱。尿
液收集到试管内以备检测尿 N a+ 和 K +。稳
定 30m in后, 分别记录给药前以及给予钠尿肽
( 50 Lg /kg )后 15 m in内的尿量。每次给药间隔为
20 m in。
2 结果与分析
211 pGEX-4T-1-VNP载体构建
21111 VNP基因的 PCR扩增 用 DNA片段快速
胶回收试剂盒对 PCR扩增产物纯化后, 理论预测
目的片段约为 120 bp, 通过琼脂糖凝胶电泳分析
(图 2)。
M. DNA M ark er D; 1. VNP扩增产物
图 2 琼脂糖凝胶电泳检验 PCR扩增结果
193
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
结果在 120 bp左右处出现明亮的特异性条带,
片段长度与预期一致。
21112 重组质粒 pGEX-4T-1-VNP的构建及鉴定
用 pGEX-4T-1载体通用引物 P3、P4鉴定阳性克隆,
理论预测目的片段约 250 bp,通过琼脂糖凝胶电泳
分析 (图 3)。
M. DNA M arker D; 1.空白质粒对照组; 2- 5. PCR扩增产物
图 3 重组质粒 pGEX-4T-1-VNP的 PCR扩增产物
图 3中泳道 3和 5可以看出, 质粒 PCR扩增均
产生 250 bp左右明亮的特异性条带,大于空载载体
pGEX-4T-1,表明 VNP基因成功插入到了克隆载体
pGEX-4T-1中, pGEX-4T-1-VNP重组质粒构建成
功。挑取 21312结果中 3号和 5号菌送至上海生工
生物工程技术服务有限公司测序, 结果为 GGCCT-
GAGCAAAGGCTGCTTCGGCCTGAAACTGGACCGCAT
-CGGCAGCATGAGCGGCCTGGGTTGTAACAGCTTT-
CGTTAC,序列比对结果显示,克隆得到的 VNP基因
序列与 GenBank数据库中的序列完全一致。
21113 工程菌 BL21( DE3) /pGEX-4T-1-VNP的构
建 提取重组质粒 pGEX-4T-1-VNP转化 BL21
( DE3)感受态细胞后菌液 PCR鉴定, 理论预测目
的片段约 250 bp, 通过琼脂糖凝胶电泳分析
(图 4)。
用 pGEX-4T-1通用引物 P3、P4, PCR鉴定构建
结果, 片段大小在 250 bp左右有明亮的特异性条
带,且都大于空载载体 pGEX-4T-1, 表明 VNP基因
已成功与载体 pGEX-4T-1连接并转入到宿主菌大
肠杆菌 BL21( DE3)中。
M. DNA M arker D; 1.空白质粒对照组; 2.重组质粒 pGEX-4T-1-VNP
图 4 琼脂糖凝胶电泳检验工程菌构建
212 融合蛋白的诱导表达
有报道表明, 低温诱导能增加大肠杆菌对蛋白
的表达量 [ 9] , 对诱导时 IPTG的浓度和温度做了相
应的控制, IPTG诱导浓度为 015mmol /L, 1mmol /L,
115 mmo l/L,诱导温度为 28e 和 30e 。理论上表达
出的融合蛋白 GST-VNP分子量约为 29 kD,取发酵
液进行 SDS-PAGE电泳 (图 5)。
M.蛋白分子质量标准; O.纯化蛋白 GST对照组; 1, 3, 5.
分别为 BL21 ( DE3 ) /pGEX-4T-1-VNP在 28e 条件下经
015, 110, 115 mm ol /L IPTG浓度诱导; 2, 4, 6. 分别为
BLX1 ( DE 3 ) /pGEX-4T-1-VNP 在 30e 条件下经 015,
110, 115mm ol/L IP IG浓度诱导
图 5 发酵液全细胞进行 SDS-PAGE分析
可见融合蛋白 GST-VNP在 29 kD处有明显表
达, 此外低温诱导有利于蛋白的可溶性表达,且低温
易于控制; 而 IPTG在浓度上并无明显差异, 选择
015 mnol /L作为诱导剂浓度,可降低成本。
213 融合蛋白的分离纯化
21311 融合蛋白 GST-VNP的可溶性表达及亲和层
析分析 取细菌裂解前后以及 GST亲和层析样品
进行 SDS-PAGE电泳分析 (图 6)。
194
2011年第 5期 李鹏等:血管钠肽 (VNP )在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析
M.蛋白分子质量标准; 1. 经诱导的 BL21 ( DE 3) /pGEX-
4T-1; 2.经诱导的 BL21( DE 3) /pGEX-4T-1-VNP; 3.细胞
经裂解后离心沉淀; 4. 细胞经裂解后离心上清; 5. GST
亲和层析的洗脱样品
图 6 可溶性表达及亲和层析 SD S-PAGE分析结果
根据电泳结果可知,融合蛋白在 29 kD处有明
显表达。从图 6中泳道 3, 4可看出, 细菌裂解沉淀
中 GST-VNP的量很少, 因此融合蛋白 GST-VNP大
部分为胞内可溶性表达, 减轻了后续蛋白纯化的难
度; 经 GST亲和层析后除去了绝大多数杂蛋白。
Sephadex G25凝胶过滤层析对洗脱的 GST-VNP进
行脱盐和缓冲液置换, 置换缓冲液为 20 mmo l/L
Tr is-HC ,l pH716,便于下一步肠激酶酶切。
21312 肠激酶酶切 Tric ine-SDS-PAGE分析 根据
肠激酶说明书用量进行肠激酶酶切,融合蛋白 GST-
VNP用肠激酶酶切后进行 Tric ine-SDS-PAGE小分
子量电泳分析,蛋白 VNP分子量约为 218 kD, 电泳
检测结果见图 7。
M.蛋白分子质量标准; 1. 50 Lg融合蛋白经 1 LL rEK酶切结果; 2. 100 Lg融合蛋白经 2LL rEK酶切结果; 3.经 rEK酶切前的 GST-VNP;
4.经 rEK酶切后的 GST-VNP
图 7 肠激酶酶切后 Tr ic ine-SD S-PAGE( a)及 SDS-PAGE( b)分析结果
肠激酶酶切后可见在分子量约 218 kD处有明
显的特异性条带出现, 表明酶切后有单体 VNP出
现,实际结果和预期一致;此外,酶切前后蛋白样品
电泳检测后也具有明显的分子量差异, 可见肠激酶
酶切效率很高,能将融合蛋白 GST-VNP完全切割。
21313 VNP纯化后的 T ricine-SDS-PAGE分析 肠
激酶酶切后进行 GST琼脂糖凝胶 FF亲和层析去除
多余的标签蛋白 GST, 再经超滤离心, 蛋白 VNP分
子量约为 218 kD, 取流穿液样品进行 Tricine-SDS-
PAGE分析 (图 8)。
肠激酶酶切后进行 GST亲和层析可以去除绝
大部分 GST标签蛋白,但还存在肠激酶及少量杂蛋
白等,再经一步超滤离心,收集流穿液便可获得电泳
纯的重组 VNP蛋白, 用 Bradford方法进行蛋白质定
量, 最终每升发酵液可获得 20 mg重组 VNP蛋白。
21314 VNP的 Western blotting分析及质谱分析
VNP是人 CNP和 ANP的嵌合体,由图 1知 VNP大
部分为 CNP的氨基酸序列, 因此可采用 CNP单抗
进行杂交;此外 VNP样品再经过质谱仪检测, 确定
其分子量 (图 9,图 10)。
195
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
M.标准蛋白分子质量; 1.去除 GST 标签后酶切融合蛋
白; 2.超滤离心后的蛋白
图 8 超滤离心后 Tricine-SDS-PAGE分析结果
将纯化后的 VNP用抗 CNP单克隆抗体进行蛋
白质杂交鉴定。结果显示, 目标蛋白可以与抗体结
合, 在大约 218 kD附近显示蛋白印迹。质谱仪器
(WATERSMALD I SYNAPT Q-TOF M S )测定, 根据
样品氨基酸序列计算出准分子离子的理论值为
2865141 Da; 分析全扫描图产生的信号发现, 在
81213 m in出现的信号 (图 10-a,图 10-b)可知碳同
位素的质荷比相差 015, 由此可断定蛋白 VNP带双
电荷,分子量为质荷比的两倍关系, M asslynx 411软
件进一步计算可确定 VNP蛋白分子量为 2864169
Da( C
12
) (图 10-c), 由于 VNP蛋白只存在 1对二硫
键 (图 1) ,因此 VNP样品真实分子量应为 2865141
- 2H + H
+
= 2864141与实际测量值 2864169 Da十
分接近,此外还存在着 012左右微小偏差,可能在于
仪器本身,图 10-b经计算至图 10-c将微小的误差放
大等原因所致。
M.蛋白分子量标准; 1. VNP蛋白; 2. W estern b lotting分析
图 9 VNP的 Tr icine-SDS-PAGE分析 ( a)及W estern b lotting分析 ( b)
214 体外药效学评价
离体血管环张力法测定融合蛋白 GST-VNP、
ANP、CNP,化学合成 VNP( S)及生物表达纯化 VNP
( B )的大鼠血管舒张活性 (图 11)。
以 NE使血管环收缩的最大效应为 100% ,各项
数据均以相对于 NE所引起反应的% ( x ? s)表示,
用 t检验作统计学处理。静脉注射 VNP相对于空
白对照组能显著降低大鼠平均动脉压 ( * * P < 01001
vs对照组 ) , 而静脉注射 ANP ( * P < 0105 vs对照
组 ) , CNP( * * P < 01001 vs对照组 )也有一定的降压
作用。
去膀胱尿液收集法测定 ANP、CNP、化学合成
VNP( S)及生物表达纯化 VNP( B )在给药前后大鼠
尿量,滴 /分 ( d /m in) ,结果如图 12所示。
196
2011年第 5期 李鹏等:血管钠肽 (VNP )在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析
a.样品全扫描; b.在 8121m in时间点的信号分析; c.在 8121m in时间点 VNP的蛋白分子量分析
图 10 VNP的质谱分析
GSTVNP= GST-VNP融合蛋白; ANP= A-型利钠肽; CNP= C-型利钠肽; VNP( S ) =化学合成 VNP; VNP ( B) =生物表达纯化 VNP; 竖线
数据用 6个独立试验数据的平均数 ?标准差表示 (* P < 0105, * * P < 01001 vs对照组 )
图 11 利钠肽在舒张血管方面比较
给药前后的数据都以 ( x ? s)表示,用 t检验作
统计学处理。不难看出 VNP在给药前后具有明显
的利尿作用 (* P < 0105), 而 CNP由于分子结构所
致,基本不具利尿作用。综合扩张血管和利尿两方
面活性比较, 基本可以看出, 在扩张血管方面
ANP< VNP < CN P, 而在利尿方面则 CNP< VNP
< ANP, 新型钠尿肽 VNP在扩张血管和利尿具有
双重功效。
197
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
ANP= A-型利钠肽; CNP= C-型利钠肽; VNP( S ) = 化学合成 VNP; VNP( B) =生物表达纯化 VNP;竖线数据用 6个独立试验数据的平均
数 ?标准差表示 (* P < 0105 vs对照组 )
图 12 利钠肽在利尿方面比较
3 讨论
血管钠肽 (VNP)是目前的研究热点, VNP显示
出了在扩张血管和利钠利尿方面的双重强大活性。
然而活性研究结果表明,通过化学合成获得的 VNP
活性不如生物法获得的活性高,表现在舒张血管和
利尿方面,这可能是因为化学合成的 VNP虽然保证
了一对二硫键的形成, 但缺少了蛋白质形成过程中
的折叠,从而难以保证正确的空间构象,进而更难以
保证蛋白质的生物活性。作者曾经试图采用融合蛋
白 GST-VNP的方式, 以求增加 VNP在体内的半衰
期,然而却发现融合蛋白 GST-VNP的活性不如以单
体形式的 VNP活性高,这可能是由于大分子 GST的
空间位阻对 VNP活性产生了较大影响 [ 10]。
VNP分子量较小, 约为 218 kD, 而 GST分子量
约为 26 kD,发酵产物经纯化最终得到的目的蛋白
量较少,因此在分离纯化上存在着一定的难度。只
有提高融合蛋白 GST-VNP的发酵表达量,才能获得
较多的单体 VNP蛋白, 相信随着本研究室对该工程
菌发酵工艺的优化,进一步提高其产率是有可能的。
蛋白可溶性表达较包涵体表达的纯化工作易于操
作,若以包涵体形式表达,必须通过包涵体洗涤、蛋
白变性、复性等一系列的步骤才能达到纯化目的,导
致最终得率较低 [ 11]。本研究总结出了一套重组
VNP蛋白纯化方法。利用 VNP和 GST分子量的差
异,在肠激酶酶切去除标签蛋白 GST后, 经超滤离
心便可直接得到精制 VNP蛋白。整个纯化过程的
条件都很温和,有效地保证了蛋白的活性。
利钠肽的体外活性检测方法目前存在以下几
种: 将 NPRA受体克隆到质粒载体中后转染至 293F
细胞,给药后采用放射免疫试剂盒间接检测细胞内
cGMP含量 [ 12 ]。此方法的缺点在于 293F细胞本身
膜上存在着 NPRA受体, 对试验存在干扰。另外一
种方法是采用人心脏纤维细胞模型, 加入心脏营养
素使心脏肥大,然后加入利钠肽检测其对心脏肥大
是否起抑制作用 [ 13]。而此方法的缺点在于, 心脏纤
维细胞由于能通过自分泌 [ 14] 途径产生 ANP 和
BNP,这会对试验结果产生一定的误差。本研究采
用离体血管环张力法和去膀胱尿液收集法的模
型 [ 15] , 同时比较了 ANP、CNP和 VNP扩张血管以及
利尿方面的差异, 从试验结果不难看出, VNP在扩
张血管和利尿方面均显示出一定的潜力,这也为研
究者们进一步研究重组 VNP在体内活性奠定了基
础。至于 VNP的体内半衰期、代谢途径以及毒副作
用还有待于进一步的药代动力学和药理学研究。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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