全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-11-15
作者简介：王琴琴（1984-），女，在读硕士生，主要从事分子医学与肿瘤研究；E-mail：qincaiwang84@126.com
通讯作者：刘先俊，E-mail：lxj6422@yahoo.com
环鸟苷一磷酸（cyclic guanosine monophosphate，
cGMP）是细胞内的第二信使 ，在机体代谢 、信息跨
膜转运、肌肉收缩、细胞增殖和分化、生物生长发育
等生理过程中起着重要的作用，而其浓度的调节主
要由核苷酸环化酶的合成和磷酸二酯酶 （PDE）水
解作用之间的平衡关系决定。
PDE 是一个超级酶家族， 目前已经发现了 11
个类型 （PDEs1～11） [1~3]，在不同的组织和细胞中有
不同的表达。它们通过调节细胞内特定的信号通路
而在不同的生理、病理过程中发挥重要作用。 PDEs
在功能和药理方面都具有非常重要研究价值，目前
对 PDE5 的研究最为广泛。 PDE5 主要存在于肺、阴
茎海绵体、平滑肌、血小板、胃肠道内皮细胞和小脑
的 Purkinje 细胞层 [4，5]等中，能特异性水解 cGMP，使
其浓度降低，从而影响一系列生理功能。 选择性的
PDE5 抑制剂最初是用于治疗高血压和心绞痛 [6]，
而后人们研究发现这些抑制剂在男性勃起功能障
碍（erectile dysfunction，ED）治疗上也能发挥重要的
作用。自从 1998 年，ED 口服治疗药物西地那非（si-
ldenafil） 上市，PDE5 抑制剂的研究成为了热点，新
的抑制剂不断涌现。但现有的药物还存在一些不良
反应 [7]，主要表现在中枢神经、循环和视觉系统 3 个
方面， 中枢神经系统常见有头痛、 面颊部潮红、焦
虑、消化不良、腹部不适、骨骼疼痛和血尿等；循环
系统表现为心律失常、心肌梗死、脑血管出血和高
血压等； 视觉系统表现为对光敏感、 视力模糊、复
视 、眼部肿胀和视物蓝绿模糊等，所以要求不断地
开发特异性更高，不良反应更小的抑制剂。
以新鲜分离的人血小板为材料，通过快速蛋白
液相 （fast protein liquid chromatography，FPLC）系统
提取纯化 PDE5。 以 3H-cGMP 为底物， 通过液闪仪
测定终产物 3H-鸟苷的每分钟液闪计数值 （cpm）的
Ⅴ型磷酸二酯酶的活性测定及其抑制剂的研究
王琴琴 陈源 刘先俊
（重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心，重庆 400016）
摘 要： 研究以 3′，5′-环鸟苷酸（cGMP）为特异底物的Ⅴ型磷酸二酯酶（PDE5）活性及新合成的化合物 CYⅠ、
CYII、CYIII和 CYIV对该酶的抑制作用。以人血小板为原料，通过快速蛋白液相色谱系统（FPLC）分离纯化得到 PDE5，
利用 3H-cGMP同位素两步分析法检测 PDE5的活性。再以不同剂量的 4种化合物作用于 PDE5，观察它们对 PDE5的抑
制效应，从而筛选出 PDE5的高效抑制剂。结果表明，CYII对 PDE5具有很好的抑制作用。
关键词： Ⅴ型磷酸二酯酶活性 FPLC 抑制剂 放射性同位素 cGMP
Research of the Activity and the Inhibitors of PDE5
Wang Qinqin Chen Yuan Liu Xianjun
（Department of Biochemistry，Chongqing Medical University，Chongqing 400016）
Abstract： It was to study the activity and screen the selective inhibitors of PDE5 from four newly synthesized
compounds，including CYⅠ，CYII，CYIII and CYIV. The phosphodiesteraseⅤ（PDE5） were purified from human platelet
by fast protein liquid chromatography（FPLC） system. Two-step isotopic procedure that could assay PDE5 activity was
conducted. Four newly synthesized compounds of different concentrations were used to observe the inhibition of PDE5.
The results showed CYII has strong inhibitory effect on PDE5.
Key words： The activity of phosphodiesterase5 FPLC Inhibitor Radioisotope cGMP
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
改变，并且通过优化使其达到最佳反应条件 ，观察
4 种新合成的化合物对 PDE5 活性的影响。
1 材料
1.1 材料与试剂
新鲜血小板采自健康捐献者 （男 ，34 岁 ）； [8-
3H]cGMP （12.4Ci ／mmol）购自 PerkinElmer，产品号 ：
3589114）；蛇毒购自 Sigma，产品号：054K0504；闪烁
剂 2，5-二苯基噁唑 （PPO）（Roth 进口分装 ）购自华
美 生 物 工 程 公 司 ；1，4 双-[5-苯 基 噁 唑 基-2] 苯
（POPOP）购自上海试剂一厂；4 种新合成的化合物
和西地那非为本实验室合成 ； 其余均为国产分析
纯。
1.2 仪器设备
Sigma LS1801 液闪仪 ；Pharmacia FPLC 系统 ；
JY92-2D 超声波细胞粉碎机；其余为常规仪器。
2 方法
2.1 人血小板 PDE5 提取液的制备
取新鲜人血小板（血小板分离仪分离得到）4℃
离心 30 min，弃上清，沉淀的血小板加入冰冷 HEP-
ES 缓冲液（HEPES 20 nmol/L，果糖 0.25 mol/L，ED-
TA 1mmol/L，PMSF 1 mmol/L，pH 7.2）3 ml 中悬浮
后， 利用超声波粉碎机破碎血小板 （55 W，9 s 破
碎，9 s 间歇，于冰中进行）。将破碎后的溶液于低温
离心分离 10 min，弃沉淀。 取上清液保存于 4℃，拟
过柱。
2.2 高效阴离子交换层析
采 用 Pharmacia FPLC 系 统 Acta Primer 以 及
Pharmacia Mono Q 阴离子交换柱 HR 5 ／ 5 分离纯化
PDEs。 经上样，洗涤，0～0.5 mol/L NaCl 梯度洗脱，
调节流速为 1.0 ml ／min， 分步收集洗脱液， 每管 3
ml。 保存于-80℃。
2.3 PDE 活性检测
主要步骤参考文献[8]。从加酶到反应开始前的
操作均需在冰上进行 ， 每次使用的分析用缓冲液
（Tris 40 mmol/L pH8.0，MgCl2 10 mmol/L，2-巯基乙
醇 3.75 mmol/L）均为新配制的。 分析 PDE5 的活性
时最终反应容量为 400 μl， 含 PDE5 提取物 2～5
μl，3H-cGMP 2 mCi/ml，MgCl2 5 mmol/L 溶 于 Tris-
HCl 缓冲液中 。 加入 3H-cGMP 启动 PDE5 水解反
应 ，在 30℃水浴箱中孵化 15 min 后 ，沸水浴 2 min
终止反应 。 然后每管加入蛇毒 （1 mg/ml）0.1 ml，
30℃保温 10 min， 再加入 Bio-Rad AG1-X2 阴离子
交换树脂 （使用前需处理 ：加等体积 0.5 N NaOH，
10 min 后洗去上清液，用 ddH2O 洗呈中性；加 0.5 N
HCl，10 m in 后洗去上清液 ， 再用 ddH2O 洗呈中
性。 ）1 ml， 间断混匀， 放置 30 min 后瞬时离心取
0.5 ml。 加入 5 ml 闪烁液（乙二醇乙醚 20 ml，乙二
醇 4 ml，2，5-二苯基噁唑 （PPO）1.6 g，1.4-双-[5-苯
基噁唑基-2]苯（POPOP）20 mg，萘 30 g，二乙基硫代
氨基甲酸钠 0.001%，加二氧六环至 200 ml，完全溶
解后用棕色瓶保存）， 用 Sigma LS1801 液闪仪测定
终产物的 cpm 值。PDE5 的活性用 3H -cGMP 的水解
率表示。
2.4 最适反应条件的确定
抑制试验需要在 3H-cGMP 水解率不超过 15%
的条件下进行 [9]， 因此要确定其最适反应条件，主
要是最适反应时间 、 酶量和底物浓度 。 另外 ，对
PDE5 酶的活性单位进行定义：在最适条件下，每秒
钟催化 1 mol 底物 3H-cGMP 转化为产物所需的酶
量。
2.4.1 最适反应时间的确定 加入 3H-cGMP 启动
PDE5 水解反应，在 30℃水浴箱中分别孵化 10、15、
20、25 及 30 min，PDE5 的用量为 2 μl， 其余同前 。
测定不同时间下的 cpm 值。
2.4.2 最适酶量的确定 取 2 μl PDE5 原液稀释
20 倍 ， 然后从稀释液中分别取 2、10 及 20 μl，从
PDE5 原液中取 2 μl 用于反应，以最适的反应时间
进行，其余同前。 测定不同酶量下的 cpm 值。
2.4.3 最适底物浓度的确定 80 pmol/μl 3H-cGMP
分别取 1 μl 和 2 μl， 以最适的反应时间和最适酶
量进行反应， 其余同前 。 测定不同底物浓度下的
cpm 值。
2.5 测定 4 种药物对 PDE5 的活性的影响
上述试验确定了 PDE5 的最适的反应时间，最
适酶量和底物浓度，然后以最佳反应条件用于分析
CYⅠ、CYII、CYIII 和 CYIV 对 PDE5 的抑制效应动
力学。 4 种新合成的化合物的浓度均分别为 10-6、
10-7、10-8、10-9、10-10 和 10-11 mol ／ L。 用 Sigma LS1801
液闪仪分别检测加入样品及未加样品时的 cpm 值，
并计算对 PDE5 的抑制率（西地那非为对照）。
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2009年第 3期
2.6 统计学分析
通过依格线性回归 Ver2.5 软件对 PDE5 抑制
效应进行回归分析，并求得 IC50值。
3 结果
3.1 PDE5 的分离纯化及其活性测定的结果
人血小板提取液用 FPLC 系统层析结果如图 1
所示 。 分步收集液水解 cGMP 活性曲线如图 2 所
示，结果显示第 5 和 6 管活性较高。
3.2 最适反应条件
通过在不同反应时间，不同酶量和不同底物浓
度测定终产物的 cpm 值，最后确定最适反应时间为
15 min，最适酶量为 2 μl（PDE5 原液 ）和最适底物
浓度为 0.2 pmol/μl。 PDE5 酶的活性单位为 8.89×
10-5 nkat。
3.3 4种新合成的化合物对 PDE5 活性的抑制作用
以第 5 和 6 管的混合液及最适反应条件做
PDE 5 抑制试验，结果如下。
3.3.1 CYI 对 PDE5 活性的影响 CYI 浓度 ，PDE5
活性抑制率分别为 10-11 mol/L，10.5% ；10-10 mol/L，
21.5% ；10-9 mol/L，20.4% ；10-8 mol/L，10.1% ；10-7
mol/L，43.5%；10-6 mol/L，100%，通过依格线性回归
Ver2.5 软件进行回归分析 （y=27.14x+14.38，R2=
0.78），求得 IC50 为 0.0200 mmol/L（图 3）。
3.3.2 CYⅡ对 PDE5 活性的影响 结果表明 CYⅡ
对从人血小板中分离出来的 PDE5 活性具有抑制
作用 （CYⅡ浓度 ，PDE5 活性抑制率分别为 10-11
mol/L，0%；10-10 mol/L，9.87%；10-9 mol/L，30.3%；10-8
mol/L，77.87%；10-7 mol/L，95.77%；10-6 mol/L，96.1%），
西地那非对 PDE5 活性也有抑制作用（西地那非浓
度，PDE5 活性抑制率分别为 10-11 mol/L，2.9%；10-10
mol/L，5.5% ；10-9 mol/L，28.2% ；10-8 mol/L，79.4% ；
10-7 mol/L，95.9%；10-6 mol/L，96.0%）。 根据 CYII 及
西地那非浓度对 PDE5 的抑制率变化做半对数线
图，如图 4。 并且通过依格线性回归 Ver2.5 软件分
别对 10-10～10-7 mol/L 浓度范围进行回归分析 y=
38.189x+30.527，R2=0.983；西地那非的为 y=36.13x+
32.24，R2=0.980），并求得 IC50 结果 ，CYⅡ和西地那
非对 PDE5 的 IC50 分别为 0.0032 和 0.0031 mmol/L。
3.3.3 CYIII 和 CYⅣ对 PDE5 活性的影响 CYIII
和 CYⅣ的浓度为 10-6 mol/L 时 ， 对纯化得到的
PDE5 活性仍几乎无抑制作用（数据略）。
4 讨论
磷酸二酯酶（PDEs）由至少 15 个基因编码 ，以
其对不同底物的特异性 （cGMP 或 cAMP）、不同因
子（如钙调蛋白或各种抑制剂）的敏感性、cDNA 序
图 1 利用 Pharmacia FPLC 系统 Acta Primer 纯化
人血小板 PDEs
图 2 分步收集液水解 cGMP 活性曲线
图 3 不同浓度的 CYI 对 PDE5 的抑制作用
图 4 不同浓度的 CYII 对 PDE5 的抑制作用
王琴琴等：Ⅴ型磷酸二酯酶的活性测定及其抑制剂的研究 113
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
列以及药理学性质可分为 11 类（PDEs1～11），其中
包括 21 个亚种和 53 个变异体。 PDE5 是由 2 个亚
基二聚组成，每个亚基均由一条含有 875 个氨基酸
残基的多肽链组成，并且都有 2 个别构位点以及 1
个催化位点，都可以和 cGMP 结合。在 PDE5 的一级
结构中，775 位谷氨酸残基附近分布有较密集的疏
水性氨基酸， 这一结构增强了 PDE5 对 cGMP 的亲
和性，并且抑制了对 cAMP 的结合能力。 另外，金属
离子（如 Zn2+，Mg2+）对 PDE5 活性也有重要作用。
人血小板中主要是 PDE5， 也发现有 PDE2 和
PDE3，其中 PDE2 和 PDE3 既能水解 cGMP，也可水
解 cAMP。 本试验通过 Pharmacia FPLC 系统 Acta
Primer 成功地从人血小板中分离纯化得到 PDE5，
并且利用已知用于治疗性勃起功能障碍的 PDE5
抑制剂西地那非为对照物，分析 4 种新合成的化合
物对 PDE5 的抑制效应。 根据 CYI 及 CYII 浓度和
它们对 PDE5 的抑制率变化做半对数线图 ，观察到
在这 4 种合成的化合物中，CYI 对从人血小板中分
离出来的 PDE5 活性并不呈剂量依赖性抑制作用，
并且抑制作用弱；CYII 在 10-10～10-7 mol/L 浓度范围
内以剂量依赖性抑制酶的活性；CYIII 和 CYⅣ几乎
无抑制作用。 另外， 求得 CYI、CYII 和西地那非对
PDE5 的 IC50 分别为 0.0200、0.0032 和 0.0031 mmol/
L。 说明 CYII 和西地那非对 PDE5 具有相似的抑制
作用程度，而 CYI 相比之下，则较弱。 PDE5 的成功
分离、 纯化为进一步研究 PDE5 的结构和功能，并
为治疗 ED 药物的筛选供了条件。 除生殖系统外，
PDEs 研究还涉及泌尿系统诸多领域， 如良性前列
腺增生 （Benign prostatic hyperplasia，BPH）相关下尿
路症状、尿失禁、肾病等等。 研究发现，PDE4-PDE5
抑制剂等药物可逆转 α-肾上腺素能受体介导的前
列腺张力增高， 并由此推断 PDE4 和 PDE5 抑制剂
可治疗继发于 BPH 的尿路阻塞症状。 随着分子生
物学、 生物化学和药理学的研究发展，PDE 同工酶
被细分为若干个亚家族及次亚家族，人们可以更大
程度地提高药物的特异性，从而减少毒副作用。 而
且，新的家族成员不断被发现 ，家族成员之间的差
异也逐步达到能够精细的定位， 这将预示 PDE 同
工酶抑制剂的研究有着广阔的前景。
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