全 文 ：生物核术通报
· 研究报告 · 刀力口
百
日
刀乙口






  年增刊
人



·
 。 融合蛋白在杆状病毒系统中的表达及优化
吴芳明 ‘,
韩春光 , 彭明丽 ‘ 黄琳仪‘ 王琼 , 朱欣凯 ‘,
刘永学‘

’军事医学科学院放射与辐射医学研究所 , 北京



“ 江西中医学院中药系 , 南昌
以”

摘 要
旨在建立获得融合蛋白



 一

 的方法和最优条件 。 采用
 一
 从人胚胎肾及大脑组织 总

 中分别扩增孤儿
蛋白偶联受体



和

 的完整表达序列
分别为




和




, 并构建各 自
的重组质粒









一



 及







一


, 再 以 重组质粒为模板 , 运用重叠延伸
 法扩增得到
融合基因


 一

。 , 测序无误后将融合基因与


 !
重组得重组质粒


 !

一


 一


, 而后 转化




 ,使该融合基因重组质粒发生特异性的转座和病毒重组 , 获得杆状病毒表达穿梭质粒





一







, 再将该重组杆粒转染昆虫
份 细胞 , 获得含杆状病毒的细胞分泌上清 , 以上清在不 同条件下
包括不 同感染时
间、 滴度等
感染
匆 细胞以优化融合蛋白在昆虫

 细胞的表达条件。 结果表明 , 感染

且感染强度

 为
时
是融合蛋白在

 细胞中高效表达的理想条件 。 该表达体 系的建立及蛋白表达条件的优化 , 保证 了足量







融合蛋白的制备 。
关键词





 融合蛋白

 一

一

 杆状病毒表达















诫
















初

























’, ,




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,






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,







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。

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./ 0 一 G P R 8 1 a n d p e D N A3 . 1 ( + ) 一 G i l a w e r e
e o n s
tru
e te d as te m Pl ate
s to s p l ie e G P R 8 1 an d 以la into G PR8 1 一 Gi l a fu s io n g e n e 场 ov erlaP extension PC R m e*hod. Aft erseqU eneing , th e fu s i o n g e n e w a s i n s e rt e d i n t o p l as m i d p F A S T B a e l t o o b t ai n t h e re e o m b i n a n t P F A S T B a e l 一 G P R 8 1 一 G i l a ,
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s e a 叮ing GPR81 一 G i l a fu s io n g e n e i n th e e u l tu r e s u p e rn a t a n t w a s o b ta i n e d . TO o p t im iz e t h e e x p r e s -
s i o n c o n d iti o n o f G P R8 1
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G P R 8 1
一 G i l a e x p re s s i o n s y s te m w i th o P ti m i z e d e o n d i ti o n w il l
b e u s e fu l fo r P ro d u e i n g e n o u g h p ro te in p re p ar a ti o n
.
K e y w o rd s : H u m a n G P R 8 1 G i l a F u s io n P r o te i n B a e 一 r o 一 B a e b a e u lo 访ru s exPression
基金项目:国家自然科学基金(N O. 30 17 109 6) 和 “ 十五 ” 全军医药卫生基金(N o. 0l M B0 56) 资助项 目
作者简介:吴芳明( 1981一 ) ,男 , 硕士 , 主要从事受体药理及新药药理研究
通讯作者:刘永学(19 66一 ) , 男 , 博士学位 , 副研究员 , E 一 m ail : liu yx @ ni o . b mi . ac . C n
峨物技术通报 B to te eh noto gy B u le 瓦n 20 08 年增刊
G 蛋白偶联受体 (G protein 一e o u p l e d r e e e P t o rs ,
G P C
Rs ) 在新药研发中占有极其重要的地位 , 它需与
G 蛋白相偶联实现其功能 。 孤儿 G 蛋白偶联受体
(o印han G pC R s , o G p C R s ) 的配基与功能均属未知 ,
因此在功能基因组学及其作为新药靶点研究方面备
受关注 。 G 蛋白由a 、 p 、 丫 3 个亚单位组成 , 其中
队 亚单位通常结合在一起发挥作用 。 当配基结合
并活化 C PCR s后 , 活化的受体与 G 蛋白相互作用 ,
结合在 a 亚单位的 GD P 为 GT P 所取代 , a 与 p丫亚
单位解离 , 形成 G 蛋白的活化形式[’J 。 近年来 ,
G
PC
R
一
G a 融合蛋 白(fu sion pro tein )被用 于 G p C R s
的研究 , 尤其在 G PCR S药理学研究中显示出良好的
应用前景 , 亦将在 。G P C R S 配基筛选及其相应研究
中发挥重要作用【’] 。 它通过将 GPc R 基因序列完整
编码区(除去终止密码子)的 3 ’端和 G a 基因序列完
整编码区的 5 ‘端进行连接 , 并将融合基因在体外细
胞表达系统中表达 。 根据 oGPCRs 数据库的信息 ,
我们对人孤儿受体成员 G PR sl(G enBank A eeessionnum ber: 刀脚公0325 54 )进行了较系统的研究。 本文
主要报道以下内容:通过重叠延伸(sP lic ing hy ov er -
lap extension , S O E
)
P C R 技术将 GpR 81 与 G ila 基
因融合 , 以 Bac 一 t 。一 B ac 杆状病毒表达系统构建了含
该融合基因的重组杆粒 , 转染昆虫 sfg 细胞 , 制备病
毒上清 , 再以该病毒上清感染必 细胞 , 使 GP R 81 -
Gi la 融合蛋白在细胞内成功表达 , 并进一步对表达
条件进行优化 , 满足了我们大量制备 GPR 81一Gi la
融合蛋白的要求。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒 、菌株及细胞 Pc D NA 3.l( 十 ) 质粒 ,
p F A S T B
a e
l
, 大肠杆菌E.co li D H 5a , 大肠杆菌 E.co li
D H 10Bac 及昆虫 sfg 细胞均为本室保存 。
1
.
1
.
2 试剂及标本 反转录试剂盒 , 限制性内切酶
Bam H I , Ec o R I , Hi n d l 购自TaKaR a公司 。 X -
ga l
,
T4
D N A 连接酶 , 核酸片断纯化试剂盒 , Tr an s -
Fa
st 转染试剂购自Pro m ega 公司 。 G ra ce ’s 培养基 ,
水解乳蛋白 , 酵母抽提物 , T R I z o l 试剂购自Invitrogen
公司 。 K O D p l u s 为 Toy oBo 公司产品 。 E . N . 2 . A .
大型质粒提取试剂盒购自om eg a bi 。 一 tek 公司。 抗
G ila 蛋白多克隆抗体(羊抗人 )购自 santa Cru z。 人
胚胎大脑组织 , 肾组织标本来自20 周龄引产胚胎 。
1
.
1
.
3 P C R 引物 设计并合成 PC R 扩增所需引物
(见表 l) 。 其中 Pa 和 Pb 、 P e 和 pd 分别带有Hi nd l
和 Ec 0R I 、 B a m H I 和 Hi nd l 酶切位点 (划线部
分) ;融合基因所用引物 Pa , 和 Pd ‘带有 Ec oR I 和
Hi nd l 酶切位点(划线部分) , Pb ‘和 Pc ‘之间有部分
引物互补(划线部分) , P U C F 及 PU C R 用以鉴定重
组质粒 pFA STBael一G P R 8 1 一G i l a 转化 D H 10B ae 之
后是否发生转座 。
表 1 PC R 扩增所用的引物序列
Pnmersequence
PUC F 5’· C C C C A G G G I丁仃C C C AC T C A CG A C一 ‘
P U C R 5
’一
T C A C A C A C G A A A C A G C T A T G A C 一 ’
( p U C / M 1 3
u p s t re a m )
( p U C / M 1 3 d
o w n s t re a m )
Pa
,
P b
’
P ri m e r s e q u e n e e u s e d fo r e o n s如etion of peDNA3 .l( + ) 一 G PR 8 1 a o d p e D N A3 . l ( + ) 一 G il 。
5 ’一 C C C 鑫丛坦{旦ATGTACAACGGGTCGTCCTG 一3 ’ ( G P R 8 1 u p s t re a m )
5
’一
G C G A A 竹CTCAGTGCCACTCAACAATG 一3 ’ ( G P R 8 1 d o w n s t r e a m )
5
’一
G C 旦丛卫姜ATCGGCTGCACGCTGAc CG召 ’ ( C i l a u p s t re a m )
5
’一
C C C A A G C
『
l
’
l
’
l
’
I A A A A G A G A C C A C A A T C 召 ’ ( C i l o d o w n s t re a m )
Pri
m e r s e明enee used fo r spilieing by overlap extension P CR
5 ’, c C 旦鱼里匹ATGTACAA CG GGTCGT GCTC 一3 ’ ( G p R 8 1 u p s t r e a m )
5
’一
C A G C G T G C A G C C C A T G T G C C A C T C A A C A A T G T G
一
3
’
( G P R 8 1 d
o w n s t r e
am )
5
‘一
G 竹GAGTCGCACATG GGCTGCACGCTGACCGC 一3 ’ ( G i l a u p s t re a m )
5
’一
C C C A A C C
.
l
’
l
’
l
’
I A A A A G A G A C C A C A A T C
一
3
’
( G i l
o d o w n s t re
am )
Pabcd
Pc’d
年增刊 吴芳明等:人 G PR8 1一 Gi l a 融合蛋白在杆状病毒系统中的表达及优化 15 1
1.2 方法
1.2 .I RT 一 P c R 或 Pc R 扩增 目的基因或融合基因
以 TR Izo l试剂提取人胚胎肾和大脑组织总 R NA ,
分别以 RT 一P C R 法扩增 GPR81 ( 94℃ 1m in , 6 0 ℃
30 5 , 7 2 ℃ 1 .Zm in , 3 2 个循环)和 G ila (94℃ lm in ,
5 5 ℃ 30 5 , 7 2 ℃ 1.Z m in , 3 5 个循环 ) , 并以分子克隆
手段分别构建重组质粒 Pc D N A3.l( 十 ) 一 G P R 81 和
peDN A 3.l( + )一 G i l a 。 以重叠延伸 pC R 扩增融合基
因 G PR 81一Gi l a 。 首先分别以重组质粒 pe D N A3. 1
( + )一G p R 8 1 ( 引物:pa‘ 、 p b ’ ) 和重组质粒 peDN A3.l
( + )一G i l a ( 引物:Pe ’ 、 Pd ’ ) 为模板 , 得到 G PR 81 和
Gi la , 再以两扩增产物混合物为模板 , 进行扩增(引
物:Pa‘ 、 P d ’ ) , 所得产物即为 G pR 81一G i l a 。
1
.
2
.
2 融合基因重组质粒 pFA STBael一G p R 8 1 一 G i l a
的构建 按照常规分子克隆操作 , 将融合基 因
G pR81一G i l a 亚克隆到 pFA STBael , 得到重组质粒
PFASTBael一G P R 8 1 一 G i l a 。
1
.
2
.
3 融合基因的转座及鉴定 按常规操作将
pFAsTBael一G p R 8 1 一 G i l a 或空质粒 pFA STB ael 转化
D H loBae , 形 成相应 的重组杆粒 pBaem id一 G p R 8 1 -
G i l a 或 pBaem id 。 采用通用引物 PU C F/ PUC R (表
l)对所得重组杆粒 pB aem id一 G p R 8 1 一 G i l a 进行 pC R
扩增鉴定 (94℃ 45 5 , 5 5 ℃ 4 5 5 , 7 2 ℃ 6 m in , 3 2 个循
环) 。
1
.
2
.
4 S fg 细胞的培养及转染 S份 细胞在 28 ℃ 的
培养箱空气中培养 , 每 3 一 4 d 传代一次 。 转染前
lh , 接种 9 x 10 5个/子L对数生长期细胞于 6 孔培养
板培养 , 按 TransFa st 试剂说明书步骤将杆粒 pBac -
m id一 G P R 8 1 一 G i l a 转染 S份 细胞 。 转 染后 sh 更换
Zm l新鲜培养液 , 继续培养72 h , 细胞病变明显说明
转染成功 。 此时收集培养上清 , 5 0 0 9 离心 sm in , 获
得澄清上清 , 即为重组杆状病毒母株 。
1
.
2
.
5 病毒扩增及效价的检测 按 1: 10 的体积
比 , 以重组杆状病毒母株感染 s份 细胞 (2 x 10 6个 )
进行病毒扩增 , 待感染细胞出现病变后 , 收集含扩增
病毒的感染上清 。 将上清进行 10 倍的等比稀释 , 得
到 10 一 ’ 一 10 一 8倍的起始病毒稀释液 , 分别感染 Sfg
细胞 , lh 后加人 Zml 以 2 x G ra ce ‘S 培养基配制的低
熔点琼脂糖 (0 . 8岁m L ) , 置 28 ℃ 培养 5d , 计数空
斑数量(以 3 一 9 个空斑为最佳计数范围) 。 依据以
下公式:效价(p何ml) 二 l/ 稀释倍数 x 空斑数 x l/
接种量(m l)/平板 ,算得效价高低 。
1
.
2
.
6 G P R 8 1
一
Gi l a 融合蛋 白的亲/疏水性分析
利用蛋白质跨膜螺旋预测服务器 TM pre d , e rv e r ( hi -
t P : / /
w
.
e
h
.
e m b
n e t
.
o r
g/
s o
ft w
a
re / T M P R E D
_
fo
rm
.
ht nil )
, 对 GPR 81一 Gi l a 融合蛋白的结构域进行亲/
疏水性分析 , 有助于了解基因融合后蛋白表达产物
的理化特性 。
1
.
2
.
7 W
e s t e rn
一
b l o t 检测 G PR 81一G i l a 的表达 以
扩增病毒上清感染 519 细胞 , 当感染细胞出现较明
显病变时 GPR 81一 Gi l a 蛋白应充分表达 。 此时 , 采
用膜/疏水蛋白双相分离系统提取感染细胞的膜总
蛋白(疏水蛋白)及亲水蛋白 , B ra nd fo rd 法对蛋白进
行定量 。 每例标本取总蛋 白50 此 上样进行 sD s-
PA G E 电泳 , 分离后电转移至 PV D F 膜上 , 封闭后 ,
加人一抗(羊抗人 Gi l 蛋白的多克隆抗体 , 1 : 8 0 )
和辣根过氧化物酶结合的二抗(兔抗羊 , 1: 4 0 0 )
孵育 lh , T B ST 洗涤后加人 EC L 显色试剂 , 曝光于
Kodak 胶片 。
1
.
2
.
8 G P R 8 1
一
Gi l a 蛋白表达条件的优化 为了使
融合基因能够在 Sfg 细胞中理想表达 , 我们分别对
重组病毒感染 5. 细胞时的感染强度 (m ul tiP lic its 。f
infe ct io
n ,
m oi
) 和感染时间进行了优化选择 。
1
.
2
.
8
.
1 感染强度的优化 感染强度 二接种病毒
上清的体积 (而) x 接种病毒效价 (p似ml)/总细胞
数 。 分别以不同的 m oi(1 、2 、 5 和 10)感染 sfg 细胞 ,
w
es te m
一
bl ot 检测融合蛋白的表达水平 。
1
.
2
.
8
.
2 感染时间的优化 以某一感染强度(根
据 m ni 优化结果选择 m ni 为 5) 的病毒上清感染 sfg
细胞 , 分别于感染后 24h 、4 8 h 、7 2 h 及 96h 收获细胞 ,
w
es te m
一
bl ot 检测融合蛋白表达水平 。
2 结果
2.1 人 GPR S一、 G i l a 基因扩增产物及其载体 peD -
NA 3 . 1 ( + ) 一G P R 8 1 、 p e D N A 3 . l ( + ) 一G i l a 的
鉴定
首先以 R T 一P C R 获得认 G PR 81 、 G i l a 基因 , 再将
它们分别亚克隆 Pc D NA 3.l( + )中 , 得到各 自的重
组载体 peD N A3. l ( + ) 一G p R 8 1 、 p e D N A 3 . l ( + ) -
G i l a
, 以重组载体位模板 , 有利于将 G Pnsl 和 G ila
融合 。 图 l 、图 2 显示 , G P R 8 1 、 G i l o P C R 的扩增产物
性物杖术通报 B 勿te c h n o lo舒 2008 年增刊
均为特异条带 , 约为 Ikb 左右 , 与理论大小吻合 , 应
为目的基因。 各自对应重组载体的酶切及 PCR 扩
增结果均表明 , C P R 81 及 Gi la 已分别成功克隆到载
体 peD NA 3.l( + )中。
卜10 1 2 3 4 5
h l、 1 2 3 4
2 0() 0
1 0() 0
5 (洲⋯幻
2 50 0
图3 融合基因 G PR81一Gi l a 的凝胶电泳分析
1.DNA M ar ker;2.PCR pro duetof GPR81;3.PCR pro duet of
Gila :4.PCR pro duerofGPR81一 G i l a fu s i o n g e n e
}一!, 1 2 3 4
图 1 G PR 81 基因及重组质粒
PeD N A3.l( + )一G P R 8 1 的鉴定
1.DNA M ark er;2.PCR prod uetfro m fetus kidney eDNA ;3.
PC R pnxl uet fro m peDNA3.l ( + )一G P R 8 1 : 4 p e D N A3 . l ( + ) -
G P R 8 1 / Hi nd m
+ 百。〕R l ;5 . p e D N A3
.
l ( + ) 一 C P R 8 1 / Hi nd m
5 0 0 0
2 5 ()()
} , r 1
.
2
.
3 斗 图4 重组质粒 pF AST B ac l一 G P R 8 1 一Gi l a 的鉴定
1. DNA M ark er;2. ASTBael一 G P R S 一Gil盯H ‘n d l + E e o R
I ; 3
.
p F A S T B ac l
一
G P R 8 1
一
G i l 盯Hi nd l ;4. PCR prod uet fI’O m
pFASTBael一 C P R 8 1 一G I I a
050
图2 G ila 基因及重组质粒 peDN A 3.l( + )一G i l a 的鉴定
1.DNA M ar ker;2.PCR produetfro m fetus bra in eDNA ;3.peD-
NA3.l( + )一 G i l a/ Hi nd m ; 4 . p e D N A 3 . l ( + ) 一G i l盯Bam H I +
Hi nd m
2 .2 G P R 8 1一 Gi la 融合基因的获得及其重组质粒
pFA STBae l一G p R 8 1 一 G i l a 的鉴定
电泳分析结果显示 , G P R 81 和 Gi la 两个基因
片段融合和的基因大小 约为 2.Ikb 左右 (图 3 ) , 与
理论值一致 。 测序结果也表明 , Pa ’与 Pd ’扩增的产
物确为 G PR 81 与 Gi la 融合连接的产物 。 酶切 和
pCR 结果证 实 , p F A S T B ae l 一G P R 8 1 一 G i l a 中含有插
入方向正确的 G PR 81一 Gi l a 融合基因(图4 )
2.3 重组杆粒 pBaem id 一G p R 8 1 一G i l 。 的鉴定
要使重组质粒 pFA STBael一 G P R 8 z 一 G I I。 成功转
座 , 即获得重组杆粒 pBaem id 一G p R 8 1 一 G i l 。 是实现融
合基因在杆状病毒表达体系中表达的前提 , 因此需
对重组质粒转化 D H IOBac 后的结果进行鉴定 。 因
杆粒的片段太大( > 135kb ) , 难以用常规的限制性
内切酶进行酶切分析 , 而 pU C/M 13 上下游扩增引物
(PU C F 、P U C R ) 分别与 Baem id 中 laeZ。 一互补区内
的 m in i一at tT n7 位点的两端相同 , 因此 , 在抗生素抗
性及蓝白斑筛选的基础上 , 外源基 因的插人 可从
PCR 产物的大小来判断 。 p F A S T B ac l 空质粒转座的
杆粒 PC R 扩增产物大小为 2.3kb 左右 , 而融合重组
杆粒pBaem id 一G p R 8 1 一G i l a 的 Pe n 的扩增产物大小
为 4 .4 kb 左右 , 与理论值符合(图 5 ) 。 表明融合基
因 G pR81一G i l a 已正确克隆到 Baem id 中 , 即成功构
建了重组杆粒 pB aem id一 G P R s l 一G i l a 。
2
.
4 G P R 8 1
一
Gi la 的氨基酸序列亲/疏水性分析
为了判断融合基因 G PR81 一 Gi l a 的结构特点 ,
我们借助软件对融合蛋白的亲/疏水性进行了分析 。
年增刊 吴芳明等:人 G PR81 一Gi l a 融合蛋白在杆状病毒系统中的表达及优化 153
50() 0
2500
图7 转染与非转染昆虫细胞对比图
图5 融合基因重组杆粒
pBaem id一G P R 8 1 一 G i l a 的 pCR 鉴定
1.D NA Mark er;2‘ P C R p ro d u e t fro m p B a e m i d ; 3 , P C R p r od u e t
fro
m p B
a e
m i d
一
G P R8 1
一
G i l a
{—-(infe《· 1 1 。,n t i m 。 2 4 h 4 8 h 7 2 h 9 6 h 一n in 卜ele d结果表明 , G P R 81 一 Gi l a 融合蛋白的氨基酸序列在GPR 81 范围内存在连续的 7 个疏水性跨膜区域(图上评分 > O ) , 在 Gi la 范围内有一个疏水性区段 , 提示 Gi la 在膜内侧通过部分序列靠近胞膜(图 6 ) 。 (n l . ,i ) 勺 IU图 8 G PR81 一G i l a 融合蛋白的 W estem 一b l o t 分析30(X)20() OI印洲〕
0
李一 1 0 0贪 一2 0 0
一3 (洲〕O
一 4《卫议〕
一5 (X 助
T m l)r。。1 .)一 I)一:l 肠r G F R 8 1一(; i l n :、, ,川 一11飞, { 。in吟画一 6 0 0 占 10() 200 30{) 40() 500 600 7的Theam inoa一id x z一ld)。r 。, f (二P R S I一〔;il n 卜1《, n l 一n )一。、 i n
图 6
2 .5
G PR81一Gi l a 融合蛋白氨基酸序列跨膜疏水性分析
G P R 8 1一 Gi l a 融合蛋 白在 Sfg 细 胞的表达及条
件优化
重组杆粒 pBaem id一 G p R 8 1 一G i l a 转染 Sfg 细胞
后 , 7 2 h 病变表现明显 , 即细胞变大变圆 , 折光性增
强 ,但增殖缓慢 , 符合杆粒感染后细胞的变化特点
(图 7 ) 。 W e s t e rn 一 b l o t 结果表明 , G P R 8 1 一 G i l a 可在sfg 细胞中成功表达 ,但该表达受感染强度 m oi 和感
染时间的影响 。 从图 8 可以看出 , 在 24 一 9 6h 的不
同感染时间过程中 , 感染 72h 时间点的融合蛋白表
达量最高;感染强度 m oi 在 1 一 ro 的范围内 , 当 m oi
为 5 时蛋白表达量为最高。 利用该优化条件 , 实现
了我们从 Sfg 工 程细胞株 中大量制备融合蛋 白
G PR81一Gi l a 的目的 , 能够满足 以该融合蛋 白开展
G PR81 的药理学和配基筛选研究 。
3 讨论
寻找 。G P C R S 的配基 , 即 oG PCR S “去孤儿化 ”
是其关键所在 , 而建立行之有效 的 oG PCRs 配基筛
检体系又是实现 “去孤儿化” 的前提 。 根据其 a 亚
单位的不同 , G 蛋 白可分为 G s 、 G i 、 Gq / 1 1 、 G 1 2 / 1 3
等几大类 , 当 G PC R S 被活化后 , G 蛋白通过其 。 亚
单位的构象变化来介导 G PC Rs 的功能 。 G P R 81 系OGPCR S成员之一 , 早期曾对其进行相关研究 , 发现
该基因序列与烟酸受体的同源性最高;在人体胚胎
多种重要器官或组织均有表达 ;同时建立 了适于该
受体的基于 CH O 工程细胞株的配基筛选方法 (结
果另文发表中) 。 为了完善其配基筛选体系及深化
对 G PR 81 的认识 , 首先运用重叠延伸拼接法(SO E )
获得 G PR81 一Gi la 融合基因 , 然后构建其杆状病毒表
达载体 , 使之在昆虫细胞中得以高效表达 , 从而制备
GPR S一G il。 表达蛋白用于 GP R 8 1 的进一步研究 。
S O E 法由于在构建融合基因时不需要限制性内
切酶及连接酶 , 可以避免引人限制性酶切位点时不
必要核昔酸序列的掺人 , 故可 以将基因片段精确地
连接 , 是构建融合基因的一种有效手段 。 S O E 法尚
需注意以下两点〔’〕:l 、应用高保真酶进行 PcR 扩增
最佳 。 由于 SO E 法需要进行多步 PC R , P C R 反应循
环数较多 , 很容易在 PC R 过程中发生突变 , 运用高
保真酶则可以尽最大可能防止在 PCR 过程 中的突
生物杖术通报 B to te ch no切gy 200 8 年增干IJ
变 。 2 、最好以含目的基因的重组质粒为模板 , 以降
低 PC R 反应的循环数 , 减少突变 。 本实验将 GPR81
基因序列 3 ’末端的终止密码子去除 , 代之以一个丙
氨酸作为二者的连接(hnk er )以增加其柔性 , 从而有
利于在配基活化受体后 G 蛋白迅速发生构象变化 ,
实现其信号转导效应 。 近年来 , S O E 法已成功用于
GpC R 与 G a 基因的融合[‘〕。
为使 GPR81一 Gi la 高效快速的表达 , 采用 BaC -
to 一 B ac 杆状病毒昆虫细胞表达系统 。 较之传统的
哺乳细胞表达体系 , 其最大优点是可快速构建重组
表达病毒 , 并以重组蛋白的高得量和低成本而备受
青睐 。 它主要利用辅助质粒 (H elper plasm id )提供
的转座功能 ,将外源基因插人到杆状病毒穿梭载体
Baem id 中 , 再将重组 Baem id D NA 转染昆虫细胞 , 即
可获得含有目的基因的重组病毒 , 该重组病毒携带
的目的基因尤其适于在昆虫细胞表达 。 加之 , 昆虫
细胞本身具有其它哺乳细胞表达的翻译后化学修饰
作用 , 包括糖基化 、脂肪酸酞化 、氨基末端乙酞化及
梭基末端乙酞化等〔’, 6 〕, 因此 , 保留了其所表达蛋白
产物应有 的抗原性与可溶性等特征 。 这将保障
GP R81一Gi la 融合蛋白在 G PR81 配基筛选及其它研
究中的成功应用 。
重组杆状病毒的感染强度和时间 , 是影响目的
基因在昆虫细胞中蛋白表达水平的重要因素 , 据此 ,
我们进行了 G PCR 一Gi l a 融合蛋 白表达条件的优化
选择 。 在本实验条件下 ,感染强度为 5 、感染时间为
72h 时 GPR 81一 G i l 。 蛋白表达量为最高(图 8 ) 。 利
用该优化条件 , 我们可从规模培养细胞中收获足量
的重组蛋白 ,加快 G PR81 的配基筛选及其它相关研
究 。
基于 OG PC Rs 表达工程细胞株的第二信使检测
体系是最常用的配基筛选策略 , 在 OG PCR s 的“去孤
儿化 ”研究中发挥了重要作用 。 本课题组亦曾成功
建立该筛选体系并用于相关 G PcR 的研究 〔’, 8 1 。 实
践表明 , 单一的 。G P C R s 配基筛选策略难以满足研
究的需要 。 因此 , 我们在已有 oG PC Rs 表达工程细
胞株检测体系的基础上 , 建立另一重要的 GPC R 一C a
融合蛋白筛选体系 , 使二者互为补充 。 后者较之前
者有如下优势:(1)Sfg 细胞适于大规模悬浮培养 ,
从而易于得到大量包含融合蛋白的膜制备;(2) 与
G PCR 作用的激动剂 、拮抗剂及部分激动剂易于 区
分;(3) 假阳性概率低【’] ; ( 4) 信噪比高 , 不容易受外
界因素干扰[’。〕。 这些优势使得该体系适于 G Pc Rs
配基的高通量筛选及药理学研究 。
参 考 文 献
1 刘永学 , 余少平. 中国药理学通报 , 2 0 3 , 1 9 ( 6 ) : 6 0 1 ~ 6 04 .
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V i ro l
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7 余少平 , 熊永炎 , 王琼 , 等. 中国药理学与毒理学杂志 , 2 0 4 , 18
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8 袁广胜 , 潘光堂 , 刘永学. 中国药理学通报 , 2 0 5 , 21 ( 7 ) : 81 8
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8 2 2
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