全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
收稿日期:2007-09-30
基金项目:国家“863”计划资助项目(2007AA02Z212)
作者简介:陈坤(1978-),男,山东聊城人,硕士研究生
通讯作者:路福平,教授,E-mail:lfp@tust.edu.cn
绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)最初是从水母 Aequoreavictoria中发现的[1],其相对分子量
为 27kD的单体发光蛋白受近紫外光(395nm)或蓝光(470nm)激发后,能发出波长为 510nm的绿色荧光[2]。
一系列研究证明,与 gfp重组的融合基因表达的融合蛋白同时具有 GFP的荧光性质和配体蛋白质的生物
功能,即使在用甲醛或戊二醛固定的细胞中,GFP的荧光也不受影响,适用于与其他荧光试剂同时进行双
标试验。GFP已广泛应用于报告蛋白、融合标记、生物传感器、pH检测传感器、蛋白间相互作用、胞内各器
官蛋白的传递等领域[3]。
自 Chalfie[4]等首次在 Science杂志上报道分别用 T7启动子和 mec27启动子成功地使 gfp在大肠杆菌
(E.coli)和线虫(C.elegans)两个异源宿主表达以来,gfp作为报告基因已被成功应用于原核、真核及动植物
研究中。gfp+基因是 A.victoria野生型 gfp基因的突变体,同等条件下,它产生的蛋白是野生型蛋白的 12
倍,对激发光的敏感强度是野生型蛋白的 320倍[5,6]。
采用 gfp+基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体 pBE2,构建成一个大肠杆菌-
以绿色荧光蛋白为报告基因的原核启动子检测体系构建
陈坤 黎明 高伟 路福平
(天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457)
摘 要: 以质粒pMUTIN-GFP+扩增获得的gfp+基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体
pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒 pBE2-GFP+。将组成型启动子P43和诱导型启动子Pspac克隆入
pBE2-GFP+,得到重组表达载体pBE-GFP-P43和 pBE-GFP-Pspac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。荧光显微镜检测
GFP+蛋白的表达情况。结果表明,2种不同类型的启动子均能在大肠杆菌BL21和枯草芽孢杆菌1A751中启动gfp+基因
的表达。
关键词: 绿色荧光蛋白(GFP+) 启动子活性检测 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体
ConstructionofProkaryoticPromoterFunctionAnalysisSystem
UsingGreenFluorescentProteinReportSystem
ChenKun LiMing GaoWeiLuFuping
(TianjinKeyLabofIndustrialMicrobiology,ColegeofBiotechnologyEegineering,TianjinUniversityofScience&
Technology,Tianjin300457)
Abstract: Thegfpgenesequencewasamplifiedfrom pMUTIN-GFP+byPCR.Byrecombinationofthegfp
PCR productandE.coli-B.subtilisshutlevectorpBE2,thevectorpBE2-GFP+ fuctionedaspromoteranalysiswas
constructed.Inthisstudy,weconstructedexpresionvectorpBE-GFP-P43andpBE-GFP-Pspacbycloningtheconstitutive
promoterP43 and inductive promoterPspacinto pBE2-GFP+,respectively.GFP+ protein wasexamined through
fluorescentmicroscopy.Itisindicatedthatthetwokindsofpromoterssuccesfulydrovetheexpresionofgfp+genein
bothE.coliBL21andB.subtilis1A751.
Keywords: Greenfluorescentprotein(GFP+) PromoterfunctionanalysisE.coli-B.subtilisshutlevector
2008年第2期
枯草芽孢杆菌双宿主启动子功能检测质粒,并利用组成型启动子 P43和诱导型启动子 Pspac[6]对此体系进行
了效能验证。
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
本实验所采用的菌株和质粒,见表 1。
表 1 供试菌株和质粒
※BacilusGeneticStockCentre,OhioStateUniversity,Ohio,USA
1.2 培养基
LB液体培养基用于细菌培养。筛选培养基为分别含 100μg/ml氨苄青霉素和 30μg/ml卡那霉素的 LB
琼脂培养基。枯草芽孢杆菌转化培养基用 GMI、GMI培养基[8]。
1.3 工具酶和试剂
限制性内切酶、T4DNA连接酶及 TaqDNA聚合酶购自 TaKaRa公司。DNA片段回收试剂盒、核酸分子
量标准、IPTG、氨苄青霉素和卡那霉素均购自北京博大泰克公司。DNA引物合成与测序由 Invitrogen公司完
成。
1.4 DNA的提取及操作
质粒的快速提取及检测以及 DNA的酶切、连接、大肠杆菌感受态的制备及转化按分子克隆[9]所述方法
进行。枯草芽孢杆菌转化参照 Spizizen法[8]。
1.5 PCR引物
如表 2所示,引物 P1和 P2用于从 pMUTIN-GFP+扩增 gfp基因序列,启动子 P43和 Pspac分别由 pWB980
和 pMUTIN-GFP+扩增获得,所用引物分别为 P3、P4及 P5、P6,P7和 P8用于从 pET22b(+)中扩增 lacI基
因。
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
1.6 荧光检测[10]
挑取阳性重组转化子于相应固体培养基上划线,过夜培养,用无菌磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate
BuferedSaline,PBS)溶液浸洗数分钟,然后用 OlympusBH2荧光显微镜在 365nm波长下进行荧光检测,同
时用 Nikon相机拍照。
2 结果与分析
2.1 重组质粒 pBE2-GFP+、pBE-GFP-P43、及 pBE-GFP-Pspac的构建
用 BamHⅠ和 EcoRⅠ分别对质粒 pBE2和扩增所得 gfp基因片段进行双酶切,酶切产物经琼脂糖电
泳,切胶回收 DNA片段。2个回收产物以 T4DNA连接酶于
12℃连接过夜,连接产物转化 E.coliDH5α,涂布于含 100mg/ml
氨苄青霉素的 LB琼脂培养基。通过双酶切和 PCR验证获得阳
性转化子,命名为 pBE2-GFP+(图 1)。
同理,将扩增所得启动子 P43、Pspac和 lacI分别插入重组质
粒 pBE2-GFP+的 gfp基因上游位点,获得重组质粒 pBE-GFP-P43
和 pBE-GFP-Pspac。
2.2 重组质粒的转化
将构建好的质粒 pBE-GFP-P43和 pBE-GFP-Pspac导 入 B.
subtilis1A751和 E.coliBL21,形成基因工程重组菌 1A751
(pBE-GFP-Pspac)、1A751(pBE-GFP-P43)、BL21(pBE-GFP-P43)和
BL21(pBE-GFP-Pspac)。
2.3 质粒遗传稳定性检测
将携带重组质粒的重组菌株在无抗性 LB液体培养基中传
代 30代后,稀释涂布于 LB平板培养,挑取单菌落,分别随机挑取 50个单菌落点接于相应氨苄青霉素和卡
那霉素抗性平板上,发现均带有相应抗性。实验表明,重组质粒均能在相应受体菌中稳定遗传。
2.4 重组菌的荧光检测结果
将携带有重组质粒 pBE-GFP-Pspac的 B.subtilis1A751和
E.coliBL21,分别涂布于含有 IPTG的卡那霉素和氨苄青霉素
LB固体培养基,37℃,过夜培养。将含有 pBE-GFP-P43的
1A751和 BL21,分别涂布于含卡那霉素和氨苄青霉素 LB固
体培养基,37℃,过夜培养。
以上培养物各用 0.01mol/LPBS浸洗数分钟。在荧光显微
镜下均可观察到较明亮的绿色荧光(图 2)。
表 2 本实验所用引物
图 1 重组质粒 pBE2-GFP+的构建
图 2 gfp在重组菌中的表达
1.1A751(pBE-GFP-Pspac) 2.1A751(pBE-GFP-P43)
3.BL21(pBE-GFP-P43) 4.BL21(pBE-GFP-Pspac)
附加序列(酶切位点前序列和酶切位点下划体以示明)
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(上接第183页)
这一研究成果为进一步探讨该靶向治疗癌症药物打下基础,并且扩大了其应用范围,为其在抗肿瘤应
用方面开创了新的思路。在未来的肿瘤化疗发展中,可以预计除了细胞毒类的传统化疗药物会继续发展
外,针对分子靶点的新一代抗肿瘤药物将凭借其特异性与靶向性,在抗癌治疗中发挥重要作用,成为抗癌
治疗的主要方向。
参考 文献
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由上述结果可以看出,无论组成型启动子 P43,还是诱导型启动子 Pspac,均能启动 gfp基因在 1A751和
BL21中的表达,说明构建的重组载体 pBE-GFP+具有较好性能,并有较广泛的适用性。
3 讨论
GFP蛋白具有较高的检测灵敏度,结果直观,在多种生物体中均能正确表达和折叠,这些优点使得它
逐渐广泛用于基因启动子及调控序列的研究。采用经遗传改造的 gfp基因突变体 gfp+为报告基因,其蛋白
产物 GFP+的灵敏度大大高于野生型基因蛋白产物。构建所用质粒 pBE2同时具有 pUB110和 pGEM3的复
制起始位点,且在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均具有较高的拷贝数。因此,该检测体系可以实现在两种不同
类型原核生物中表达绿色荧光蛋白的目的,具有较广泛的适用性。
通过对两种不同类型启动子组成型启动子 P43和诱导型启动子 Pspac的检测,确认构建所得 pBE2-gfp+
启动子检测体系在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均能得到很好应用。
参考 文献
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