全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 5期
运用酶切自连法分析鉴定肺炎链球菌体内诱导基因
庞丹
王虹
尹楠林
杨晓亮
胥文春
尹一兵
张雪梅
(重庆医科大学医学检验系 教育部重点实验室,重庆 400016)


摘
要:
肺炎链球菌是严重侵袭性感染和上呼吸道感染最重要的条件致病菌之一,分析鉴定体内诱导基因序列变得尤
为重要。本研究利用酶切自连法成功从 129个体内诱导表达的肺炎链球菌中获得 13个融合重组自杀质粒, 通过与肺炎链球
菌株 T IGR4基因组序列的同源性比对, 共得到 10个不同的体内诱导基因,其中 8个是从血液中筛选出的, 另 2个为从肺组织
中筛选出; 通过分析得到 18个开放阅读框, 其中大部分为已知功能基因, 参与细菌多种生命活动, 有 2个为未知功能基因,编
码假想蛋白。可见, 酶切自连法可有效用于筛选基因的分析鉴定。
关键词:
酶切自连法 自杀质粒 肺炎链球菌 体内诱导基因
Analysis and Identification of in vivo Induced Genes of
Streptococcus pneumuniae by Enzyme Self
ligationM ethod
Pang Dan W angHong Y in Nanlin Yang X iao liang XuW enchun Y in Y ib ing Zhang Xuem ei
(K ey Laboratory of D iagnosticM edicine D esignated byM inistry of Education, ChongqingM edical University, Chongqing 400016)


Abstrac:t
S trep tococcus pneumoniae is one o f themost im portant opportun istic pathogenas wh ich can lead to ser ious invasive infec

tion and upper resp ira to ry trac t infection. Thus, it becam e im portant to ana lysis and identification of in vivo induced genes sequences. In
this study, the recomb inant su ic ide plasm ids were harvested by enzyme self
ligation m ethod, and sequenced to obta in the in vivo induced
genes sequences, the functions o fwh ich w ere predicted by bio in fo rma tics ana lysis. 13 recomb inant suic ide plasm ids, from the 129 individ

uals w ith in the inducib le expression o fS trep tococcus pneumoniae, were ha rvested. A tota l of 10 d ifferent in vivo induced genes w ere ob

ta ined by b lasting w ith strep tococcus pneumuniae T IGR4 genom e sequence, 8 o fwh ich are screened out from the blood, wh ile the other two
from the lung tissuesw ere screened. By analyzing the ava ilable 18 open read ing frames, m ost o fwh ich are known functiona l genes invo lved
in a var iety o f life activ ities of bacte ria. There were two genes o f unknown function, encoded hypothetica l pro teins. The study proved that
the enzyme self
ligation method can be e ffective ly used to analysis and identification o f screened gene fragm ents.
Key words:
Enzym e Se lf
ligation m e thod
Su icide p lasm id
S trep tococcus pneum uniae
in vivo induced genes
收稿日期: 2009
12
16
基金项目:国家自然科学基金面上项目 ( 30970110)
作者简介:庞丹,硕士研究生,主要从事肺炎链球菌毒力因子致病机制研究; E
m ai:l pangdan651@ 163
com
通讯作者:张雪梅, E
m ai:l apoe@ 163
com
肺炎链球菌是严重侵袭性感染和上呼吸道感染
最重要的条件致病菌之一,随着耐药率的增加,使得
肺炎链球菌感染的治疗面临越来越大的困难。因
此,要想彻底解决肺炎链球菌的感染,还需要深入了
解肺炎链球菌的致病机制。
目前,人们对一些毒力因子, 如溶血素、表面粘
附蛋白、自溶素等, 已经研究很多年, 但还远不能彻
底解释肺炎链球菌的毒力变化,有很多潜在的毒力
基因还有待发现和研究。在先前的研究工作中,成
功构建了可用绿色荧光蛋白报告的筛选特定条件下
肺炎链球菌基因表达的启动子诱捕文库 [ 1] , 利用荧
光激活细胞仪分选 ( fluorescence
act ivated cell sor

ting, FACS)收集小鼠体内有荧光表达的细菌, 那些
随着荧光蛋白表达的基因即为体内诱导基因, 其与
细菌在体内的毒力表现密切相关。
为了鉴定肺炎链球菌在小鼠体内被诱导表达的
这个 X基因片段,必须使整合到染色体上的重组自
杀质粒重新脱落环化。应用酶切自连法,使整合到
2010年第 5期 庞丹等:运用酶切自连法分析鉴定肺炎链球菌体内诱导基因
染色体上重组自杀质粒脱落下来并重新环化, 通过
质粒通用引物可对 X基因序列进行测序, 即得到体
内诱导基因序列片段。再通过 BLAST进行同源性
分析,最终鉴定这些体内诱导表达的基因。为开发
新型抗菌药提供作用靶点和为研发蛋白质疫苗提供
候选蛋白。
1
材料和方法
1
1
材料
1
1
1

菌株和质粒 可用 GFP报告肺炎链球菌
基因表达的肺炎链球菌菌株库,其染色体上整合了
pEVP3
X
SDGFP重组质粒, 本室已经构建; 大肠杆
菌菌株 H5
。
1
1
2
培养基 C + Y半合成培养基, 含 0
5%
Y east提取物,用于肺炎链球菌的培养; TSA血平板,
含 5%羊血和 2
5
g /mL 氯霉素,用于转化后肺炎
链球菌的筛选; LB培养基,氯霉素终浓度为 25
g /
mL,用于 DH5
(含 pEVP3)的培养。
1
1
3
试剂 DNA限制性内切酶、DNA连接试剂
盒购自 T aKaR a公司。细菌 DNA提取试剂盒、胶
回收及质粒提取试剂盒均购自上海华舜生物工程
有限公司。 pEVP3
X
SDGFP单向测序引物 P1: 5


CCCACTTTATCCAATTTTCG
3
;质粒通用引物 P2:
5

GTTGAAACTGCTGGTGCTCTTAA
3
; P3: 5


TGCTTTCACTTTATTATCTTGG
3
[ 1]。由上海生工
生物工程技术公司合成。
1
2
方法
1
2
1
含体内诱导基因的 S. pn染色体 DNA的提
取 将前期 FACS分选出的小鼠体内具有荧光的细
菌 [ 1] ,铺到带有氯霉素抗性血平板上培养, 24 h后
分别挑取有轻度溶血环、肚脐样的菌落接种于C+ Y
培养基中增菌,在对数生长期中晚期收集细菌,采用
上海华舜生物工程有限公司的细菌 DNA提取试剂
盒提取细菌 DNA。
1
2
2
BamH I酶切含体内诱导基因的 S. pn染色
体 DNA 酶切体系 20
L, 包括 10
K buffer 2

L; BamH I1
L; DNA 5
L; ddH2O 12
L。酶切条
件是 30
, 2- 3 h。过柱纯化酶切产物。
1
2
3
酶切片段的自身环化 采用 TaK aRa公司
的 DNA连接试剂盒, 先取出试剂盒中的 Solution I
置于冰上融化,按以下连接体系加入各反应成分:酶
切片段 5
L, So lut ion I 5
L,充分混匀, 16
过夜。
1
2
4
大肠杆菌 DH5
感受态细胞的制备及保存
- 70
取出 DH5
一支, 取 50
L加入约 3 mL LB
培养基中, 振荡过夜。取 500
L培养物加入盛有
30mL LB的三角烧瓶内,剧烈振荡 2 h,直至OD600 =
0
4时取出, 立即置于冰上 10 m in。 4
, 4 500 r /
m in, 离心 10m in。弃上清,使残液流尽,并保持细胞
处于冰冷状态。重悬细胞于 15 mL冰冷的 0
1%
CaC l2 (新鲜配制 )中,冰浴 30 m in。 4
, 4 500 r /m in,
离心 10m in。彻底弃上清, 重悬细胞于 3 mL冰冷的
0
1% CaC l2,置于冰上,备用。
1
2
5
转化大肠杆菌 DH5
感受态细胞,进行酶切
和自身环化 同时做阴性和自身环化对照,热休克后
直接铺于含 25
g /mL氯霉素的 LB平板上, 37
孵
育 24 h,计数平板上的菌落。挑取平板上生长的菌
落,于含 25
g /mL氯霉素的 LB培养基中增菌, 提取
质粒,并送上海生工生物工程技术公司测序。技术路
线见图 1。
图 1
酶切自连法示意图
1
2
6
简单的生物信息学分析 采用 NCBI的
BLAST软件和 ORF Finder软件对测序正确的基因进
行功能的初步分析。
127
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 5期
2
结果
2
1
酶切自连法获得含体内诱导基因的重组质粒的
克隆
由于 DFI筛选到的体内诱导基因和报告基因是
连同质粒一起整合在细菌染色体上的, 为了获得它
们的克隆,必须将质粒从染色体上脱落下来,采用酶
切自连法,分别对所筛出的 129个整合了 PEVP3
X

SDGFP菌株的染色体 DNA进行酶切和自身环化,
获得了 13个重组质粒, 成功率为 10%。利用质粒
通用引物 P2、P3可 PCR扩增出目的片段 X, 其大小
在 100- 1 000 bp之间,如图 2。
1. M ark er; 2.阴性对照; 3. DFI18;
4. DF I21; 5. DFI03; 6. DFI13; 7. DFI09
图 2
酶切自连法连接片段 PCR结果
2
2
测序
由于带有随机片段的重组质粒是以插入复制的
方式整合到染色体上的, 复制的基因片段正好在质
粒测序引物 P1的下游, 因此用 P1对插入片段进行
了单向测序,分别测出 13个质粒的 X序列,筛出的
DFI03片段的测序结果如图 3。运用 DNAssist软件
将该序列与肺炎链球菌 T IGR4菌株基因组进行比
对, 结果如图 4所示。
2
3
肺炎链球菌体内诱导表达基因片段的生物信
息学分析
2
3
1
BLAST同源性分析 应用 BLAST在线分析
软件对这些基因片段与 T IGR4全基因组序列进行
同源性分析,其中有 3个片段序列是重复,因此共得
到 10个不同的体内诱导基因片段序列, 其中 8个基
因片段为血液中筛选得到的, 另 2个基因片段为肺
组织中筛选得到的。
图 3
DFI03测序结果
图 4
DFI03片段与肺炎链球菌 TIGR4比对结果
128
2010年第 5期 庞丹等:运用酶切自连法分析鉴定肺炎链球菌体内诱导基因
2
3
2
开放读码框及启动子查找、基因功能分类
应用在线开放读码框及启动子查找软件, 找出体内
诱导表达的各基因片段对应的 T IGR4基因组中相
邻基因上游可能的启动子序列,根据上游启动子序
列的有无分析各基因片段所处的操纵元结构, 找出
该基因上游启动子所启动表达的所有结构基因,结
果见表 1。
表 1 DFI筛选的在体内诱导的
肺炎链球菌启动子情况一览表
菌株号 T IGR4基因 基因组成和功能
DFI03 SP_0321a
ORF1: PTS system, IIA com ponen t
( AAK74497 )
SP_0322a
ORF2: g lucu ronyl h yd rolase
( AAK74498)
SP_0323a
ORF3: PTS system, IIB com ponen t
( AAK74499 )
SP_0324a PTS
EII ORF4: PTS system, IIC com ponen t
( AAK74500 )
SP_0325a
ORF5: PTS system, IID com ponen t
( AAK74501 )
SP_0326a yajC
1 ORF6: p rep rotein translocase, YajC
subun it ( AAK74502)
SP_0327a
ORF7: hypothet ical protein
( AAK74503 )
DFI09 SP_0454b hypoth etical protein (AAK74615)
DFI13 SP_1800
putative tran scrip tional activator
( AAK75873 )
DFI18 SP_2099 pbp1 b
pen icil lin
b inding p rotein 1B
( AAK76158 )
DFI21 SP_1623
cat ion
t ransport ing ATPase, E 1
E2
fam ily ( AAK75703)
DFI23 SP_0463
ORF1: cellw all su rface anchor fam i ly
protein ( AAK74623)
SP_0464
ORF2: cellw all su rface anchor fam i ly
protein ( AAK74624)
DFI25 SP_0716
putative transcript ional regulator
( AAK74857 )
DFI28 SP_1997 C of fam ily p rotein (AAK76064)
DFIL7 SP_0251
form ate acety ltransferase, putative
( AAK74430 )
DFIL9 SP_1615 recP
1 ORF1: tran sketolase( ABC75802)
SP_1616
ORF2: ribu lose
phosphate 3
ep im e

rase fam ily p rote in (AAK75697)


a. Promoters or gen es induced in blood of S. pn eum oniae[ 5] ; b. Pro

moters or gen es induced in blood[ 6]
对所鉴定的小鼠体内表达的 10个基因片段进
行分析,总共发现 18个开放阅读框。从小鼠血液中
筛选到的 8个基因中,有 6个为已知基因,包括参与
糖代谢的磷酸酶转移系统基因 PTS
EII、编码细胞壁
表面锚定蛋白的基因、与细胞壁合成有关的 pbpB、
水解卤酸的基因、参与离子转运和代谢的基因以及
调控转录激活的因子。另有 2个为编码假想蛋白的
未知功能基因 ( DFI03、DFI09)。而从小鼠肺组织中
筛选到的 2个基因为已知基因, 分别通过转移甲酸
乙酰基团和酮醇基团,参与糖类代谢。
3
讨论
DNA克隆是微生物功能基因组功能研究中最
为基础和关键的一步,传统的克隆 DNA大片段的方
法存在操作复杂、效率低, 甚至无法成功克隆等缺
点, 从而限制对基因簇等 DNA大片段的功能分析,
而酶切自连法,恰恰克服了传统的克隆 DNA大片段
的方法的操作复杂, 效率低等这些缺点。有文献报
道, 利用其布鲁氏菌全基因组序列,结合同源重组和
酶切自连法, 克隆出布鲁氏菌的 v irB操纵子, 该操
纵子含有 11个 OFR S, 长 11 kb, 并经验证克隆成
功 [ 7]。采用酶切自连法对体内诱导基因片段进行
了克隆。由于 BamH
是质粒 pEVP3上的单酶切位
点,而在重组肺炎链球菌染色体 DNA上随机分布有
BamH
的识别序列, 用 BamH
酶切后, 含有质粒
pEVP3序列和体内诱导基因序列的片段互补, 可以
在 T4连接酶作用下,自身环化 (分子内连接 ), 转化
到大肠杆菌 DH 5
, 通过质粒上的氯霉素抗性标记
就可以筛选出连接上的质粒。该法通常的成功率大
约为 2% [ 4] ,通过这种方法从所筛出的 129个整合
了 EVP3
X
SDGFP菌株, 获得了 13个带有 X片段
重组质粒,效率达到 10%, 效率较高。值得注意的
两个关键点: ( 1)内切酶的选择:目的基因的操纵子
和自杀质粒不能含有所使用酶的酶切位点, 且在目
的基因的附近应该含有酶切位点。 ( 2)目的基因片
段大小合适:片段过长不利于质粒的自身环化,得不
到阳性克隆;片段太小, 其特异性低, 测序之后也不
能确定其属于哪个特异的基因。本研究采用的是
PEVP3质粒,该质粒只含有一个 BamH I的酶切位
(下转第 134页 )
129
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 5期
细胞, 这些结果提示, ODC反义 RNA可有效抑制
Jurkat细胞的分裂。由于多胺对染色体形成正确的
结构以及 DNA的半保留复制均有重要的作用, 同时
对细胞周期也有重要影响 [ 9, 10] ,本研究中反义 RNA
对 ODC活性的抑制进而降低细胞内的多胺含量,可
能是其细胞周期抑制的基础。
药物敏感性分析发现, 当用 DFMO处理对照细
胞和 ODC反义 RNA稳转细胞时, 后者对药物的敏
感性显著高于对照细胞。DNA片段化分析结果也
发现,反义 RNA抑制 ODC表达后,细胞更易发生凋
亡。上述结果虽然提示, ODC化学抑制剂和 ODC
反义 RNA之间存在协同作用,但其机制尚不完全清
楚,有待今后进一步深入研究。
参 考 文 献
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223.
(上接第 129页 )
点,因此选择 BamH I至少可以不会把质粒切断,而
BamH
的酶切位点散在分布在肺炎链球菌基因组
上,这使大部分酶切下来的片段大小在 200- 1 000
bp之间, 即有利于酶切后自身环化, 也使测序片段
序列的特异性足以鉴定其基因归属, 因此本研究的
成功率较以前有所提高。
本研究通过酶切自连法分析鉴定出一批可能与
肺炎链球菌感染致病相关的基因, 为肺炎链球菌感
染的防治研究提供新的试验依据, 同时建立了一个
分析鉴定筛选基因的良好的方法平台, 可供其它相
关试验借鉴。
参 考 文 献
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