全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
大足黑山羊性激素结合球蛋白基因的克隆与
多态性分析
谭颖 1 王凭青 1 何腾龙 1 储明星2 邓腊梅 1
樊奇 1 张宝云 1 刘重旭 1
( 1重庆大学生物工程学院,重庆 400030; 2中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传
资源与利用重点开放实验室,北京 100193)
摘 要: 性激素结合球蛋白 ( sex hormone binding g lobulin, SH BG )是广泛存在于哺乳动物血清中的糖蛋白, 血清 SHBG
可结合与转运性激素, 从而在一定程度上控制血清性激素浓度, 血清性激素浓度将会影响体内促黄体激素 /促卵泡激素比率,
最终影响排卵性能。以大足黑山羊基因组 DNA为模板,通过 PCR扩增, 克隆测序等方法获得 SHBG基因序列, 经 DNAMAN
软件与 BLAST比对分析其单核苷酸多态性 ( sing le nucleotide po lym orphism s, SNPs)。结果发现, SHBG基因内含子 4中有两处
突变 ( A215G、G607A ),外显子 5中有一处无义突变 ( A733G ), 外显子 7中也有两处无义突变 ( A371G、A380G )。通过染色体步
移获得了 1 190 bp的 SH BG基因 5 端调控区序列,启动子预测分析显示此基因没有 TATA盒和 CCAAT盒, 也没有发现人 SH
BG基因多态性研究中发现的 TAAAA重复序列。本研究结果有望为大足黑山羊 SH BG基因多态性与繁殖力的关系提供科学
依据。
关键词: 性激素结合球蛋白 大足黑山羊 TAAAA重复 染色体步移 单核苷酸多态性
Cloning and Polymorphism Analysis of Sex Hormonebinding
G lobulin Gene in DaZu B lack Goat
Tan Y ing
1 W ang P ingqing1 H e Tenglong1 Chu M ingx ing2 Deng Lame i1
Fan Q i
1 Zhang Baoyun1 L iu Chongxu1
(
1
Bioengineer ing College of Chongqing University, Chongqing 400030;
2
The K ey Laboratory of Farm Animal Genetic R esources and
Utilization of M inistry of Agriculture, Institute of A nimal Science, Chinese A cademy of Agricultural Sciences, B eijing 100193)
Abstrac:t Sex horm one b ind ing g lobu lin is a k ind of g lycoprote in that ex ist in m amm a lian serum, wh ich can dom inate the serum
sex hormone concentra tion to som e ex tent by com bine and tanspo rt sex ho rmone, fina lly influencing mamm a l ovulatory pe rfo rm ance due
to sex ho rm one s g rea t influence to lu teinizing horm one / fo llic lestim ulating horm one ratio. In th is study, w e obta ined the sequences of
SHBG gene by PCR, gene clon ing and sequenc ing, and the sing le nucleotide po lymo rph ism s ( SNPs) of SHBG genew ere detected by se
quence analysis ( BLAST and DNAMAN) in DaZu Black Goat. Sequenc ing revealed two m utations ( A215G, G607A ) in the intron 4,
one nonsense muta tion ( A733G ) in the exon 5 and two nonsensemu tations ( A371G, A380G ) in the exon 7. W e obta ined the 5! regu
latory reg ion ( 1 190 bp) of SH BG gene by genom ewa lk ing. The prom oter pred iction revealed that 5 regulatory reg ion o f SHBG gene has
no TATA box and CCAAT box, nor d id the TAAAA repea t sequence that has been repo rted in hum an SHBG gene. The result o f our
study may contr ibute to explain the assoc ia tion between the SNPs o f SH BG gene and fecundity scientifically in DaZu B lack Goa t.
Key words: SHBG DaZu B lack Goa t TAAAA repea t sequence Genom e w alking SNP
收稿日期: 20100719
基金项目:国家现代农业产业技术体系建设专项 (农科教发 [ 2008] 10号 ),重庆市自然科学基金重点项目 ( CSTC, 2009BA1066 )
作者简介:谭颖,女,硕士研究生,研究方向:分子遗传学; Em ai:l tyche. tony@ 163. com
通讯作者:王凭青,男,教授,博士,研究方向:分子遗传学; Em ai:l w ang_pq@ 21 cn. com
性激素结合球蛋白 ( sex ho rmone b ind ing g lobu lin, SHBG )是肝脏产生的糖蛋白, 存在于大多数哺
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
乳类动物血浆中,其生理功能是特异性地结合和转
运性激素 [ 1]。 SHBG与性激素结合而避免性激素被
血管吸附、生物和化学的破坏以及快速降解,从而调
节着性激素的生物活性,已有研究证明 SHBG与多
囊性卵巢综合症 ( po lycystin ovarian syndrome, P
COS)、雄激素过多症等多种疾病的病理、生理状态
有着密切的关系 [ 2, 3 ]。另外, SHBG可通过与组织
细胞表面的特异受体结合介导和直接激活腺苷酸环
化酶系统,从而调节组织细胞功能 [ 4] ; 低 SHBG还可
作为糖尿病的发病和胰岛素抵抗的预测指标 [ 5, 6 ]。
人 SHBG基因编码区位于第 17对染色体短臂
( p12213) ,由 8个外显子和 7个内含子组成, 长约 3
kb
[ 7]。其中第一个外显子编码有 29个氨基酸残基的
信号肽。终止于单体多肽链的 G ln8,以下各外显子依
次终止于 Thr88、Gln102、Pro156、A rg209、G ln255、
Pro324和 H is373。第 4个外显子编码激素结合域;第
7个编码的肽段对整个分子的构象起稳定作用 [ 8]。
牛 SHBG基因含 9个外显子和 8个内含子, 但外显子
1为非编码区。目前已研究过的物种中未发现 SHBG
基因启动子区域有 TATA盒与 CCAAT盒。
最近研究发现, SHBG基因 5 非翻译区启动子中
存在着重复次数范围为 6- 11次的五核苷酸重复多
态 ( TAAAA) n [ 9] ,且 SHBG基因转录活性与此重复多
态的重复次数相关 [ 10 13 ], 故此多态可以反映血液循
环中的 SHBG水平,且与性激素水平相关。而基因产
物 SHBG是调节体内雄激素水平、活性和雌雄激素比
例的重要蛋白, 同时还是重要的信号分子, 在卵泡等
生殖细胞发育成熟中起重要作用 [ 1 4 ]。山羊的 SHBG
基因序列还未见报道,国内外也还没有关于山羊 SH
BG基因多态性对基因功能及其对山羊繁殖性能影响
的研究,所以基于分子标记辅助的动物基因工程育种
亟待山羊 SHBG基因的多态性研究。
本研究旨在获得山羊 SHBG基因序列, 分析该
基因的单核苷酸多态位点 ( SNPs)。并设计通过染
色体步移技术获取到 SHBG基因 5 端上游调控区序
列, 分析该区域的多态性及启动子元件构成对基因
功能的影响。为进一步研究该基因与山羊繁殖力性
状的关系及动物基因工程育种奠定理论基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试验材料 试验所用材料为西南地区的山
羊品种大足黑山羊 50只。采样为颈静脉采血法,
10mL /只,抗凝剂为柠檬酸葡萄糖, 采集的血样冻
存于 - 20∀ 下。采用酚 -氯仿抽提法提取山羊基因
组 DNA并溶于 TE buffer( 10 mmo l/L TrisHC l( pH
80), 1mmol /L EDTA ( pH 8. 0) )中, 4∀ 保存。
1. 1. 2主要试剂 蛋白酶 K ( Prote inase K ): 德国
Merck公司;琼脂糖胶回收试剂盒: 购自宝生物工程
(大连 )有限公司; GenomeWa lk ing K i:t购自宝生物工
程 (大连 )有限公司;克隆使用的菌株 DH5和载体
( pUMT)均购自天根生化科技 (北京 )有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1引物设计 根据 G enB ank中已登录的牛 SH
BG基因全序列 ( GenBank登录号: NM _001098858),
使用 O ligo 6. 0设计 3对引物扩增山羊 SHBG基因,
北京六合华大基因科技股份有限公司负责引物合
成, 3对引物的序列、扩增区域和产物大小见表 1。
根据牛 SHBG基因 mRNA序列, 按照染色体步
移试剂盒嵌套引物设计原则设计 3条特异性步移引
物, 引物序列见表 2。
表 1 用于扩增山羊 SHBG基因的 3对引物序列、扩增区域和产物大小
引物 引物序列 ( 5 - 3 ) 扩增区域 产物大小 ( bp)
P1
F: GAT CTC CTC CTC TTT TGA GTT TCG
R: CGG CAA CCG GAG GTC AGA G 外显子 4、5,内含子 4 811
P2
F: TCC TCT GCA TCT TCC CTC
R: TTG ATC TTG GAG GTG GAT G 外显子 6、7,内含子 6 446
P3
F: AAA GTG GTG TTG TCT TCT TCT G
R: GGA GGT TCT TAG GTG GGG AT 外显子 8、9,内含子 8 635
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2010年第 10期 谭颖等:大足黑山羊性激素结合球蛋白基因的克隆与多态性分析
1. 2. 2 普通 PCR扩增 使用表 1所示的 3对 PCR
引物, PCR体系为 10 #Taq Buffer(含 Mg2+ ) 2. 5 L,
2. 5mmo l /L dNTPs 1. 0 L, 2. 5 U /L Taq DNA聚
合酶 0. 5 L, 上下游引物各 1 L, ddH 2O 16 L,
DNA模板 3. 0 L。于 PCR仪中按照反应程序:
94∀ 5m in, ( 94∀ 30 s, 60∀ 30 s, 72∀ 1 m in) # 35
cyc le, 72∀ 10 m in, 4∀ 下保存。
表 2 用于扩增山羊 SHBG基因 5 端调控区的 3条引物
引物 引物序列 ( 5 - 3 )
Sp1 GTAGGAAAGAGCTGGAGGTCTTGG
Sp2 CTGGGTGGGCTGAAATGGGTGAAT
Sp3 TAACTCGGACGAGAAAGCCTCTGC
1. 2. 3 热不对称 PCR ( TA ILPCR )扩增 以 AP4
Primer作为上游引物, 分别以 SP1、SP2、SP3 Primer
作为下游引物, 按照 Genome Wa lk ing K it体系要求
进行 3轮热不对称 PCR ( TA ILPCR )反应, 可得到
SHBG基因 5 端上游调控区序列扩增产物。
1. 2. 4 SHBG基因的克隆及序列测定 PCR产物
使用 1. 5%琼脂糖凝胶进行检测, 取特异性较好产
物用的琼脂糖胶回收试剂盒 (宝生物公司 )回收纯
化。然后将 PCR产物与 pUM T载体在 16∀ 下连接
30 m in, 转化大肠杆菌 DH5,经蓝白斑筛选,挑取白
色阳性克隆菌落接种于 1 mL(含 1 L Amp)的 LB
液体培养基中, 37∀ 振荡摇菌过夜, 220 r /m in, 待培
养液浑浊后,取 3. 0 L做模板,以对应引物按照常
规 PCR反应体系进行扩增, TA ILPCR扩增产物克
隆菌液使用 M13通用引物按照常规 PCR反应体系
进行扩增,扩增产物使用 1. 5%琼脂糖凝胶鉴定,取
鉴定成功的阳性克隆样本菌液送交北京六合华大基
因科技股份有限公司测序,为保证序列的准确性,消
除测序误差,每个样本的克隆产物测序 3次。利用
DNAMAN软件并通过 NCB I网站的 BLAST对所测
定序列进行比对分析。
2 结果
2. 1 PCR扩增
对不同山羊品种的基因组 DNA进行 PCR扩
增, 所得 PCR产物用 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测
(图 1)。由图 1可见, 引物 p1、p2、p3扩增片段与目
的片段大小一致并且具有较高的特异性,可用于克
隆测序。
1.引物 p1扩增产物; 2.引物 p2扩增产物;
3.引物 p3扩增产物; M. 600 bp DNA M arker
图 1 引物 p1、p2、p3的 PCR产物
2. 2 多态性分析
随机选取的 p1p3引物扩增片段经克隆后测
序, 测序结果使用 BLAST比对鉴定出其外显子序
列。测序得到引物 p1扩增产物序列如图 2所示,目
的片段长 811 bp,包括了外显子 4、5及内含子 4。
使用 DNAMAN软件比对分析后显示在引物
p1扩增片段中, 存在 A215G、G607A、A733G三
处突变, 前两处突变发生在 SHBG基因内含子 4
中, 最后一个突变发生在外显子 5中, 但是并未
导致对应氨基酸突变, 为无义突变。突变处峰图
如图 3-图 5所示。测序得到引物 p2扩增产物
序列如图 6所示, 目的片段长 446 bp, 包括了外
显子 6、7及内含子 6。
使用 DNAMAN软件比对分析后显示在引物 p2
扩增片段中,存在 A371G、A380G两处突变,且均在
SHBG基因外显子 7中,未导致对应氨基酸变化, 如
图 7、图 8所示。测序得到引物 p3扩增产物序列如
图 9所示,目的片段长 634 bp,包括了外显子 8、9及
内含子 8。DNAMAN比对分析显示引物 p3扩增片
段没有多态。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
下划线的序列为外显子序列
图 2 引物 p1扩增片段序列
图 3 山羊 SHBG基因引物 p1扩增片段 215位 A∃ G突变
图 4 山羊 SHBG基因引物 p1扩增片段 607位 G∃ A突变
图 5 山羊 SHBG基因引物 p1扩增片段 733位 A∃ G突变
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2010年第 10期 谭颖等:大足黑山羊性激素结合球蛋白基因的克隆与多态性分析
下划线的序列为外显子序列
图 6 引物 p2扩增片段序列
图 7 山羊 SHBG基因引物 p2扩增片段 371位 A∃ G突变
图 8 山羊 SHBG基因引物 p2扩增片段 380位 A∃ G突变
下划线的序列为外显子序列
图 9 引物 p3扩增片段序列
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
2. 3 染色体步移
取第 1、2、3轮 TA ILPCR反应液各 5 L, 使用
1. 5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。电泳结果如图
10。第 3轮 TA ILPCR获得了 1条 1. 0 kb以上的特
异性条带。可对该特异性产物进行克隆测序。
将 TA ILPCR扩增片段克隆产物送交测序,得到
的测序结果用 BLAST进行同源性比对, 比对结果显示
本研究所得序列与牛 SHBG基因 5 端序列同源性高达
98%,经 DNAMAN软件再次比对分析后证明步移所得
的几个样本片段均为试验目的片段。本试验所得的山
羊 SHBG基因 5 端调控区序列如图 11所示。
1.引物 Sp1的 TAILPCR产物; 2.引物 Sp2的 TAILPCR产物 2;
3.引物 Sp3的 TAILPCR产物; M. 600 bp DNA m arker
图 10 引物 Sp1Sp3的 PCR产物
图 11 山羊 SHBG基因 5 端调控区序列
将所得序列在序列分析网站 www. fruitfly. org进
行一个启动子元件的分析预测, 结果如图 12所示。
分析显示此序列含两个得分高于 0. 80的可能的启
动子元件,序列中不存在 CCAAT盒与 TAAT盒,在
人 SHBG基因的研究中发现 SHBG基因 5 端存在一
个与基因功能密切相关的 TAAAA五核苷酸重复多
态, 本研究所得序列中没有发现此五核苷酸重复
多态。
图 12 SHBG基因 5 端序列启动子预测结果
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2010年第 10期 谭颖等:大足黑山羊性激素结合球蛋白基因的克隆与多态性分析
3 讨论
已报道过的人类 SHBG基因中发现的首个多态
是在基因 5 790位, 位于外显子 8上的 G∃ A错义突
变,这个突变导致基因所编码肽链的 327位上的天
冬氨酸被天冬酰胺替代, 此多态在全世界人群中广
泛分布,但在不同种族人群中的出现频率不同 [ 15 ]。
此等位基因与增加 SHBG的半衰期有关,且突变型
等位基因的携带者 SHBG水平较低 [ 16] , 血清 SHBG
水平与血清性激素浓度与比例紧密相关, 因血清性
激素浓度对促卵泡激素 /促黄体激素比率具有重要
调控作用而间接影响动物排卵性能, 故此突变最终
影响人类生殖性能。本研究通过克隆测序首次得到
了山羊 SHBG基因部分外显子、内含子序列,比对发
现了内含子 4存在两处突变,外显子 5存在一处无
义突变,外显子 7存在两处无义突变。没有发现外
显子 8上的错义突变 G∃A, 鉴于在人类 SHBG基因
多态性研究中的发现, 后续研究应该尽量获取更多
品种、更多个体的 SHBG基因序列, 深入研究山羊
SHBG基因多态的分布及其对基因功能的影响, 评
估基因多态对山羊繁殖性能的影响。
本研究利用染色体步移技术得到的扩增产物经
克隆测序后首次得到山羊 SHBG基因 5 端上游调控
区序列,经初步分析预测出两个可能的启动子元件,
但未发现 CCAAT盒及 TAAT盒, 这与前人在其它物
种中的研究结果一致。X ita等 [ 17]发现希腊多囊性
卵巢综合症 ( PCOS)妇女 SHBG基因 5 端启动子区
携带大于等于 8次 TAAAA重复多态基因型的比例
明显高于正常希腊妇女, 且携 TAAAA重复次数较
多基因型的 PCOS患者血清 SHBG水平明显多于较
少重复次数基因 PCOS患者。本研究没有发现基因
5 端调控区内存在 TAAAA五核苷酸重复,有必要再
进行一次染色体步移进行验证。另外, 赵君丽
等 [ 18, 19 ]的研究指出血清 SHBG水平也可能受多个
SHBG基因多态或基因多态连锁群等遗传因素的控
制和影响,所以后续研究应该继续通过染色体步移
和克隆测序等手段得到 SHBG基因全长及多态位点
的筛选,然后通过关联分析进一步研究山羊 SHBG
基因多态性对繁殖性能的影响,最终确定此基因对
山羊繁殖力性状的遗传效应, 为标记辅助选择
(m arker assisted selection, MAS)提供理论支持与可
能的分子标记。
参 考 文 献
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杂志为大 16开, 96页,双月刊 (单月 25日出版 ) ,国内外公开发行。中国标准刊号: ISSN 10097090, CN
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