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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
高纯度白介素-3 与假单胞菌外毒素融合蛋白
的表达、纯化及质谱鉴定
廖乐乐1 娄世锋1 曾翰庆2 白凤霞2
(1重庆医科大学附属第二医院血液内科，重庆 400010;2重庆医科大学检验系重点实验室，重庆 400016)
摘 要: 旨在利用简单的表达纯化工艺，获得纯度较高、有活性的重组免疫毒素 IL3-PE38KDEL并对其物理学及免疫学
性质进行鉴定。利用 PQE30-IL3-PE38KDEL /SG12009 工程菌表达重组免疫毒素 IL3-PE38KDEL，在提取包涵体后经一步强阳
离子柱层析得到纯度较高的免疫毒素复性纯化产物，用 Westen blotting、质谱、氨基测序等先进技术对产物鉴定。结果显示，发
酵后目的蛋白表达量占总菌体的 17. 56%，经强阳离子柱层析纯化复性后的目的蛋白纯度达到 90%以上，Western blotting、质
谱、氨基测序结果均表明，纯化产物分子量为 54. 9 kD且具有相应的免疫学活性，序列与预期序列完全一致。纯化复性方法对
重组免疫毒素 IL3-PE38KDEL的生物性质及纯度有较大影响，因此选择一种适当的纯化复性方法至关重要。
关键词: 重组免疫毒素 IL3-PE38KDEL 纯化复性 质谱鉴定
Renaturation，Purification and Identification of Fusion Toxin
IL3-PE38KDEL
Liao Lele1 Lou Shifeng1 Zeng Hanqing2 Bai Fengxia2
(1Department of Hematology，the Second Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400010;
2Key Laboratory of Medical Diagnostics Designated by the Ministry of Education，Chongqing 400016)
Abstract: It was to obtain IL3-PE38KDEL，a new recombinant immunotoxin consisting of a truncated pseudomonas exotoxin A
(PE38KDEL)linked to human interleukin 3 (IL3)in E. coli SG13009，with high purity and normal bioactivity . The recombinant plas-
mid PQE30-IL-3-PE38KDEL，was transformed into E. coli SG13009. After IPTG induction，the expressed protein products were verified
by mass spectrometry and Western blotting. Purified by Ni2 + -NTA agarose affinity chromatography ，refolding and it was identified. Re-
rults showed that the recombinant immunotoxin was expressed in E. coli SG13009 clone strain containing PQE30-IL-3-PE38KDEL in-
duced by IPTG in the form of inclusion body. SDS － PAGE analysis revealed that expression level of the product was up to 17. 56% of
the total bacterial proteins. It was a protein band about Mr above 54 900 in gel，which could be identified by PEA of anti-pseudomonas
exotoxin A monoclonal antibody with Western blotting technique. The highly purified recombinantprotein by Ni2 + -NTA agarose affinity
chromatography and refolding. Mass spectrometry demonstrated that the recombinant protein was the recombinant immunotoxin consis-
ting of a truncated pseudomonas exotoxin A linked to human interleukin 3. IL3-PE38KDEL was successfully expressed in E. coli. A suit-
able protocol for purification of the recombinant protein was set up. After purification，pure protein of the expressed IL3-PE38KDEL was
obtained. It laid a solid foundation for the further research of function.
Key words: Recombinant immunotoxin IL3-PE38KDEL Renaturation and purification Mass spectrometry
收稿日期:2010-01-11
作者简介:廖乐乐，女，硕士，研究方向:白血病靶向治疗;E-mail:liaoleleemail1984@ 126. com
通讯作者:娄世锋，男，教授，E-mail:loushifeng@ hotmail. com
白血病中肿瘤细胞并非均一的细胞群，其中很
少比例的白血病干细胞(leukemia stem cells，LSC)对
维持整个细胞群的稳定至关重要［1 － 3］。LSC 多处在
G0期，对常规化疗药物无效，是白血病复发的根源。
近年的研究显示，IL3 受体 α 链(CD123)是白血病干
细胞(LSC)特异性的表面标志。而正常人类造血干
2010 年第 6 期 廖乐乐等:高纯度白介素-3与假单胞菌外毒素融合蛋白的表达、纯化及质谱鉴定
细胞没有此标志，因而 IL3受体 α链成为治疗白血病
的 重 要 靶 点［4，5］。原 核 表 达 载 体 PQE30-IL-3-
PE38KDEL在 E. coli SG13009中表达，具有操作简单、
生长时间短、成本低、产量高、适合大量表达等优点。
为获得高纯度的活性表达蛋白，本研究对重组免疫毒
素在胞内表达形式、诱导剂浓度、诱导时间、诱导温
度、纯化、复性方法进行了研究，并对产物进行了鉴
定，为开展大规模表达纯化及动物试验奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 质粒与菌株 含 IL3-PE38KDEL 融合基因
的质粒由本室构建与保存;表达株 SG13009 由重医
检验系重点实验室保存。
1. 1. 2 试剂 镍离子亲和层析柱(Ni2 + -NTA)购于
Novagen公司;IPTG，二硫苏糖醇(DTT) ，过硫酸铵，
TEMED，SDS，考马斯亮蓝 R-250，考马斯亮蓝 G-250
购于 Sigma公司;蛋白分子标准物(14 － 97 kD)购自
成都天泰生命科技有限公司;其它试剂均为国产分
析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 重组免疫毒素 IL3-PE38KDEL 的表达 将
重组表达载体 pQE30-IL3-Linker-PE38KDEL 转化感
受态大肠杆菌 SG13009，挑单菌落接种入 LB培养液
(含 100 mg /L氨苄青霉素，50 mg /L卡那霉素)中，
37oC恒温水平振摇过夜，次日将饱和培养物按 1:50
接种于 20 mL新鲜 LB(含 100 mg /L氨苄青霉素，50
mg /L卡那霉素)培养液中，以相同条件 37oC振摇培
养大约 2. 5 h，待 OD600 = 0. 8 时，对照管不加 IPTG，
其余管加 IPTG至浓度依次为 0. 1 mmoL 继续培养，
4 h后，6 000 r /min 离心 5 min 收集菌体，蛋白质电
泳鉴定表达情况。
1. 2. 2 重组免疫毒素 IL3-PE38KDEL的分离纯化
蛋白质电泳证明，目的蛋白主要以包涵体形式
存在。每 100 mL 菌液加 5 mL Solusion Ⅰ(NaCl
500 mmol /L，Tris-Cl 20 mmol /L，pH7. 9)重悬洗涤
2 次，再次用等体积 Solusion Ⅰ重悬，超声碎菌 30
min，功率 400 W，超声 5 s，停 5 s。4℃下，先 6 000
r /min离心 5 min，弃沉淀物，再 12 000 r /min 离心
20 min，回收沉淀物。将沉淀用 Solusion Ⅰ重悬，
4℃搅拌 40 min，12 000r /min，离心 30 min，重复洗
涤 1 次，取包涵体 1. 0 g ，用 20 mL，pH8. 0，1 × PBS
重悬，加入 80 mL Solusion Ⅱ(pH8. 0，1 × PBS，8
mol /L 盐酸胍，10 mmol /L咪唑，30 mmol /L β － 巯
基乙醇)室温放置30 s，过 20 mL 柱床的镍离子亲
和层析柱纯化。
以含 100 mmol /L Tris-Cl，0. 6mol /L 盐酸胍，
0. 3 mmol /L GSSG，0. 5 mmol /L GSH，pH8. 0 的 Solu-
sionⅢ为复性液，将 30 mL 洗脱样品加入 1L 复性液
装入透析袋中，置于 2 L，pH8. 0，1 × PBS，0. 5 mol /L
盐酸胍透析液中透析，每 8 h换液 1次，复性于 8℃下
进行并充分搅拌。复性 72 h 后收集透析袋中液体
12 000 r /min离心 30 min，取上清用 500目滤膜过滤，
上 15 mL床柱的镍离子亲和层析柱纯化，洗脱液 15
mL经 sepharose分子筛纯化平衡，以进一步提高纯度
及改变缓冲体系以减小对后续试验的非特异性作用。
1. 2. 3 融合蛋白 IL3-PE38KDEL 的免疫印记分析
收集诱导工程菌 1 mL，12 000 r /min离心 10 min，加
入 1 × SDS上样 Buffer充分混悬，100℃煮沸 10 min，
1 000 r /min离心 1 min备用。配 15%分离胶，1 mm
厚 10 孔梳，每孔上样 10 μL。电泳 90 min 后切胶，
将目的片段切下置于负极缓冲液中浸泡 30 min。测
胶长﹑宽，剪取与胶等面积大小滤纸 8 张，剪下与胶
等大的 PVDF膜放甲醇中浸泡 15 s，再放于正极缓
冲液中浸泡。按正确顺序放于电转仪中以 5 V电压
转 15 min。电转毕取出膜在 TBS 中略清洗，置于丽
春红染液中染色约 2 min，明显条带即可取出在双蒸
水中清洗干净。膜以封闭液(PBS，pH7. 4，含 5%的
脱脂奶粉和 0. 5%的 Tween-20)封闭 1 h，加入以封
闭液稀释(1 ∶ 200)的鼠抗 6 × PEA 单克隆抗体 4℃
孵育过夜，TBST洗膜 4 次，每次 10 min，羊抗鼠的二
抗(1∶ 3 000)37℃温育 1 h，TBST洗膜 4 次后，洗去
二抗后以 ECL发光试剂盒进行显色，X光片曝光后
进行显影定影。
1. 2. 4 融合蛋白 IL3-PE38KDEL 的质谱及氨基端
测序鉴定 收集诱导工程菌 1 mL，12 000 r /min 离
心 10 min，加入 1 × SDS上样 Buffer充分混悬，100℃
煮沸 10 min，1 000 r /min离心 1 min 备用。配 15%
分离胶，1 mm厚 10 孔梳，每孔上样 10 μL。电泳 90
min后考马斯亮蓝染色，脱色后切下目的条带送厦
门特宝生物有限公司质谱鉴定。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
2 结果
2. 1 融合蛋白的表达纯化及 SDS-PAGE分析
将重组质粒 PQE30-IL3-PE38KDEL 从克隆菌
DH5α中提出，转入表达宿主菌 SG13009，经 IPTG 诱
导后，与空载体转化的相同菌株的表达产物比较，都
出现了新的蛋白条带，分子量为 54. 8 kD 与预期的
分子量大小相符。诱导时间在 2. 5 － 8 h内，在 IPTG
浓度为 0. 1 － 2. 0 mmol /L 之间表达无明显差异，表
达量占菌体总蛋白量的 17. 56%，见图 1。蛋白质的
可溶性分析(图 2)显示，目的蛋白仅存在于包涵体
沉淀中，上清液未见明显表达。
将复性并经分子筛纯化后的蛋白通过分光光度
计测定吸光度值，在蛋白标准曲线中查得浓度为
1 4 mg /mL，用 PBS缓冲液调浓度至 100 μg /mL，储
存于 － 80℃备用。
M.蛋白质分子量 Marker;1.诱导 4 h后的空载;
2.诱导 4 h后的工程菌
图 1 SDS-PAGE 分析目的蛋白表达
M.蛋白质分子量 Marker;1. 破碎后包涵体;2. 镍离子亲
和层析柱纯化后目的蛋白;3. 复性分子筛纯化后目的
蛋白
图 2 SDS-PAGE 分析目的蛋白纯化
2. 2 重组免疫毒素 IL3-PE38KDEL的免疫印迹分析
利用 PEA抗体对目的蛋白行免疫印记分析显
示有明显的目的条带出现(图 3) ，与预期相符，证实
了表达产物能够被 PEA特异性结合，说明构建的重
组免疫毒素 IL-3-PE38KDEL 在宿主菌中得到表达
且具有免疫学活性。
M.蛋白质分子量 Marker;1.诱导 4 h后的工程菌;
2.纯化复性后蛋白
图 3 融合蛋白 IL3-PE38KDEL Western blotting鉴定
2. 3 重组免疫毒素 IL3-PE38KDEL 的质谱和数据
库检索及氨基端测序
将目的蛋白通过 SDS-PAGE 双向电泳分离、考
马斯亮蓝染色后，切下，经脱色、还原、酶解等处理
后，进行 MALDI-TOF-MS质谱分析，得到相应的肽
段酶解 MALDI 质谱图(图 4)。利用 Mascot 软件
在 MSDB 数据库搜寻肽段，结果证明该蛋白与预
期序列完全一致，且氨基端测序也表明蛋白序列
正确无误。
3 讨论
急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，
AML)是我国急性白血病的主要类型。近年来，骨
髓干细胞移植和大剂量化疗使 AML的预后有显著
的改善，但仍然有相当比例患者复发死亡。此外，
标准的治疗措施对白血病细胞选择性较低，常导
致明显的毒副作用并增加治疗相关死亡率［6］。随
着白血病干细胞相对特异性抗原 CD123(IL-3 受
体 α 链)的发现，将 CD123 作为靶点特异性清除
LSC 的研究越来越受到人们的关注［4，5］。目前已
有合成 DT388 IL-3 的报道，也已证明 DT388 IL-3 对
AML原始早期细胞有细胞毒作用，但对小鼠正常
原始细胞无影响［7］，进一步的动物试验也证实
DT388 IL-3 的有效性
［8］。但是白喉毒素的治疗剂量
与中毒剂量非常接近，且人群中因免疫防御常有
白喉毒素抗体而影响其临床应用。假单胞菌外
毒素与白喉毒素杀伤细胞机制类似，但对不同细
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2010 年第 6 期 廖乐乐等:高纯度白介素-3与假单胞菌外毒素融合蛋白的表达、纯化及质谱鉴定
图 4 融合蛋白 IL3-PE38KDEL MS鉴定
胞器免疫毒素的杀伤效力可有很大区别。分别用
抗转铁蛋白受体单抗融合白喉毒素或假单胞菌外
毒素 PE40 处理 A431、KB 及 MCF7 细胞株时，
PE40 的毒性是 DT388 的 400 － 800 倍［8］。此外，
去掉Ⅰa区的 PE 其细胞毒特异性完全取决于载体
的特异性，因此非特异性毒副作用很低，在人体内
最大耐受剂量可达数百微克 /kg，治疗剂量空间
更大［9］。
本试验在前面的工作中已经成功构建了能
够表达易于纯化的 IL3-PE38KDEL 的原核表达质
粒 PQE30-IL3-PE38KDEL，并应用该重组质粒在
大肠杆菌 SG13009 中获得了高效表达。通过分
析蛋白表达形式得出目的蛋白主要以包涵体的
形式表达，菌体破碎后上清中几乎不可见，用盐
酸胍将包涵体变性后经镍离子亲和层析柱对带
有 6His-Tag 的目的蛋白进行纯化，得到了大量的
粗品;但变性纯化后的蛋白仍为一级结构，为了
恢复其天然结构使之具有生物学活性，必须对重
组蛋白进行复性处理。复性是一个复杂的过程，
由于二硫键的存在，所以在增溶时需使用还原
剂，通过缓慢去除变性剂使目的蛋白从变性的完
全伸展状态恢复到正常的的折叠结构，同时去除
还原剂使二硫键恢复正常，在梯度变性剂条件下
对目的蛋白一级结构作透析处理，在 8℃梯度透
析中缓慢还原其三级结构。通过 Western blot-
ting、质谱、氨基测序等先进技术对复性后目的蛋
白进行了检测，结果证明表达产物与预期完全
一致。
本课题为进一步研究融合蛋白的生物学活性、
对 AML干细胞 NF-κB活性的影响以及对 AML长期
始动细胞(动物模型)的选择性作用奠定了重要的
试验基础，也可为克服白血病的复发及多药耐药问
题提供全新的思路。
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