全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxIIA基因的序
列分析及其 B细胞表位预测
李任峰 1 　田香勤 2 　何启盖 3 　王自良 1 　赵坤 1 　李学斌 1 　王三虎 1
(1 河南科技学院动物科学学院 ,新乡 453003; 2 新乡医学院医学研究中心 ,新乡 453003;
(3 华中农业大学动物医学院 农业微生物学国家重点实验室动物病原分室 ,武汉 430070)
　　摘 　要 : 　为了进一步研究猪胸膜肺炎放线杆菌 (A ctionobacillus pleuropneum oniae, App ) A pxIIA 基因的结构和功能 ,选取
GenBank中 6株不同 App分离株 ,采用生物信息学方法对其 A pxIIA 基因及其编码氨基酸序列进行同源性比对 ,并选择其中
AY232288. 1菌株 (湖北分离株 ) A pxIIA基因为研究对象 ,分析该基因所编码蛋白质的理化性质 ,并对其可能形成的二级结构
及 B细胞表位进行预测和分析。结果表明 , 6株不同 App分离株 A pxIIA基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为 65. 56  和
88. 42   ,在 AY232288. 1菌株 ApxIIA蛋白的肽链中 , 745～751和 801～807区段可能是其 B细胞表位优势区。本研究首次利
用生物信息学方法对 A pxIIA基因及其蛋白质结构进行了分析和预测 ,为 A pxIIA基因功能的深入研究及 APP多表位疫苗的设
计奠定了基础。
关键词 : 　猪胸膜肺炎放线杆菌 　A pxIIA基因 　B细胞表位
Analysis of Genome Sequence of App ApxIIA and Its
Prediction of Related B Cell Epitopes
L i Renfeng1 　Tian Xiangqin2 　He Q igai3 　W ang Ziliang1 　Zhao Kun1 　L i Xuebin1 　W ang Sanhu1
(1 Veterinary M edicine College , Henan Institu te of Science and Technology, X inx iang 453003; 2M edicine Research
Center, X inxiang M edical College, X inxiang 453003; 3 D ivision of Anim al Infectious D isease, N ational
Key Laboratory of Agricultural M icrobiology, Huazhong Agricultural University, W uhan 430070)
　　Abs trac t: 　The research was to analyze the identity matrix of A pxIIA genes ofApp isolates and to p redict the B cell ep itopes of this
A pxIIA p rotein. The A pxIIA genes of the six different App were selected from GenBank to analyze their identity matrix of nucleotide and
am ino acid by the bioinformatics analysis software. The B cell ep itopes of the AY232288. 1 A pxIIA p rotein were p redicted based on the
analysis parameters of B cell ep itopes and the characteristicof the secondary structure. The results showed the A pxIIA genes of six
strains share 65. 56 % and 88. 42% homology at nucleotide and am ino acid level respectively. The B cell ep itope of ApxIIA p rotein of
AY232288. 1 was p robably locate or adjacent to itsN2term inal region 745～751和 801～807. These results p rovided references for fur2
ther research of ApxIIA p rotein function and design of multiep itope2based vaccine of APP.
Key wo rds: 　A ctionobacillus pleuropneum oniae　A pxIIA gene　B cell ep itope
收稿日期 : 2009203230
基金项目 :河南省技术与前沿技术研究项目 (082300430020) ,河南科技学院青年教师创新基金项目 (20065053)
作者简介 :李任峰 (19782) ,男 ,讲师 ,研究方向 :微生物分子生物学 ; E2mail: lirenfeng@ sina. com
通讯作者 :王三虎 (19622) ,男 ,教授 ,研究方向 :微生物分子生物学 ; E2mail: angsanhu@hist. edu. cn　　猪传染性胸膜肺炎是是由胸膜肺炎放线杆菌(A ctinobacillus pleuropneum on ie, App )引起的一种严重危害世界养猪业的主要猪的传染病之一 ,目前共发现有 15种血清型 [ 1 ]。近年来 ,随着我国养猪业的迅猛发展 ,该病发病率呈逐年上升趋势 ,严重影响了 给我国养猪业的健康发展。APP的毒素属于 RTX ( repeat in structure toxin)毒素家族 ,已发现的 4种毒素分别为 ApxI、ApxⅡ、ApxIII、ApxIV,其中 ApxII除血清型 10外 ,其余血清型都能分泌此毒素 [ 2 ]。研究发现 ,分泌表达上述 4
2009年第 7期 　　　李任峰等 :猪胸膜肺炎放线杆菌 A pxIIA基因的序列分析及其 B细胞表位预测
种毒素均需相邻的 B、C、A、D 4种基因的共同作用 ,
其中 A基因编码毒素的结构蛋白 ,并决定毒素蛋白
的免疫原性 [ 3 ]。
近年来 ,随着生物信息学和计算机网络技术的
发展 ,使得利用网络服务器及生物信息学软件预测
抗原表位成为可能。通过生物信息学及序列分析软
件的预测 ,可获得蛋白质的基因和氨基酸序列中蕴
含的重要的信息 ,如抗原表位或与抗原表位相关的
信息 [ 4 ]。在对 6个不同菌株 APP的 A pxIIA全基因
组序列比对分析的基础上 ,选择我国湖北分离株
(AY232288. 1 ) APP毒素 A pxIIA 基因作为研究对
象 ,根据氨基酸亲水性、抗原指数和蛋白表面可及性
等参数 ,综合预测了 ApxIIA的 B细胞表位 ,旨在为
更加深入研究 A pxIIA 基因功能和 APP的表位疫苗
设计奠定基础。
1　材料与方法
111　基因序列
6株不同 APP菌株的 A pxIIA 基因序列 ,选自
GenBank核酸数据库 ,登录号分别是 AF36336211、A
Y23228811、AY736188、CP000687、CP001091、EU789
561。其中 AY232288. 1为湖北分离株 ,由华中农业
大学农业微生物国家重点实验室测序完成。
112　A pxIIA基因及其氨基酸序列比对分析
利用 DNAMAN序列分析软件 ,对 6个不同 APP
菌株的 A pxIIA基因及其氨基酸序列进行比对分析。
113　A pxIIA基因及其氨基酸组成的理化性质分析
A pxIIA基因及其氨基酸序列的组成成分分析、
理化性质分析、开放阅读框的查找均用 DNAStar软
件进行。
114　ApxIIA蛋白二级结构的预测
应用 NPS@服务器 ( http: / /pbil. ibcp. fr/ htm /
index. php)上的 SOPMA方案预测 ApxIIA蛋白的二
级结构成分 ,该方案的参数意义见文献 [ 5 ]。
115　ApxIIA氨基酸序列的亲水性、表面可及性、抗
原性和柔韧性预测分析
分别采用 Parker方案预测 ApxIIA蛋白的亲水
性、Em ini方案预测 ApxIIA蛋白的表面可及性、Ko2
laskar方案预测 ApxIIA蛋白的抗原性、Karp lus方案
预测 ApxIIA蛋白的柔韧性 ( http: / / tools. immuneep2
itope. org / tools/bcell / iedb_input)。各方案参数的意
义见文献 [ 6～9 ]。
116　ApxIIA蛋白的 B细胞表位综合预测
将上述方法互相参照 ,综合分析比较 ,兼顾各预
测参数推断 ApxIIA蛋白的 B细胞表位。
2　结果
211　A pxIIA基因及其氨基酸序列的比对分析结果
通过 GenBank核酸序列库搜索 ,获得 6株 APP
的全长 A pxIIA基因组序列 (登录号见 1. 1)。经 DN
AMAN序列分析软件比对 ,现 6个不同菌株 A pxIIA
核苷酸序列同源性为 65. 56% ,氨基酸序列同源性
达 88. 42   ,其中 AF363362. 1和 CP000687之间基
因序列的同源性最低为 40. 6% , AF363362. 1、AY73
6188和 EU789561三者之间基因序列的一致性高达
100. 0 %。氨基酸序列比对结果表明 , 6个不同菌株
之间 A pxIIA 所编码的氨基酸序列的同源性均在
98. 8%以上 (图 1,表 1)。
图 1　6株 APP A pxIIA基因序列比对分析图
表 1　6株 APP A pxIIA基因同源性分析
1 2 3 4 5 6 登录号
氨基酸同源性 ( % )
1 98. 6 98. 6 98. 8 99. 0 100. 0 AF363362. 1
2 99. 4 99. 4 99. 6 99. 7 100. 0 AY232288. 1
3 99. 5 99. 7 99. 6 99. 7 100. 0 AY736188
4 40. 6 40. 5 40. 9 99. 9 99. 7 CP000687
5 40. 6 40. 5 40. 9 99. 9 100. 0 CP001091
6 100. 0 99. 9 100. 0 41. 2 41. 3 EU789561
核苷酸同源性 ( % )
鉴于 AY232288. 1菌株 (湖北分离株 ) A pxIIA基
因的保守性及研究的现实意义 ,选取该菌株 A pxIIA
基因的氨基酸序列进行 B细胞表位预测分析。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
212　A pxIIA基因及其氨基酸组成的理化性质分析
结果
用 DNAStar软件的 ORF Finder、Editseq和 Pro2
tean程序分析 AY232288. 1菌株 A pxIIA核酸及其氨
基酸序列。结果表明 , A pxIIA基因可编码 13个读码
框 ,其序列编码的蛋白相对分子质量为 102 595. 16,
理论等电点 p I为 5. 52,表明 ApxIIA呈酸性。该蛋
白的其他理化性质见表 2。
表 2　AY232288. 1菌株 A pxIIA基因的核酸序列
以及推导的氨基酸序列组成成分和理化性质分析
A pxIIA全部氨基酸 氨基酸数 ( % ) 重量比 ( % ) 出现频率 ( % )
带点 AA 257 32. 97 26. 88
酸性 AA 119 13. 98 12. 45
碱性 AA 99 13. 24 10. 36
极性 AA 281 29. 86 29. 39
疏水性 AA 330 33. 79 34. 52
213　ApxIIA蛋白二级结构的分析结果
通过 NPS@服务器 ( http: / /pbil. ibcp. fr/ htm /
index. php)上的 SOPMA方案预测 ApxIIA蛋白二级
结构成分。结果表明 ,α2螺旋和不规则卷曲是 ApxI2
IA蛋白整体结构中的主要组成结构元件 ,有利于稳
定蛋白质的 i结构 ;β2转角和延伸链散布于整个蛋
白质中 ,易形成抗原表位区 ,其中 173～227和 261
～293区段α2螺旋值最高 , 610～670和 720～844区
段α2螺旋分布较少 ,而β2转角和延伸链分布较为集
中 (图 2)。
214　ApxIIA蛋白的亲水性、表面可及性、抗原性和
柔韧性预测分析结果
通过 Parker方案分析和预测 , AY232288. 1菌
株 ApxIIA蛋白的肽链具有较好的亲水性 ,其中 745
图 2　Apx IIA蛋白二级结构预测结果
～751、746～752、747～753、801～807、527～523、
528～524、529～525、801～807和 802～808区段亲
水性较强 ,而 48～54和 537～543区段具有较强的
疏水性 (图 3 ) ; 经 Em ini 方案预测结果表明 ,
AY232288. 1菌株 ApxIIA蛋白的表面可及性参数值
较大区域主要集中在 745～751、746～752、792～
798和 801～807区段 (图 4) ;经 Kolaskar方案预测 ,
ApxIIA蛋白的抗原性参数最大值位于 745～751区
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2009年第 7期 　　　李任峰等 :猪胸膜肺炎放线杆菌 A pxIIA基因的序列分析及其 B细胞表位预测
段 ,其他 746～752、781～787、801～807和 802～808
也具有较大的抗原性参数 (图 5) ;用 Karp lus方案预
测结果显示 , ApxIIA蛋白柔韧性区段较多 ,且分布
较均匀 ,其中 48～54、744～750、745～751、746～752
和 801～807区段的柔韧性较强 ,易发生扭曲和折
叠 ,形成 B细胞表位的几率相对较高 (图 6)。
图 3　Parker方案预测 Apx IIA蛋白的亲水性
图 4　Em in i方案预测 Apx IIA蛋白的表面可及性
图 5　Kola skar方案预测 Apx IIA蛋白的抗原性预测
图 6　Karplus方案预测 Apx IIA蛋白的柔韧性指数
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215　ApxIIA的 B细胞表位综合预测
综合以上各种方案预测结果 ,经分析发现 ,虽然
不同方案预测得到的能形成 B细胞表位优势区的
数量和所跨区域有所不同 ,但对 745～751和 801～
807区段 ,各种方案所预测的参数值均高于其他区
段 ,而且两区段中极性氨基酸所占比例较大。肽段
745～751的氨基酸序列 :天冬氨酸 2甘氨酸 2天冬酰
胺 2天冬氨酸 2甘氨酸 2天冬氨酸 2天冬氨酸 ;肽段 801
～807的氨基酸序列 :苏氨酸 2天冬氨酸 2丝氨酸 2天
冬氨酸 2甘氨酸 2谷氨酰胺 2天冬氨酸。因此 ,以上两
区段形成 B细胞表位优势区的可能性最大。
3　讨论
抗原表位是外源抗原分子激发动物机体发生免
疫应答的最基本结构和功能单位。表位生物学的研
究有助于新型疫苗的研究与开发、疫病的预防与诊
断等 ,也有助于病原微生物致病机理和免疫机制的
探索与阐明 [ 10 ]。蛋白质分子的多肽链通常折叠和
盘曲成比较稳定的空间结构 ,以形成特有的生物学
活性和理化性质。因此 ,蛋白质二级结构的预测和
分析对其空间结构的了解有着重要的意义 [ 11 ]。当
前预测细胞 B抗原表位一般依据多种参数综合考
虑 ,以克服单参数预测模型的局限性 ,提高预测的准
确性 ,其中尤以亲水性参数、可及性参数和二级结构
预测为重要 [ 12 ]。
APP是猪传染性胸膜肺炎的致病菌 ,该菌最主
要的毒力因子是其分泌到细胞外的外毒素。研究表
明 , APP可产生 4种外毒素 ,它们分别是 Apxl、Apx2
lI、ApxIII和 ApxⅣ,其中前 3 种 Apx毒素不仅是
APP致病的主要毒力因子 ,也是 APP主要的保护性
抗原 [ 12 ]。ApxII是一种弱溶血活性以及弱细胞毒性
的蛋白 ,除血清型 10以外 ,所有血清型的 APP都存
在这种毒素基因 ,表明 A pxII基因非常保守 [ 14 ]。Ka2
mp等 [ 15 ] 1994年首先从血清 5型 APP基因组中克
隆出编码 ApxII激活蛋白和结构蛋白的基因 ,并对
它们进行了测序 ,分别命名为 A pxIIC和 ApxIIA ,其中
ApxIIA 基因主要编码毒素蛋白的前体 ,各血清型
APP的 A pxIIA 基因序列差异不大。具有相对较高
的保守性。
鉴于 ApxIIA蛋白是一种高度保守性和强免疫
原性的结构蛋白 ,成为了近年来 APP研究的热点。
Prideaux等 [ 16 ]研究发现 ,当 A pxIIC基因失活后 ,虽
然毒素毒力明显降低 ,但其免疫原性并未受到影响。
可见 A pxIIA 基因对于 ApxII的免疫原性至关重要。
何启盖等 [ 17 ]根据国外已发表的胸膜肺炎放线杆菌
ApxⅡ的基因序列设计了一对引物 ,从我国 APP武
汉株扩增出约 3. 5 kb的 A pxIICA基因。测序结果表
明 ,该基因的大小与国外已报道的 l型和 9型 APP
的 A pxIICA基因大小一致 ,同源性达 99   ,并以该
基因的原核表达蛋白作为包被抗原建立了 ApxⅡ2
EL ISA检测方法。贝为成等 [ 18 ]利用插入突变的方
法 ,构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素 ApxⅡ
基因 GFP插入失活型的重组质 pOSAKCG,通过电
穿孔转化 ,该重组质粒的突变 A pxIICA 基因与野生
型亲本菌株胸膜肺炎放线杆菌 HB03染色体上野生
型 A pxIICA基因发生同源交换 ,两步法筛选获得了
A pxII基因突变株 HBC /GFP, PCR和 Southern blot对
突变株进行初步鉴定 ,进一步对突变株的一些生物
学特性 ,包括它的溶血活性、免疫原性、生长特性及
其对小鼠的安全性进行了研究。结果表明 ,无药物
抗性标记突变株的构建成功。
以上研究大多集中在对 A pxIIA 基因的同源性
比较、克隆表达及构建基因突变疫苗株等方面。但
至今未见到有关 ApxIIA蛋白 B细胞表位的研究报
道。本研究首次借助于计算机技术和生物信息学软
件对 ApxIIA结构蛋白的二级结构和潜在的 B细胞
抗原表位进行了预测和分析 ,发现在预测的众多 B
细胞表位中 , 745～751和 801～807区段的各种预
测参数最为显著 ,提示这个区段可能是 ApxIIA蛋白
的 B细胞表位优势区 ,这将为 APP新型疫苗的设
计、诊断试剂的研制和单克隆抗体的筛选等方面的
研究提供重要参考。
参 考 文 献
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(下转第 116页 )
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
能定量地与 Mg2 +结合 ,使实际反应中 Mg2 +的浓度
下降 [ 7 ]。例如 ,王伟继等 [ 8 ]在对对虾 ISSR2PCR研
究中发现 , Mg2 + 浓度过高时电泳图谱有明显的背
景 ,而适当降低 Mg2 +浓度可有效消除背景。本试验
中 ,Mg2 +浓度在 1. 5～2. 5 mmol/L范围内时扩增结
果清晰 ,浓度增高后 ,条带变淡。引物和 dNTPs的
影响表现为 ,浓度过低会降低合成效率 ,而浓度过高
会导致 PCR错配 ,造成非特异产物的合成 ; Taq酶的
用量对 PCR扩增也有很大影响 , Taq酶浓度过高不
仅提高了试验成本 ,而且也容易产生非特异性扩增
产物 ,扩增条带的背景模糊 ,不易辨认 ,而 Taq酶浓
度过低时 ,聚合酶的催化能力不够强 ,导致产物的合
成效率低 [ 9 ]。本试验结果显示 ,引物浓度、dNTPs浓
度和 Taq DNA聚合酶含量过低时 ,条带模糊 ,说明
合成效率较低 ,而浓度过高时 ,并未出现非特异性扩
增 ,这可能与模板 DNA及引物的选择有关。
另外 , ISSR2PCR还受到退火温度、退火时间 ,延
伸时间及循环次数等的影响。较低的退火温度扩大
了引物在基因组中的错配 ,出现杂带 ,而较高却会影
响引物与模板的结合 [ 10 ]。本试验根据各引物的 Tm
值 ,进行 ( Tm ±5) ℃优化 ,均获得理想的退火温度 ;
循环次数决定着扩增程度 ,过多的循环会增加非特
异性扩增产物的数量和复杂性 [ 7 ]。在本试验设置
的 25～45个循环次数中 ,最佳循环次数为 40。
本研究利用正交试验方法对 ISSR2PCR反应的
各因子和循环参数进行优化 ,建立了适合黄鳝的 IS2
SR反应体系 ,为进一步研究黄鳝的遗传多样性和种
质资源评鉴奠定基础 ,并为其他鱼类 ISSR反应体系
的建立提供参考。
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