全 文 ：生物杖术通报
· 研究报告 · 刀了口














 年增刊
蓖麻和线虫的两种不同结构脂肪酸去饱和酶的原核表达
元冬娟 , 吴湃 , 熊继红 , 周克元 , 江黎明‘,

广东医学院基因营养健康研究中心 , 湛江





广东医学院生物化学与分子生物学教研室 , 湛江
 !

摘 要
目的
通过在原核表达系统中表达蓖麻的可溶性脂肪酸去饱和酶基因和线虫的
 一
脂肪酸去饱和
酶基因 , 为脂肪酸去饱和酶序列结构与功能的研究莫定基础 。 方 法
将 蓖麻


胡 脂肪酸去饱和酶和线虫
 ·

脂肪酸去饱和酶基因亚克隆到大肠杆菌
砚
表达载体

竹

中 , 获得重组表达载体

竹

一
 ,


 !



 ,并通过

一


和







 鉴定蛋白的表达情况 。 结果
经
 和测序鉴定 , 证实两个重组质粒含有
目的基因片段


一


和



 !


 证实两种蛋白在大肠杆菌中获得表达 , 但表达量具有明显的不 同







 软件时蛋白跨膜结构的分析 , 验证蓖麻胡 脂肪酸去饱和酶和线虫
 卜
脂肪酸去饱和酶在结构上的不 同 。
结论
蓖麻的

 脂肪酸去饱和酶和线虫的

一
脂肪酸去饱和酶都得到了表达 , 但线虫
 一
脂肪酸去饱和酶表
达量偏低
这可能与
 卜
脂肪酸去饱和酶是一类跨膜蛋白的性质直接相关 。 因此 , 对于线虫
 卜
脂肪酸去饱和酶
的基于蛋白纯化的结构分析有待进一步的研究。
关键词
蓖麻胡 脂肪酸去饱和酶 线虫
 卜
脂肪酸去饱和酶 原核表达
























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多不饱和脂肪酸(PU FA s)在维持包括人在内的
生物体的正常生物功能和生理功能发挥重要作用 。
P U F A s 参与细胞膜的构成并作为许多细胞应答过程
中的信号分子 , 与人类的多种疾病的发生紧密相关 ,
基金项目:广东省科技计划项 目(20 5 B1 04 01 0l l ) , 广东省自然科学基金 (501 巧95 ))
作者简介 :元冬娟 (19 80一 ) , 女 , 实习研究员 , 脂肪酸去饱和酶的分子生物学 , y-u an dj @ g d m c . ed u
通讯作者:E一 m a i l : l mj i a n g @ g d m e . e d u . C n ; T e l : 0 7 5 9 2 3 8 8 2 7 0
生物技术通很 B io te ch nolo 群 2008 年增刊
其适宜的含量对于人类及其他哺乳动物的正常发育
和保持良好的健康状况极其重要〔’, , ] 。 。 一3 P u F As
对人体具有积极的意义 , 被证实在预防和治疗心血
管疾病 、关节炎 、癌症等多种疾病方面发挥着重要作
用 。 由于哺乳动物及人类都不能在体内合成 。-3
P u F A , 与 。石 P u F A S , 因此必须从食物中摄取 。 但
自然界中 。石P U F A s 含量丰富而 。一 3 P U F A s 含量极
少 , 导致人体中 。石PU F A s 摄人过多而 。一3 P U F As 摄
人严重不足 。
。一 脂肪酸去饱和酶是多不饱和脂肪酸的生物
合成途径的关键酶类 , 能将 。石PU F As 转变为 。-
3 P u F A s 。 在已克隆的 。一3 脂肪酸去饱和酶基因中 ,
其中大部分只能合成 18C 的 。一3 P U F As 。 虽然来自
线虫的 。一3 脂肪酸去饱和酶基因fat 一 1 , 转人哺乳动
物细胞及小鼠后能使从 18 碳到2 碳的 。3 P U F As
的含量增加 , 显示出很大的开发利用价值 。 但所合
成的 。 一3 P U F A S 中价值更大的 2 碳 。一 P U F A S 水
平仍然很低 。 因此 , 对其氨基酸序列和结构的深人
分析 , 从而改造出高效合成 2 碳的 。 一3 P U F As 基因
将具巨大的研究意义 。 。一3 脂肪酸去饱和酶是一类
跨膜型的蛋白 ,存在纯化上的难度 , 其三维晶体结构
还未破解 。 在脂肪酸去饱和酶中 , 只有可溶性的的
脂肪酸去饱和酶的结构已知 。 因此 , 对 △9 脂肪酸
去饱和酶的研究将对 。 一3 脂肪酸去饱和酶功能区域
的研究带来有益的提示〔’〕。 为进一步研究 。一 3 脂
肪酸去饱和酶的功能区域奠定基础 , 本文将可溶型
的蓖麻的 脂肪酸去饱和酶基因 rcd 和线虫 。一3 脂
肪酸去饱和酶基因 fat 一1 基因克隆人 Hi s融合表达
载体中构建重组表达载体 , 并对工程菌进行初步诱
导表达分析 , 为后续的结构分析提供条件 。
1 材料和方法
1.1 材料
实验操作主要根据分子克隆第 3 版〔‘] 进行 。
表达载体 pET 一3 2 a + 、 p R C D I 和 pC ES一t一 l 重组质
粒分别由哈佛大学康景轩博士和布鲁黑文实验室
John Shanklin 博士赠送 。 大肠肝菌菌株 D H 5a 、大肠
杆菌 BL2 1 (D E3) 等均为本室保存 。 限制酶 、 T4 -
D N A 连接酶 、 Ta q 酶购自TaK aRa 公司产品;胰蛋白
陈 、酵母提取物购于 O xi d 公司 , 琼脂糖 、生物琼脂
购自Si gm a 公司 , 其他试剂为国产分析纯 。 质粒
DN A 小量抽提试剂盒购于 Ta K aR a 公司 。
1
.
2 rc d 和fa 卜1 基因 cD N A 片段的扩增
根据 Gen ban k 蓖麻 的 脂肪酸去饱和酶和线虫
fa t一1 脂肪酸去 饱和 酶 CDN A O R F 序列 和载体
pE竹Za + (N ovagen)的多克隆位点设计引物 。
上游引物Pl :5‘A C GT 鱼达卫匹ATG GCTC TC 从GC 竹 ’ ,引
人 Ba血H l酶切位点(下划线);
下游引物 砚:5 ’C TG A 鑫鑫旦旦匹GC A GC T rCACT rG C3’ ,引
入 场nd l 酶切位点(下划线);
上游引物 玛 :5 ‘A C GT 旦燮卫旦AT G GTC以, C ATT CC3 ’ ,
引人 EeoR I酶切位点(下划线);
下游引物 P4 :5’C AT G 丛旦仁旦拐ACllw r(羌CT r巴’ ,引
人 凡nd l 酶切位点(下划线)。 以 pR C D I 和 pC ES-
fa t一 1 重组质粒为模板 , 热启动法进行 PCR 扩增 。
P C R 反应参数为:94 ℃变性 1m in 、5 5 ℃退火 455、7 2
℃延伸lm in ;循环 30 轮后 72 ℃保温 10m in 。 含有
成熟酶编码序列的PCR 片段电泳回收后 , 分别克隆
到 pE竹2a 十载体上 , 经 PCR 鉴定重组质粒后 , 委托
上海生物工程有限公司测序进一步鉴定 。
1
.
3 rc d 和 fa t一1 基因 cD N A 融合表达载体的构建
琼脂糖凝胶电泳回收上述 PCR 产物 , 用 Bam H
I 和 H ind l 酶切 rc d 基因 , 以 EeoR I 和 H ind l 双
酶切fa t一1 基因后 , 回收 rc d 和fa 卜l 基因的 cD N A 片
段 , 与经双酶切的 pET 一3 2a 十载体在 T4 一 D N A 连接酶
作用下 16 ℃过夜连接 , 构建 PET 一犯盯rc d 和 pET -
犯盯 fa t一 1 重组 表达 质粒 , 转化大 肠杆菌 B皿1
(DE3) 。 从转化板上挑取单菌落摇菌 , 提取质粒 ,
经双酶切鉴定和序列分析筛选出含重组质粒 pET-
32 盯rcd 和 pET 一犯州广瓦卜1 的工程菌株 。
1
.
4 Hi
s 一R c D 和 Hi s一F AT 一1 融合蛋白的诱导表达
将构建的 BL2 1(D E3 )工程菌接种于 LB 中培养
过夜 , 次日 , 取 50 闪菌液转接于 sml LB 培养液中 ,
37 ℃剧烈振荡 , 待A60 值达到0.5 左右时 , 在菌液
中加人异丙基硫代半乳糖昔 ( I件G ) 至终浓度为
0.5 m m心 L , 37 ℃诱导 1 一 Z h 。 取 lml 诱导培养物
离心收集菌体 , 用预冷的双蒸水洗两遍后重悬于
10 闪双蒸水中 , 加人等体积的 2 x SD S 加样缓冲
液 [ 100m m oF L Tris一 H C I ( p H 6 . 8 ) 、 2 0 m m o F L
D T
、
4 % S D S
、
12 % 澳酚蓝 、2 0 % 甘油〕, 1 0 0 ℃ 煮
3m in , 1 2 0 0 0 r/ m i n 离心 5 m in , 取 15闪加样到 11
年增刊 元冬娟等:蓖麻和线虫的两种不同结构脂肪酸去饱和酶的原核表达 395
% 的聚丙烯酞胺凝胶上进行电泳分析 。
1
.
5 融合蛋白的 W estern blotting 分析
用小鼠抗 Hi s单克隆抗体作一抗 , 辣根过氧化
物酶标记的山羊抗小鼠 IgG 作二抗 , 以 pE T 一3 2a +
载体的 B泣l (D E3) 菌体超声裂解物为对照 , 对含
pET 一32 盯rc d 和 pET 一犯州户t一 1 重组 质 粒 的 B皿l
(D E3 ) 工程菌诱导 2h 后的表达产物进行 W es te m
blotting 分析 。
2 结果
2.1 rc d和fa t一 1 基因 cD N A 片段的扩增
以构建的 pET 一32 盯rc d 和 pET 一32 州加t一 1 重组质
粒为模板 , 采用所设计的引物进行 PC R 扩增 , 取等
量的目的片段扩增液经 1% 琼脂糖 (1 x TA E )凝胶
电泳分析 , 在 1 18 帅 和 1 206 bp 处出现特异的条
带 , 大小与预期相一致(图 1) 。
示(图 2) , H i s 一 R C D 和 H is一 F A T 一 1 融合蛋白以可溶形
式表达 , S D S 一 P A G E 分析显示 (图3 ) 。 结果表明 , 与
诱导前相比 , 在相对分子量约 66k u 处出现明显的诱
导蛋白条带 , 分子质量大小与预期相一致 。 s D s -
P A G E 图像经扫描仪扫描后 , 用 Ban ds ca n 图像分析
软件进行光密度积分值分析 。 其表达量达到大肠杆
菌可溶性蛋白的 20 % 左右 。 而线虫 。一3 脂肪酸去
饱和酶在大肠杆菌中的表达 SD S一PA G E 没有明显增
亮的条带 。 因此 , 考虑用 Hi s一 t ag 抗体进一步检测其
表达 , 将诱导 2h 后菌体 的超声 裂解液 经 SD S-
PA G E 、电转移后 , 用小鼠抗 Hi s单克隆抗体作一抗 ,
辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG 作二抗进行免
疫印迹分析 , 出现明显的阳性反应条带(图 4 ) 。
图 l 脂肪酸去饱和酶基因原核
表达载体构建的电泳图
左图 :蓖麻 △9 脂肪酸去饱和酶;M ;M ark er , 1 : 蓖麻胡
脂肪酸去饱和酶基因 , 2 : p E 竹2a + ( Ba m H I 和 Hi nd ln )。
右图 :线虫 fa t一 1 脂肪酸去饱和酶;M : M ar ke r , 1 : 蓖麻 △9 脂
肪酸去饱和酶基因 , 2 : p E 钧2a + (Ec oR I 和 Hi nd 皿 )
图2 脂肪酸去饱和酶的原核表达 SDS 一P A G E 图
M : mar ke r 1. pE竹2。 + , 2 3 . 诱导与未诱导的融合表达的
蓖麻 的 脂肪酸去饱和酶;4一诱导与未诱导的融合表达的线虫
fa 卜1 脂肪酸去饱和酶
2 .2 重组质粒 pET 一32 盯rc d 和 pE T 一犯州户t一1 的鉴
定
从 LB 平板上挑取单克隆 ,接种于 3 ml L B 培养
基中 , 过夜摇菌 , 抽提质粒 , 以质粒为模板 , P C R 鉴
定重组质粒 , 1 % 琼脂糖凝胶电泳检测后 , 送上海生
物工程公司测序鉴定 , 测序结果表明 , rc d 和fa 卜1
基因 cD N A O R F 与目的序列完全一致 。
2
.
3 融合蛋 白在大肠杆菌中的诱导表达及 W es t-ern 一b l o t t i n g 分析
含 pET 一3 2 盯rc d 和 pE T 一3 2 州fo t一 l 的 BIZ I
(DE 3 )工程菌 I件G 诱导 Zh 后 , S D S 一P A G E 分析显
图 3 脂肪酸去饱和酶的可溶性分析 SD S 一P A G E 图
M : mark er l一 含 pE T 一32 盯rcd 重组质粒的 B I2 1 (D E3 )工程菌
11月)G 诱导 Zh 后的上清和沉淀;3 4 .含 pET 一犯对乙卜l 重组质粒
的 B 12 1 (D E 3) 工程菌I盯G 诱导 2h 后的上清和沉淀
生物杖术通报 B to te chn ole 盯 2008 年增干一J
图4 脂肪酸去饱和酶的免疫印迹结果
1 一 2 : 未诱导与诱导 的含 pET 一犯盯rcd 重组质粒的 B砚1
(D E3 )工程菌;3 一 4 : 未诱导与诱导的含 pE T一2州fo t一 1 重
组质粒的 BI2 1 ( D E3 )工程菌
2 .4 A nt he p ro 分析蛋白跨膜结构(图 5)
通过 Ant h即ro 软件分析蛋白跨膜结构的结果
显示 :蓖麻的△9 脂肪酸去饱和酶 R CD 为一个可溶
性的结构 , 这与 Joh n Shan kli n 的报道一致 。 而线虫
的 。一3 脂肪酸去饱和酶 FA T 一 1 为一跨膜型的结构 ,
具有2 个跨膜区 , 可在蛋白质疏水区穿膜4 次 。
图5 A nt h即ro t软件分析脂肪酸去饱和酶的跨膜区段15. 6]
A :Fat 一 1 脂肪酸去饱和酶 B :R C D 脂肪酸去饱和酶
酸去饱和酶为可溶型结构外 , 其余都为跨膜型结构 。
在跨膜型的结构中 , 具有特征性的 3 个保守组氨酸
富集区 :H X 3 4 H H , H XZ 一3 H H , ( 川Q)X2 一3 H H , 能与
一个二价铁离子结合形成酶活性中心 。 但在可溶型
结构中 , 具有 H XZ 一3 H H , ( 印Q)x2 一3 H H 这两个典
型的保守组氨酸富集区 。 至今为止 , 跨膜型的脂肪
酸去饱和酶的三维晶体结构还没有被成功破解 , 直
接导致对其功能部位的定位还停留在通过预测其二
级结构来分析可能的功能区段 , 并进一步通过区段
替换和点突变的方式来实现对其功能结构的研究 。
尝试通过在原核表达系统中表达蓖麻的可溶性脂肪
酸去饱和酶和线虫的fa 卜l 脂肪酸去饱和酶基因 , 为
进一步的功能分析提供条件 。 在所做的实验结果
中 , 蓖麻的 R C D 脂肪酸去饱和酶和线虫的fa 卜 l 脂
肪酸去饱和酶都得到了表达 , 但线虫的fa 卜1 脂肪酸
去饱和酶表达量偏低 , S D S 一P A G E 经考马斯亮蓝检
测未见明显的诱导带 。 鉴于此研究结果 , 打算进一
步研究4 个跨膜区段在跨膜型脂肪酸去饱和酶的功
能活性中的地位 , 为改造出一个高活性的 。一3 脂肪
酸去饱和酶的研究奠定基础 。
3 讨论
在多不饱和脂肪酸的生物合成过程[’〕中 , 一系
列的脂肪酸去饱和酶通过 。石 和 。一3 两条途径合成
相应的 。石 (包括 AA 等)和 。一 3( 包括 EPA 和 D H A
等)多不饱和脂肪酸 。 蓖麻的胡 脂肪酸去饱和酶
R CD 和线虫的 。一3 脂肪酸去饱和酶 FA T 一 1 分别是
多不饱和脂肪酸生物合成途径中的第一个酶和 。 一3
多不饱和脂肪酸合成的关键酶 。
脂肪酸去饱和酶由30 一 4 50 个氨基酸残基组
成 , 在已知的脂肪酸去饱和酶中 , 除ac yl一 A C P 脂肪
参 考 文 献
1 Kan g JX . W orld Rev Nutr Diet, 2 (X) 3 , 9 2 : 2 3 一 3 6 .
2 肠af A , K an g JX , 儿ao Y F , et al . C i rc u l at i o n , 2 0 0 3 , 1 0 7 : 2 64 6 -
2 6 5 2
.
3 T oc h
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, 玩av er M J , H od 脚n PA. Fro g U pid Res, 1 9 9 8 , 3 7
(
2 3
)
:
7 3
一 1 1 7
.
4 S a m b r o k E R
.
M o l e e u lar C l o ni n g : A 】习为ora to耳 M an u al ( C old S P ri n g
H ar b or l习〕. , C o l d S P ri n g H 汕or, N Y ) . Th i rd E d i t i o n , 2 〕X〕.
5 D ele age G , C o m b e t C , B l an e h et C , e t al . C o m p u t e rs i n B i o l o 群 an d
M edieine , 2
(X)
l
,
3 1
(
4
)
:
2 5 9
一 2 6 7
.
6 D e le a罗 G , C l e rc F F , R o u x B . C o m p u t e r A p p l i e a t i o n s i n t h e B i o s e i -
e n c e s ,
1 9 8 9
,
5
(
2
)
:
1 5 9
一 l 6()
.
7 元冬娟 , 江黎明. 生命的化学 , 2 0 6 , 2 6 ( 5 ) : 20 9 一 21 1 .