全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
猪 Ⅱ型圆环病毒 O RF2与猪 GM 2CSF基因
重组腺病毒共表达及免疫效果分析
陈降华 刘忠华 李文平
(湖南农业大学动物医学院 ,长沙 410128)
　　摘 　要 : 　旨在构建含融合基因 pGMCSF2ORF2的重组腺病毒 ,并对其表达水平和免疫效果进行分析。运用 PCR方法扩
增 PCV2 ORF2和 pGM 2CSF基因 ,拼接后克隆入 pMD182T载体 ,然后再亚克隆入腺病毒穿梭质粒 pShuttle2CMV中 ,阳性穿梭质
粒经 Pm eⅠ酶线性化后电转化含腺病毒基因组 (AdEasy21)的大肠杆菌细胞 BJ51832Ad21,成功获得了重组腺病毒 DNA。将纯
化后的重组腺病毒 DNA转染 AD293细胞 ,经过病毒基因组的 PCR和转录水平的 RT2PCR及 W estern blot等方面对融合蛋白
的表达进行了鉴定。以该病毒免疫 Babl/c小白鼠 ,对免疫小鼠血清中 PCV2抗体进行检测。结果显示 ,获得了 pGMCSF2ORF2
重组基因 ,重组腺病毒载体构建成功 ,获得了表达 pGMCSF2ORF2融合蛋白的重组腺病毒。该病毒免疫小鼠后 ,在小鼠血清中
检测到了 PCV2的特异性抗体。获得的重组腺病毒能有效表达 pGMCSF2ORF2融合蛋白 ,且可诱导小鼠产生针对 PCV2的特
异性抗体。
关键词 : 　猪 Ⅱ型圆环病毒 ORF2 pGM 2CSF 重组腺病毒 共表达 免疫效果
Co2expression of Recombinant Adenovirus Carrying
pGM 2CSF, ORF2 Gene of Porc ine C ircovirus
Type2 and Immunologica l Analysis
Chen J ianghua L iu Zhonghua L i W enp ing
( College of Anim al Science, Hunan Agriculture University, Changsha 410128)
　　Abs trac t: 　The recombinant adenovirus carrying chimeric gene pGMCSF2ORF2 was constructed, and the exp ression level and im2
munogenicity was analyzed1The pGM 2CSF, ORF2 gene of PCV2 was amp lified by PCR1The PCR p roducts were cloned into pMD182T
vector after chimeric1The interesting gene was subcloned into the shuttle p lasm id of pAdTrackCMV1The recombinant p lasm id and ade2
novirus backbone DNA were co2transformed into E1coli BJ5183 after digested by Pm eⅠand the recombinant adenovirus genom ic DNA
was obtained, the exp ression level ofwhich was screened under PCR, RT2PCR and W estern blot analysis1Then Babl/ c m ice were immu2
nized with the recombinant adenovirus, detected sera antibody about PCV2 of the m ice by EL ISA method1W e obtained pGMCSF2ORF2
gene, constructed the pAd2GF2 vector, and obtained the recombinant adenovirus carrying pGMCSF2ORF2 gene1The specific antibody a2
bout PCV2 has been found in serum of the immuned m ice1The recombinant adenovirus which exp rssed pGMCSF2ORF2 chimeric gene
efficiently may induce the m ice with specific antibody about PCV21
Key wo rds: 　PCV2 ORF2 pGM 2CSF Recombinant adenovirus Co2exp ression Immunogenicity
收稿日期 : 2009208227
作者简介 :陈降华 (19842) ,男 ,在读硕士 ,主要从事分子生物学与微生物学研究 ; E2mail: df0512@1261com
通讯作者 :李文平 (19612) ,女 ,教授 ,主要从事特种经济动物饲养与小动物鸡病学研究 ; E2mail: liwenp ing7222@1631com猪圆环病毒Ⅱ型 ( Porcine circovirus type 2, PCV2)属于圆环病毒科 ,圆环病毒属 ,为无囊膜单链环状DNA病毒 ,大小约为 117 kb,编码 2个主要的开放阅读框架 : ORF1和 ORF2[ 1, 2 ]。ORF2基因是 PCV2的重 要抗原基因 ,编码病毒的衣壳蛋白 (Cap 蛋白 ) ,在Cap蛋白上存在抗原表位 ,具有免疫原性 ,因此ORF2基因成为建立 PCV2特异性血清学检测方法及核酸疫苗研究的首选基因 [ 3, 4 ]。粒细胞 2巨噬细胞
2009年第 12期　　　陈降华等 :猪Ⅱ型圆环病毒 ORF2与猪 GM2CSF基因重组腺病毒共表达及免疫效果分析
集落刺激因子 ( granulocytemacrophage colony2stimu2
lating factor, GM 2CSF)是一个具有多项潜能的造血
生长因子 ,不仅能刺激造血祖细胞增殖、分化和成
熟 ,而且还能活化中性粒细胞、巨噬细胞、DC及其
它单核细胞 ,在细胞因子网络中占有重要地位 ,在免
疫反应中具有重要作用。D ranoff [ 5 ]首次将 GM 2CSF
作为免疫佐剂 ,增强了抗肿瘤疫苗的免疫反应 ,因而
被大量用作 DNA疫苗的免疫佐剂 ,以克服 DNA疫
苗免疫原性差的缺陷 ,从而控制和操纵特异性的免
疫应答。
本试验通过重组 PCR方法将 pGM 2CSF基因和
PCV2 ORF2拼接后获得融合基因 pGMCSF2ORF2,
采用非复制型腺病毒 5型为载体 ,构建含有融合
基因的重组腺病毒 ,并对其表达水平和免疫效果
进行了研究 ,以期为 GM 2CSF免疫佐剂作用的开
发利用和 PCV2 重组基因工程疫苗的研制奠定
基础。
1　材料与方法
111　材料
含猪圆环病毒 2型 ORF2全长基因和猪粒细
胞 2巨噬细胞集落刺激因子成熟肽基因的重组克隆
质粒 (分别命名为 pMD182ORF2; pMD182pGMCSF)、
大肠杆菌 JM109及重组腺病毒 pAd2ORF2均由广东
省温氏食品集团公司研究院构建和保存。腺病毒表
达系统 (AdEasyTM XL Adenoviral Vector System )为
Stratagene公司产品。T4 DNA连接酶、DNA Marker、
限制性内切酶 Kpn I和 X ho I、Ex Taq DNA 聚合酶、
dNTPs均为宝生物工程 (大连 )有限公司产品。限
制性内切酶 Pm e I和 Pac I为 New England B iolabs
产品。质粒抽提试剂盒和 DNA片段凝胶快速回收
试剂盒购自 Q IAGEN公司。脂质体为 Invitrogen公
司的 L ipofectam ineTM 2000。其他试剂均为进口或国
产分析纯试剂。试验 BABL /C小白鼠购自广东省医
学实验动物中心。
112　方法
11211 引物的设计与合成 根据已测序的 PCV2
ORF2基因序列和 pGM2CSF基因序列 ,利用 O ligo610
软件共设计 5条引物用于 SOE2PCR的扩增。
P1 : 5′2ATTGGTACCGCCACCATGTGGCTGCAG2
AACCTGCTT23′
P2 : 5′2GGCAGCTTCTTTAGCGGCAGCTTCGGC2
CAGCTTTTTGACTGGCCCCCAGCAG3′
Rp : 5′2GGCAGCTTTAGCGGCAGCTTCTTTAGC2
GGCAGCTTCTTTAGCGGCAGCT323′
P3 : 5′2GCTAAAGAAGCTGCCGCTAAAGCTGC2
CGCTATGACGTATCCAAGGAGGCGT23′
P4 : 5′2ATTCTCGAGTTAAGGGTTAAGTGGGGG2
GTCT23′
P2、P3 分别带有 L inker 序列片段 TTAGCG2
GCAGCTTCGGCCAGTTTTGA , Rp带有与 L inker互补
的片段 ,使基因的重叠扩增得以顺利的进行 ; P1含
一个 Kpn I限制性内切酶位点 , P4含一个 X hoⅠ限制
性内切酶位点 ,便于重组腺病毒表达载体的构建 ,上
述引物均由上海生物工程有限公司合成。
11212　融合基因 pGMCSF2ORF2的扩增 分别以
P3 / P4为引物、重组质粒 pMD182ORF2为模板 ,按照
Ex Taq酶说明书进行 ORF2基因片段的 PCR扩增 ,
扩增产物 5′端带有 linker序列 ,然后以得到的产物
为模板、P3 /Rp为引物再次扩增。以 P1 /P2引物、重
组质粒 pMD182pGMCSF为模板 ,按照 Ex Taq酶说
明书进行 pGM 2CSF基因片段的 PCR扩增 ,扩增产
物 5′端带有 linker序列。同样以得到的产物为模
板、P1 /Rp为引物再次扩增。 PCR产物经琼脂糖凝
胶电泳确认正确后 ,以 P1 / P4为引物、上步的 PCR
产物为模板进行 pGMCSF2ORF2融合基因的 PCR扩
增。反应体系为 100μl:上步 PCR产物各 2μl; P1 /
P4各 1μl; 10 ×Ex Taq缓冲液 10μl; 215 mmol/μl
dNTP 8μl; 25 pmol/ L Ex Taq DNA聚合酶 1μl;加
灭菌去离子水至 100 μl。反应条件 : 94℃预变性
2 m in; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 90 s, 30个循环 ,最
后 72 ℃延伸 10 m in。用 DNA凝胶快速回收试剂盒
回收 1 230 bp左右的片段 ,两端分别带有和 X hoⅠ
限制性内切酶位点。
11213 融合基因重组穿梭载体的构建 将回收的
目的片段克隆入 pMD182T Sim le载体 ,筛选阳性重
组质粒送大连宝生物工程有限公司测序。阳性重组
质粒经 KpnⅠ和 X hoⅠ双酶切后回收目的基因 ,然后
连接到腺病毒穿梭载体 pShuttle2CMV。按常规方法
将连接产物转化大肠杆菌 JM109,在含卡那霉素的
LB琼脂平板上筛选 ,挑选克隆后 ,进行 PCR鉴定和
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
行双酶切鉴定。将鉴定正确的阳性重组穿梭质粒送
宝生物工程 (大连 )有限公司进行序列测定 ,测序正
确的克隆命名为 pShuttle2GF2。
11214 嵌合基因腺病毒表达载体的构建 重组腺
病毒穿梭质粒 pShuttle2GF2用 Pm e I酶切线性化 ,酚
氯仿抽提纯化后电击转化大肠杆菌电转化感受态细
胞 BJ51832AD21,取适量大肠杆菌细胞涂布含 50μg/ml
卡那霉素的 LB培养板中 ,于 37℃培养过夜 ,挑选最
小克隆 ,小量提取质粒 DNA ,进行 Pac I限制性内切
酶酶切分析。将所得的重组腺病毒质粒转化超级感
受态细胞 XL102Gold,涂布含 50μg /m l卡那霉素的
LB培养板 ,挑取目的克隆 ,将获得的重组腺病毒质
粒命名为 pAd2GF2。
11215 重组腺病毒融合基因的转染与鉴定 用
Q IAGEN质粒抽提试剂盒大量抽提阳性重组腺病毒
质粒 ,用 Pac I酶切 ,以切去 ori和 kana抗性基因等
质粒构件 ,并暴露其反转末端重复序列 ( ITR )。用
脂质体介导的方法转染 70% ～ 80%饱和度的
AD293细胞 ,具体方法参照说明书的方法进行。转
染后的 AD293细胞 37℃ 5% CO2条件下继续培养 ,
直至产生细胞病变 ,收集细胞 ,反复冻融 3次。取病
毒上清接种 AD293细胞 ,以含 2%小牛血清的完全
DMEM培养液于 37℃ 5% CO2条件下培养 ,逐日观
察细胞病变 (CPE)。待 AD293细胞完全病变后 ,收
集病毒感染的病变细胞 ,连同上清冻存于 - 20℃。
收集病毒液 ,提取 DNA和 RNA ,分别用特异性引物
进行 PCR鉴定和 RT2PCR鉴定。
11216　pAd2GF2在 AD293细胞中表达的融合蛋白
W estern blot分析 分别取 10 m l重组腺病毒 AD293
细胞培养物和正常 AD293细胞培养物 , 8 000 r/m in
离心 10 m in; 取上清 , 加入 8% PEG26000 和 2%
NaCl, 4℃搅拌过夜 ; 12 000 r/m in离心 20 m in,弃上
清 ;用 011 M的 PBS溶解沉淀 , 4℃过夜 ; 12 000 r/m in
离心 10 m in,取上清 , - 20℃冻存备用。将提取的蛋
白进行 SDS2PAGE电泳 ,转印到硝酸纤维素膜上后 ,
10%脱脂乳封闭过夜 ;加入 1∶100 PCV2抗血清室
温作用 2 h;洗涤 3次 ,加入 1∶2 000的 SPA2HRP,室
温作用 115 h;充分洗涤后 ,使用 Super Signal W est
Pico Trial Kit显色后进行 X光显影 ,观察特异蛋白
条带。
11217 小鼠免疫及 PCV2特异性抗体的检测 将
30只 SPF级 7周龄雌性 BABL /C小鼠随机分为 3
组 ,每组 10只。断尾采血进行腺病毒和 PCV2抗体
检测 ,阴性小鼠用于免疫。第 1组小鼠皮下注射 012 m l
108 TC ID50的重组腺病毒 pAd2GF2;第 2组小鼠皮下
注射 012 m l 108 TC ID50的重组腺病毒 pAd2ORF2;对
照组注射同等剂量的 PBS。15 d后断尾采血获得一
免血清 ;然后进行与初免相同的免疫 ,分别在二免后
10、20、30 d分别采血。用间接 EL ISA测定抗体 ,具
体操作参照北京世纪元亨动物防疫技术有限公司
EL ISA试剂盒说明书进行 ,但将二抗换成山羊抗小
鼠 IgG。
2　结果与分析
211 嵌合基因 pGMCSF2ORF2的扩增
以 P3 /Rp为引物扩增得到的 ORF2基因片段大
小约为 750 bp左右 ;以 P1 /Rp引物扩增得到的 pGM 2
CSF基因片段大小约为 5 00 bp左右 ;以 P1 /P4引物
成功扩增得到长度约为 1 230 bp的 pGMCSF2ORF2
基因 ,这些扩增产物长度均与预期的大小一致 (图
1)。说明采用 SOE2PCR 方法成功地构建了 pG2
MCSF2ORF2融合基因。
11DNA分子质量标准 ; 21pGM2CSF基因 ; 31ORF2基因 ;
41pGMCSF2ORF2融合基因
图 1　嵌合基因 pGM CSF2O RF2的 PCR扩增
212　重组腺病毒穿梭质粒的鉴定
嵌合基因重组穿梭质粒 pShuttle2GF2经 Kpn I
和 Xho I双酶切出现大小分别约为 7 000 kb和 1
230 bp的两条片段 (图 2) ,重组穿梭质粒测序结果
也表明与预期结果一致。
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2009年第 12期　　　陈降华等 :猪Ⅱ型圆环病毒 ORF2与猪 GM2CSF基因重组腺病毒共表达及免疫效果分析
11DNA分子质量标准 ; 21Kpn I和 X hoⅠ双酶切重组质粒 ;
31DNA分子质量标准
图 2　重组穿梭质粒 pShuttle2GF2的酶切鉴定
213　重组腺病毒质粒的酶切鉴定
重组穿梭质粒 pShuttle2GF2在含腺病毒骨架质
粒 pAdEasy21的大肠杆菌细胞 BJ51832Ad21中与腺
病毒骨架质粒进行重组。挑取重组细菌并提取质
粒 ,阳性重组质粒 pAd2GF2经 Pac I酶切后产生 30 kb
和 415 kb的两个片段 (图 5 ) ,表明嵌合基因 pG2
MCSF2ORF2成功重组成腺病毒质粒。
11DNA分子质量标准 ; 21重组质粒 pAd2GF2 Pac I酶切的产物
图 5　重组腺病毒质粒 pAd2GF2的酶切鉴定
214　重组腺病毒的获得与鉴定
转染 pAd2GF2的 AD293细胞 4 d后发生细胞
病变 ,对照细胞不发生病变。收集病毒感染的病
变细胞 ,提取 DNA和 RNA ,分别用特异性引物进
行 PCR鉴定和 RT2PCR鉴定 ,均可扩增出目的条
带 (图略 )。W estern blot结果表明重组腺病毒在
AD293细胞中表达出分子量大小约为 47 kD的目
的蛋白条带 ,大小与预期的蛋白质分子量一致 (图
6)。说明表达的重组蛋白能被 PCV2感染猪的阳
性血清所识别。
11蛋白质分子质量标准 ; 21接种重组腺病毒的 AD293细胞 ;
31正常 AD293细胞
图 6　重组腺病毒的 W estern2blot鉴定
215　免疫小鼠的抗体检测
pAd2GF2一免后 15 d抗体平均值为 01249,二
免后 10、20、30 抗体平均值分别为 01352、014、
01422; pAd2ORF2一免后 15 d抗体平均值为 01233,
二免后 10、20、30抗体平均值分别为 01312、01343、
01353。结果 (表 1)表明 ,两种重组腺病毒均可诱导
小鼠产生针对 PCV2的特异性抗体 ,且 pAd2GF2比
pAd2ORF2产生的抗体水平更高。
表 1 重组腺病毒免疫小鼠特异性抗体的 EL ISA测定结果
免疫天数 ( d)
试验分组 15 25 35 45
对照组
01105 ±
010025 01107 ±01001 01110 ±01002 01109 ±010018
pAd2ORF2 01233 ±
01004 01312 ±01009 01343 ±01006 01353 ±01011
pAd2GF2 01249 ±
010082 01352 ±010075 01400 ±010032 01422 ±0101
3　结论
猪圆环病毒 Ⅱ型 ( PCV2)是引起猪断奶后多系
统衰竭综合征的主要病原 ,常与猪细小病毒 ( PPV )、
猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒 ( PRRSV )混合感染
猪只。临床上主要表现为渐进性消瘦 ,采食量下降 ,
生长迟缓 ,被毛粗乱 ,精神差 ,有的猪只出现贫血 ,皮
肤苍白等症状。据统计 , PCV2相关性疾病在 2005
年给欧洲造成的损失约为 5亿欧元 ,给我国造成的
损失则更为严重 ,尤其是给规模化、集约化养猪业造
成了巨大的经济损失 ,严重危害养猪业的健康发展。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
目前 ,我国尚无注册及国产的 PCV2商品化疫苗 ,而
且 PCV2疫苗使用还不是很普及 ,主要原因可能是
由于我国在畜牧养殖生产中对 PCVD的认识不足及
国外 PCV2疫苗价格较高 ,因此研制拥有我国自主
知识产权的 PCV2商品化疫苗迫在眉睫 [ 6～8 ]。
GM 2CSF作为一种具有多项潜能的造血生长因
子 ,它不但可以促进骨髓前体细胞的增殖和分化 ,提
高外周血细胞的水平 ,而且能够增强抗原递呈细胞
(APC)的功能 ,增加细胞表面 MHC分子、协同刺激
分子 (CM )和粘附分子的表达 ,增强抗体依赖的细
胞毒活性以及促进细胞分泌细胞因子。因此它在疾
病治疗、预防及作为疫苗佐剂方面具有广泛的应用
前景 [ 9 ]。
试验中所使用的腺病毒载体是缺失了 E1 /E3
基因的人腺病毒血清 5型 (Ad5) ,具有无致病性、产
生野生型腺病毒几率非常低、克隆空间大、作用效果
较持久等特点。外源基因克隆至穿梭载体 pShuttle2
CMV后 ,在大肠杆菌 BJ51832Ad21中与腺病毒骨架
载体 pAdEasy21发生同源重组。正确的同源重组有
2种方式 ,即左、右臂之间同源重组和复制起始点、
右臂之间同源重组。用 Pac I酶切同源重组质粒产
生约 30 kb和 310 kb的条带 ,为左、右臂之间同源重
组 ;产生约 30 kb和 415 kb的条带 ,则为复制起始位
点同源重组。E1基因与腺病毒的复制有关 , AD293
细胞中表达 E1基因 ,因此同源重组后的腺病毒可
以在 AD293细胞中复制 ,并可对外源基因进行正确
的翻译和修饰 ,使表达的蛋白具有与天然蛋白相同
的生物活性 [ 10～12 ]。
本研究采用 SOE2PCR方法获得 pGMCSF2ORF2
融合基因 ;将其克隆到穿梭载体 p shuttle2CMV中 ,成
功构建了重组腺病毒载体 ; Pac I酶切鉴定为复制起
始位点同源重组模式 ;将纯化的重组腺病毒 DAN转
染 AD293细胞 ,获得了表达 pGMCSF2ORF2的重组
腺病毒 ;用该病毒免疫小鼠 ,并以 pAd2ORF2免疫组
及空白组作为对照 , EL ISA结果表明 pAd2ORF2和
pAd2GF2均可诱导小鼠产生针对 PCV2的特异性抗
体 ,且后者产生的抗体水平更高。这为进一步研究
pGM 2CSF免疫佐剂作用和开发 PCV2基因工程疫苗
奠定了基础。
参 考 文 献
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