全 文 ：生物杖术通报
· 研究报告 · 丑了口百泞口乙 年增干
应用混合菌系实现右旋磷霉素手性生物转化的初步研究
周丽沙, , 安海英 , 李慧‘ 杨伟超 , 徐慧‘ 史荣久 ‘
’ 中国科学院沈阳应用生态研究所陆地生态过程重点实验室 , 沈阳
中国科学院研究生院 , 北京 。以科 东北制药集团股份有限公司 , 沈阳
摘 要 探索了一条通过混合菌系把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的生物转化新途径 。 采用 “ 右旋磷霉素
利 用菌”和 “左旋磷霉素抗性菌” 两种筛选模型 , 从某制药厂土壤中筛选到 了 株右旋磷霉素利用菌和 株左旋磷
霉素抗性菌 。 将上述 株菌混合接种到以 右旋磷霉素为唯一碳源的无机盐培养基中, ℃ 、巧 培养
一 , 经磷霉素敏感菌生物检测 、薄层层析 检测 , 初步确证了转化产物 中存在左 旋磷霉素。 付右旋磷霉素
的手性生物转化条件进行 了初步探索 , 发现接种时带入 少量 肉汤培养基甘转化有促进作用 , 而微量元素 了一 和
一 甘转化没有促进作用 。 为在磷霉素生产中减少资源浪费和提高产量提供了理论依据 。
关键词 右旋磷霉素 左旋磷霉素 混菌发酵 手性生物转化 生物检测
一
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s即 and T hin L ayer C hro m ato『叩hy (TLC ). M eanw hile , t h e e o n d i t i o n s o f e h i r a l b i o t r a n s fo rm a t i o n w e re p re l i m i n a ri l y s t u d -
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the existing P ro d uetion Pro ee dure of F O M .
K e y w o rd s : D 一fo s fo m y e i n L 一 fo s fo m y e i n M i x e d b a e t e ri a l e u l t u r e C h i ra l b i o t ra n s fo rm a t i o n B i o a s s a y
磷霉素(Fosfo m yein , F O M , 化学名( 一 ) 一 ( l r , 2 5 ) -
l
,
2
一环氧丙基磷酸)是 1969 年 H endlin 等从弗氏链
霉菌(Streptam yees fra diae )发酵液中分离到的一种
新型抗生素〔’〕。 磷霉素的分子结构与磷酸烯醇式
丙酮酸相似 , 与其不可逆地竞争性结合 U DP 一 N 一乙酞
葡萄胺(UD P 一 N A G ) 转移酶 , 使 UDP 一 N A G 转移酶失
活 , 从而干扰 细菌细胞壁肤 聚糖合成的早 期阶
段[’〕。 磷霉素具有广谱 、高效 、低毒 、过敏反应少 、
无交叉耐药性等优点 , 因而广泛应用于治疗肠道感
染和泌尿系统感染 。
基金项 目:辽宁省产学研合作技术联盟项目和沈阳市科技攻关计划资助
作者简介 :周丽沙(19 82 一 ) , 女 , 硕士研究生 , 主要从事环境微生物研究;E 一 m ail : ru b 刃804 02 @ yah o .co m .cn
通讯作者:徐慧 ,研究员:E 一 m a i l : x u h u i @ ia e · a c · c n
年增刊 周丽沙等:应用混合菌系实现右旋磷霉素手性生物转化的初步研究 375
目前 , 工业上以化学全合成法生产磷霉素 ,其关
键步骤是中间产物顺式丙烯磷酸 (cP A )的环氧化 ,
所得产物为左旋磷霉素仁( 一 ) F O M 〕和右旋磷霉素
「( + )FO M 」的外消旋混合物 , 需再经手性拆分试剂
苯乙胺拆分才能获得左旋磷霉素【’〕。 因产生了等
量的无生物活性右旋磷霉素 , 所以该工艺实际收率
较低 ,这既造成资源浪费 , 又向环境排放大量含磷废
水 。 因此 , 开发简单易行 、经济成本低的右旋磷霉素
手性转化技术 , 对提高企业资源利用率 、减少污染物
排放具有重要意义 。
目前 , 已报道的磷霉素生物转化研究均集中在
探索顺丙烯磷酸(CPA )转化为左旋磷霉素的途径 。
19 71 年 , W hi te 等人首次筛选到多株可催化顺丙烯
磷酸环氧化为左旋磷霉素的青霉菌 , 证实发酵液中
不存在左旋磷霉素的对映体 , 也不能催化反式丙烯
磷酸的环氧化[4]。 后来 , 又筛选到了多个种属的细
菌和放线菌具有同样的催化立体选择性 , 产物均为
左旋磷霉素单一对映体;但因底物抑制 、转化效率低
等原因 , cP A 一 左旋磷霉素途径的研究还仅停留在
实验室研究阶段 , 难以获得应用 。 将顺丙烯磷酸通
过化学不对称反应合成为磷霉素的途径也有报道 ,
但存在对映体选择性较差 、不能合成纯单一对映体 、
反应条件苛刻、反应副产物复杂且难以分离等严重
缺陷[’ , 6 ) 。
把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的研究鲜见报
道 , 北京科莱博医药开发有限公司探索了采用化学
催化方法将右旋磷霉素转化为左旋磷霉素 , 但由于
立体选择性差 、副产物多且成本很高 , 尚难实现工业
化[’] 。 利用微生物进行手性生物转化具有立体选
择性高 、副产物少 、反应条件温和及环境友好等优
点 。 但迄今尚未见有关右旋磷霉素生物转化为左旋
磷霉素的报道 。 土壤中蕴藏着种类繁多 、功能多样
的微生物资源 。 本研究利用 “ 右旋磷霉素利用菌 ”
和“ 左旋磷霉素抗性菌” 两种模型筛选功能菌株 , 探
索了应用混合菌系实现无生物活性右旋磷霉素转化
为左旋磷霉素的可行性 , 并对右旋磷霉素手性生物
转化条件进行了初步研究 。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1 1 菌种 手性生物转化菌株 :从某制药厂长期
堆放废弃右旋磷霉素库房附近的土壤中筛选 。
左旋磷霉素敏感检验菌:大肠杆菌(Es ch eri ch ia
co h ) , 以肉汤培养基对其活化 、备用 。
1
.
1
.
2 培养基 筛选培养基 A (转化培养基 ) :
KZH P04 19 , K H Z P O 4 1 9 , N a C I 0 . 5 9 , N H 4 C I 1 9 , M g S O 4
·
7 H
2
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.
2 9
,
C
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C 1
2
1 5 m g
,
F
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·
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,
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4 m g
,
M
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S O
4
·
H
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O 4 m g
,
p H 7
.
0
一 7
.
5 ,
维生素复合液[8]0 .1% , 定容至 IL , 12 1 ℃湿热灭菌
20m in 。 使用前加人 0.5% 右旋磷霉素作为唯一碳
源 。 固体培养基加2% 琼脂 。
筛选培养基 B :牛肉浸膏 0.5% , 蛋白陈 1% ,
N
a
C I 0
.
5 %
,
M g S 0
4
·
7 H
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.
0 1 %
,
M
n
S O
4
·
H
Z
O O
·
0 1 %
, 琼脂 2% , p H 7 . 0 , 1 2 1 ℃湿热灭菌 20而n , 在融
化状态下加人质量不等的左旋磷霉素 , 使其终浓度
分别为0.5% 、 1 . 0 % 、 1 . 5 % 。
肉汤培养基 :牛肉浸膏 0.5% , 蛋 白豚 1% ,
N
a
C I 0
.
5 %
,琼脂 2% 。
1
.
1
.
3 实验试剂 右旋磷霉素苯乙胺盐 、标准磷霉
素皆由某制药厂提供;硅胶板 , 青岛海洋化工厂生
产;化学试剂皆为分析纯 ,其它为生化纯试剂 。
1
.
2 土壤悬液制备及功能菌株筛选
取土样 ro g加人 90 耐 生理盐水 , 混匀后将土
壤悬液进行系列梯度稀释 , 取适合稀释度分别涂布
于筛选培养基 A 和筛选培养基 B , so ℃培养 4 一 s d 。
挑取单菌落接种肉汤培养基斜面 , 30 ℃ 培养 48h , 将
培养好的斜面置于 4℃冰箱保存。
1
.
3 生物转化实验
1.3.1 混菌体系对右旋磷霉素的手性生物转化
上述斜面保藏菌种经两次活化 , 分别从斜面上刮下
一环 , 接种到肉汤培养基中培养至 o D60n。 = 0 . 8 -
1
.
0
。 离心收集菌体(8 0() 0“m in , 1 0 m i n ) , 无菌生理
盐水清洗 3 次 , 用无菌生理盐水将菌液浓度调整为
108 /ml , 按体积比 1% 的接菌量转接到以右旋磷霉
素为唯一碳源的转化培养基中(25 0ml 三角瓶中装
有 50m l无机盐培养基 ) , 3 0 ℃ 、 1 5 O r/ m i n 振荡培养 3
一 s d 后 , 发酵液经 4 500r/ m in 离心 10m in , 取上清液
供测试 。
1
.
3
.
2 肉汤对右旋磷霉素手性生物转化的影响
将 1.3.1中培养至对数期的各菌液 , 不经生理盐水
清洗菌体 , 直接按体积比 1% 接种至转化培养基 , 培
生物技术通报 B to tec h noto gy 2008 年增刊
养条件同 1.3.1。
1
.
3
.
3 Co
, 一 和 V O 3一 对右旋磷霉素手性生物转化
的影响 在 1.3.1转化实验培养 24h 后 ,加入 CoC 几
和 N aV 0 3 ,使其终浓度均为0.01 % 。 培养条件同 1.
3.1。
1
.
3 中的上述生物转化实验分别设 3 个对照
组 :对照 1( 不含右旋磷霉素底物、不接菌对照) , 用
以排除培养基中其它抑菌成分的干扰;对照 2( 含右
旋磷霉素底物 、不接菌对照) , 用以排除非微生物作
用引起的右旋磷霉素手性转化 ;对照 3( 不含右旋磷
霉素底物 、 只接菌对照 ) , 用以排除菌种本身产生其
它抑菌物质的干扰 。
1
.
4 发酵液左旋磷霉素的检测与鉴定
1.4 . 1 生物检测 制备生物鉴定平板:在 20 x
30cm 生物鉴定盘中 ,加入 Zo ml 融化的肉汤培养基
静置凝固 , 形成下层平板;另于 lo ml 融化的肉汤培
养基中加人适量指示菌 , 迅速混匀后平铺于下层平
板上 ,作为上层平板 。 待双层平板凝固后 , 将直径
7.sm m 的牛津杯轻轻地压在平板上 。
将发酵上清液或磷霉素标准品溶液(20 闪)加
于牛津杯中 , 37 ℃ 培养 16 h , 若发酵液中含有磷霉
素 , 可产生透明抑菌圈 。
1
.
4
.
2 发酵液薄层层析(TLC ) 取发酵上清液和
磷霉素标准品溶液进行薄层层析 , 展开剂系统为
「9] :正丁醇 :冰乙酸 :水 = 3: 1: 1 。
生物显影 :将已展层完毕的薄层板室温风干 , 倒
置平贴于 20 x 30c m 的生物鉴定平板中 , 于 37 ℃培
养 16h 。 由抑菌区计算 Rf , 定性分析发酵液转化产
物。
2 结果与讨论
2.1 菌种筛选
采用 “右旋磷霉素利用菌和左旋磷霉素抗性
菌” 两种筛选模型 , 从某制药厂长期堆放右旋磷霉
素的土壤中筛选到 76 株右旋磷霉素利用菌和 89 株
左旋磷霉素抗性菌 。 分别选取 7 株不同形态 、 生长
较快的右旋磷霉素利用菌和 6 株耐受较高左旋磷霉
素浓度的左旋磷霉素抗性菌用于下一步的生物转化
实验 。
2
.
2 右旋磷霉素手性生物转化
2.2.1 混菌发酵的结果 将2.1 中的 13 株菌在肉
汤培养基中扩大培养后 , 用生理盐水清洗菌体 3 次 ,
接种至以右旋磷霉素为唯一碳源的无机盐培养基 ,
混菌发酵转化产物的抑菌圈直径大小随时间变化情
况如图 l所示 。
~
不接菌的对照
2 「 一 菌悬液棍合接种l%
~ 肉汤培养物直接接种1%nU只6
勺乙I-
】4
l2
三已牛侧田一褪军
48 72
取样时l认J(11)
9 6 12 0
图 1 混菌发酵转化产物在不同
时间的抑菌圈直径
图 1结果显示 , 在 72 h 内 , 混菌发酵转化产物的
抑菌圈直径高于不接菌的对照 , 表明右旋磷霉素利
用菌和左旋磷霉素抗性菌混合菌系具有产生某种抗
菌活性物质的能力 。
2
.
2
.
2 肉汤对转化的影响 2.1 中的 13 株菌在肉
汤培养基中扩大培养后 , 直接接种到转化培养基中 ,
转化结果见图 1 。 在48 一 7 2 h , 带有少量肉汤培养基
处理的抑菌圈直径大于菌悬液接种 , 这表明少量肉
汤培养基对转化具有一定促进作用 。 其原因可能
为:一方面 , 混合微生物在能以右旋磷霉素作为唯一
生长的碳源的同时 , 少量的肉汤培养物能促进微生
物更好生长;另一方面 , 肉汤培养基里所含有的葡萄
糖和磷酸盐等成分可能会阻抑转化产物左旋磷霉素
进人菌体内 , 降低了产物对菌体的毒害作用[’。〕。
2
.
2
.
3 发酵产物中左旋磷霉素的 TLC 鉴定 分别
取 2.2.1 和 2.2.2 转化实验中的 48h 发酵上清液
200林l和磷霉素标准品 (50卜g/ m l , 5 林l)进行 TLC 分
析 ,结果见图 2 。 从图 2 可以看出 , 混菌发酵的转化
产物与左旋磷霉素标准品的比移值相同 , 表明转化
产物可能为具有生物活性的左旋磷霉素。
2
.
2
.
4 微量元素对转化的影响 eo, 十 、 V O 。一 是细
菌环氧化 cPA 合成左旋磷霉素所必需的微量元
素〔‘, 川 ,但是否对右旋磷霉素的手性生物转化也起
到促进作用还尚未可知 。 本实验初步考察了这两种
年增刊 周丽沙等:应用混合菌系实现右旋磷霉素手性生物转化的初步研究 37 7
图2 右旋磷易素手性生物转化产物的薄层层析图
1:发酵液 , 2 : 发酵液含微量元素 , 3 : 对照 , 4 : 磷霉素标准
离子对混合菌系手性转化右旋磷霉素的影响 , 结果
见图 3 。
3 结论
本实验先从土壤中筛选出右旋磷霉素利用菌和
左旋磷霉素抗性菌 , 再应用右旋磷霉素利用菌和左
旋磷霉素抗性菌的混合菌系进行右旋磷霉素转化为
左旋磷霉素的手性生物转化研究。 研究结果证明 ,
以右旋磷霉素为底物 , 通过右旋磷霉素利用菌和左
旋磷霉素抗性菌混合菌系进行生物转化/催化 , 可以
获得有抑菌活性物质 , 薄层层析结果初步证明其为
左旋磷霉素。 上述结果初步证明了采用生物催化/
转化方法将右旋磷霉素转化为左旋磷霉素是可行
的 。
对右旋磷霉素手性生物转化条件的初步探索表
明 ,转接少量肉汤培养基后 , 转化率由4.40 % 提高
至 5.41% 。 , 说明少量肉汤培养基对生物转化具有
促进作用 。 微量元素 co , ‘ 、 v o , 一 对右旋磷霉素、
左旋磷霉素途径的手性转化没有促进作用 。
图3 微纽元素对转化的影响
图 3 结果表明 , 添加微量元素钻和钒后 , 抑菌圈直径
明显减小 , 表明钻和钒对右旋磷霉素的手性转化不
仅没有促进作用 , 反而有抑制作用 。 由此 , 我们推测
从右旋磷霉素转化为左旋磷霉素与从 CPA 合成左
旋磷霉素是两条不同途径 , 分别由微生物不同的功
能酶完成的 , 因此 , 对 cP A一左旋磷霉素起促进作用
的 CO, + 、 v o , 一 对右旋磷霉素。左旋磷霉素途径没
有类似的促进作用 。
参 考 文 献
1 Hendlin D , S ta p l e y E O , J ac k s o n M , e t al . Sc i e n e e , 1 9 6 9 , 1 6 6
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J 0 rg C h 阴 , 1 9 7 0 , 3 5 :
3 5 1 0
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4 W llite R F , B i m b a u m J
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5 5
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5 张治国 , 王故燕 ,孙川 , 等. 有机化学 , 2 以科 , 24 : 7 一 1 4 .
6 F ie ld s S C
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T e l兀山edro n , 1 9
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1 2 2 3 7
一 1 2 2 7 3
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7 张猛 , 李继军 , 余铮 , 等. 中国 , 2 0 51 0 06 6 9 59 . 6 [ P ] . 2 以拓 一 1
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8 Ito h N , K u s ak a M , H i m t a T , e t al
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9 石家骥 , 葛猛. 微生物学报 , 2 (X) 6 , 4 1 ( 3 ) : 3 5 3 一 3 5 6 .
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