全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
弓形虫上海株的棒状体蛋白 ROP2的克隆表达及纯化
蒋蔚 王权 陈永军 聂福旭
(中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室,上海 200241)
摘 要: 根据已发表基因序列 ( G enBank登录号为 Z36906)设计引物, 以弓形虫 (Toxop lasm a gondii)上海本地株的基因
组 DNA为模板 ,扩增编码 ROP2( rhpo try prote in 2)蛋白的基因片段,定向克隆至表达质粒 pET32a( + ), 重组质粒经限制性酶
切鉴定后测序, 结果表明插入片段长度为 1 044 bp,与 GenBank上登录的序列相比,同源性为 96% - 100% , 其中与弓形虫 RH
株的 rop2基因同源性为 100%。重组原核表达质粒 pET32arop2转化至大肠杆菌 BL21( DE3), 经诱导可表达分子量约 609 kD
的融合蛋白, 能被感染弓形虫 RH株的绵羊阳性血清识别。
关键词: 弓形虫本地株 ROP2蛋白 克隆表达
Expression and Purification of the ROP2 Protein from Toxop lasma
gond ii Shanghai Local Strain
J iangW ei W angQuan Chen Yongjun N ie Fuxu
(K ey Laboratory of Animal Parasitology of theM inistry of Agriculture, Shanghai Veterinary R easerch Institute, CAAS, Shanghai 200241)
Abstrac:t P rim ers w ere designed according to the rhpotry prote in 2 ( ROP2) gene sequence o fToxop lasm a gondii pub lished in
GenBank( Z36906) W ith the spec ific pr im ers and DNA from Toxop lasm a gond ii Shangha i loca l strain, the rop2 gene fragm en ts w ere
produced by po lym erase cha in reaction and c loned into the pET32a( + ) vectorw hich conta insH is tags at the C and NendsThen the
recomb inant p lasm id pET32 rop2 was transform ed in to E coli BL21( DE3) and induced w ith IPTG The c loned genew as 1 044 bp and
identity rang ing from 96% to100% when nucleotide sequencesw ere compared toGenBank database sequences, wh ile had 100% hom o l
ogy to the sequence of ROP2 from RH stra in SDSPAGE andW estern b lo t analysis show ed that the ta rget recom binant prote in w ith the
m olecular we ight o f 609 kD w as hype rexpressed in the form of inc lusion body These recom binant prote insw ere purified byN i2+ affin
ity chrom atography The result indicates that the recom binant ROP2 prote in cou ld be spec ifica lly recognized by immune serum aga inst
Toxop lasm a gondii from sheep and could be used fo r serod iagnos is and vacc ination
Key words: T oxop lasm a gondii ROP2 C lon ing expression
收稿日期: 20090921
基金项目:农业公益性行业科研专项经费项目 ( 200803017) ,上海市科技兴农重点攻关项目沪农科攻字 [ ( 2006)第 54号 ]
作者简介:蒋蔚,女,硕士研究生,研究实习员,研究方向:弓形虫分子生物学和诊断学; Em ai:l j iangw ei jw99@ 163 com
弓形虫病 (Toxoplasmosis) 是由刚地弓形虫 (Tox
oplasma gondii) 引起的严重的人兽共患原虫病,该病
对免疫功能低下者及孕妇危害尤其严重,常导致器官
移植和 A IDS病患者致死性损害,孕妇流产、畸胎、死
胎,新生儿脑炎、智力障碍等 [ 1]。人类普遍易感,据估
计全世界约有 1 / 3的人感染弓形虫 [ 2]。危害人类
健康的同时还给畜牧业生产带来巨大损失, 动物弓
形虫病的传播与流行常给畜牧业生产造成极大损失,
如猪弓形虫病暴发性流行常导致动物大量死亡 [ 3]。
上海的动物弓形虫病研究始于 1977年, 是国内较早
开展此病研究的地区。已报道上海市多种动物弓形虫
抗体的阳性率为家禽家畜 0- 614%, 宠物 295%-
381%,试验动物 0- 224% , 野生动物 0- 871%。
动物弓形虫病的流行和传播导致了人弓形虫病的流
行和高发 [ 4]。弓形虫棒状体蛋白 ( rhoptry pro teins,
ROPs) 是棒状体分泌的对弓形虫侵入宿主细胞起
重要作用的蛋白质, 是重要的入侵和毒力作用因
子 [ 5, 6] , 对于寻找有效的诊断抗原、疫苗候选分子及
药物作用靶位点具有重大意义 [ 6- 8]。
2010年第 1期 蒋蔚等:弓形虫上海株的棒状体蛋白 ROP2的克隆表达及纯化
1 材料和方法
11 虫株、菌株及质粒
刚地弓形虫上海本地株由本实验室保种。Ecoli
TOP10、E coli BL21Codon Plus( DE3) , pET32a( + )
表达载体为本实验室保种。
12 主要试剂
高保真 PrimeSTART HS DNA Po lym erase、限制
性内切酶 E coR I、Sal I、T4 DNA连接酶, DNA M ark
均为大连宝生物工程有限公司 ( TaKaRa)产品; DNA
提取试剂盒为;质粒抽提试剂盒为北京博大泰克公司
产品;琼脂糖凝胶回收 DNA片段试剂盒琼脂糖为美
国 Axygen公司产品、IPTG和蛋白质低相对分子质量
marker为 Promega公司产品; H is B ind K its为 No
vagen公司产品,其它试剂为进口或国产分析纯。
13 弓形虫速殖子收集及 DNA提取
从液氮中取出保种的弓形虫 RH株复苏, 腹腔
接种小鼠, 3 d后无菌操作抽取腹水, 2 500 r /m in离
心 15m in, 弃上清液, 虫体用 PBS洗 3次,按试剂盒
说明书抽提基因组 DNA。
14 引物设计与合成
根据已发表的弓形虫 SH 株 ROP2基因序列
( GenBank登录号 Z36906), 利用软件 primer50设
计一对引物扩增去除信号肽的结构基因, 引物序列
如下: 上游引物 P1为 5 AGCGAATTCGACACGAAC
CCTATGTA 3,下划线处为引入的 E coR I酶切位点,
AGC为保护性碱基;下游引物 P2为 5 ATAGTCGAC
CTTGCAATGGGAGGAG 3下划线处为引入的 Sal I
酶切位点。
为防止目的片段在 pET32a( + )表达载体上移
码,在 Sa l I酶切位点后多加入一个碱基 C, ATA为
保护性碱基,目的片段为 1 063 bp,引物由上海英骏
生物公司合成。
15 目的基因的 PCR扩增
以提取的弓形虫 SH 株的基因组 DNA为模板
进行 PCR扩增。反应体系 ( 50 L ) : 含 Mg2+ 5 !
PrimeSTAR
TM
Buffer( lo:t CN601BA ) 5 L, 10 mmo l /L
dNTPs 2 L,引物 OP1( 10 pmol /L )和 OP2( 10 pmo l/
L )各 2 L, PrimeSTARTM HS DNA Po lym erase025
L, 模板 2 L, 补水至 50 L。循环参数: 94∀ 5
m in; 94∀ 50 s, 56∀ 1 m in , 72∀ 1 m in , 30个循环;
72∀ 延伸 10 m in。 1%琼脂糖上恒压 90 V电泳约
30 m in, 紫外灯下观察结果, 自动凝胶成像扫描仪
拍照及处理。PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒
回收。
16 重组表达质粒的构建和鉴定
PCR产物和空质粒 pET32a( + )分别用 E coR I
和 Sa l I双酶切,酶切后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回
收, 将回收产物用 T4连接酶进行连接, 转化感受态
细胞 E coli TOP10, 挑取单个菌落培养, 提取质粒,
酶切鉴定。将阳性克隆送至上海英骏生物公司
测序。
17 重组蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定
分别将空质粒 pET32a ( + )和重组表达质粒
pET32arop2转化感受态细胞 E coli BL21 ( DE3 ),
将重组子接种于 2 mL含氨苄青霉素 ( Amp)的 LB
液体培养基, 37∀ 培养过夜,次日以 1#100转接入含
100 L /m lAmp的 LB中, 37∀ 振摇至 OD 600为 06-
08时, 加入异丙基硫代D半乳糖苷 ( IPTG)使其
终浓度为 1 mmo l/L,继续培养 34 h后,离心收菌,
加入上样缓冲液,沸水浴 5m in, 离心 1m in, 上清用
于 SDSPAGE检测蛋白表达情况。分离胶浓度为
12%, 浓缩胶为 5% , 120 V电泳约 1 h, 考马斯亮
蓝染色。用 N ovagen公司的 H is B ind Resin纯化
试剂盒亲和凝胶柱纯化融合蛋白,包涵体的收集、
洗涤和溶解参照操作说明书进行。W esternb lo t检
测融合蛋白的免疫原性, 以 1#500稀释的感染弓
形虫 RH株的绵羊阳性血清为一抗, 1#2 000稀释的
标记辣根过氧化物酶的兔抗羊血清为二抗, ECL
显色。
2 结果
21 ROP2基因的 PCR扩增和克隆
弓形虫本地株基因组为模板, 经 PCR扩增得到
与预期大小相符的约 1 063 bp的目的片段 ROP2基
因, PCR反应可见 (图 1)。将 ROP2基因定向克隆至
表达质粒 pET32a( + )。重组质粒经 EcoR I和 Sa l I
双酶切得到约 1 063 bp和 5 900 bp的片段 (图 2),与
预期结果一致。将重组表达质粒命名为 pET32arop2。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
22 测序结果及同源性分析
运用 DNA star和 C lustaWl 进行序列分析表明,
Tgond ii rop2基因序列共 1 044个碱基, 348个氨
基酸, 编码蛋白大小约为 383 kD。与已发表的 RH
株序列 ( GenBank登录号 Z36906)同源性达 100% ,
阅读框正确。与美国株 Tgondi i ME49 rop2基因
(G enBank登录号 XM _002371885)同源性达 96%, 同
时与其 rop8基因 ( GenBank登录号 XM _002370885)
同源性达 87%
23 目的基因在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定
Tgondii ROP2蛋白的分子量约 383 kD, 加上
pET32a( + )质粒上编码的共表达约 226 kD的蛋
白片段, 推测融合蛋白为 609 kD。表达菌经诱导
后, 取样裂解处理, 进行 SDSPAGE, 在 609 kD预期
大小处出现目的融合蛋白条带, 对照菌在相应位置
未出现蛋白条带 (图 3)。表达蛋白主要以包涵体的
形式存在,纯化后的蛋白可通过透析处理进行复性,
100 mL的菌液约能纯化 15 mg的表达蛋白。表达
产物经 SDSPAGE后转移至 NC膜上进行 Western
b lo,t结果显示,表达产物能被抗弓形虫全虫的阳性
血清所识别,在约 609 kD处显示明显的条带 (图
4),证明表达产物具有很强的反应原性。
1.经 IPTG诱导的空载体 pET32a( + ) ; 2. 未经 IPTG诱导
的表达载体 pET32a rop2; 3 - 5.经 IPTG诱导的表达载体
pET32a rop2; M.蛋白质分子量标准
图 3 重组蛋白细菌裂解物的 SDSPAGE
3 讨论
棒状体蛋白 ( ROPs)在弓形虫侵入宿主细胞和
对宿主细胞的毒力方面均起重要作用, 其中 ROP2
为研究较多的一种,是弓形虫病疫苗研制中非常重
要的候选因子,在弓形虫血清学诊断上也有一定价
值, 做好棒状体蛋白的研究将对弓形虫入侵机制、弓
形虫诊断试剂盒的研制和弓形虫病疫苗的研制均具
有重要意义。
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2010年第 1期 蒋蔚等:弓形虫上海株的棒状体蛋白 ROP2的克隆表达及纯化
M蛋白质分子量标准; 1, 2.纯化后的 ROP2蛋白
图 4 融合蛋白的 W estern blot分析
ROP2的成熟蛋白共 562个氨基酸, 含有一个
信号肽序列,抗原表位分析表明位于氨基酸序列的
197- 524位, 含有 3个 T淋巴细胞表位, 能被弓形
虫病人血液中的单核细胞识别,而且都不能与弓形
虫病阴性血清发生反应 [ 9, 10]。考虑到信号肽序列可
能会影响表达菌本身某些蛋白的表达, 从而影响蛋
白表达量, 本试验设计去除信号肽序列的编码第
186- 534位氨基酸序列进行表达, 获得高效表达。
本实验所用引物是根据已有弓形虫 RH株的 ROP2
基因序列 ( GenBank登录号: Z36906)设计, 基因组
模板为提取弓形虫上海本地株的基因组, 为保证序
列的保真性, PCR反应中特意选用了高保真酶, 测
序结果表明与已知序列同源性为 100%。目的蛋白
在大肠杆菌中进行表达, 通过在培养温度 ( 25 -
37∀ )、培养液 pH ( 65- 78)、IPTG浓度 ( 01- 10
mmo l/ l)、诱导时间 ( 3- 10 h)和摇床转数 ( 100- 200
r /m in)等方面进行表达条件的优化 (数据未显
示 ) ,结果发现表达蛋白基本都以包涵体的形式存
在, 最高表达量达 150 mg /L培养液, 纯化后的蛋白
可通过透析处理进行复性。W estern b lo t结果表明,
复性后的蛋白能够被感染弓形虫 RH株的绵羊阳性
血清识别,有明显的反应条带,为今后弓形虫诊断试
剂盒和疫苗的研制打下基础。以表达蛋白为抗原制
备抗弓形虫 ROP2单抗正在研制中, 为进一步研究
ROP2在弓形虫入侵细胞机制做准备。
参 考 文 献
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