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生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
离子环境对 Acinetobacter sp. ADP1的
sa lR基因活性的影响
李超　周琳　张永军　宋福平　张杰
(中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室 ,北京 100193)
　　摘 　要 : 　革兰氏阴性菌 A cinetobacter sp. ADP1可以利用水杨酸作为惟一的碳源和能源生长 ,与这一代谢过程相关的基
因为 sal基因。利用 sal基因启动子与细菌荧光素酶基因 ( lux)编码区融合而构建的工程菌 A cinetobacter ADPWH _ lux,通过定
量测定活细胞发光度可以检测出 salR基因在不同离子环境中的活性。本试验测定了不同浓度梯度的 10种金属离子对处于
指数期和稳定期的细菌的 sa lR基因活性的影响。发光度检测表明重金属离子均会抑制指数期和稳定期的细菌的发光能力。
RT2PCR试验也证明 ,凡能够抑制细菌发光能力的离子 ,均会抑制细菌的 sa lA基因的转录。
关键词 : 　A cinetobacter sp. ADP1　salR基因 　LysR型转录调节子 　离子耐受性 　生物发光
Influence of Ions Conditions on sa lR Gene in Acinetobacter sp. ADP1
L i Chao　Zhou L in　Zhang Yongjun　Song Fup ing　Zhang J ie
( S ta te Key Laboratory for B iology of Plant D iseases and Insect Pests, Institu te of Plant Protection,
Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100193)
　　Abs trac t: 　A cinetobacter sp. ADP1, a gram2negative bacterium, can utilize salicylate as the unique carbon source and energy
source, and sa l operon is required for the metabolism. Genetically engineered A cinetobacter ADPWH _ lux containing fusion gene com2
bined with full salA gene and p romoter less luxCDAB E gene, was used for live2cell based quantitatively biolum inescence assay to deter2
m ine the SalR activities in different ions conditions. The influence of 10 kinds of cations in different concentrations on salR in A cineto2
bacter sp. ADP1 in the exponential and stationary phases was determ ined. The biolum inescence assay illum inated most of heavy metal
ions inhibit the biolum inescence abilities of the bacterium in both exponential and stationary phases. The corresponding RT2PCR exper2
iments also p roved that all the ions which inhibit the biolum inescence abilities, can also inhibit the transcrip tion of salA gene.
Key wo rds: 　A cinetobacter sp. ADP1　sa lR Gene　LysR2type transcrip tional regulator　 Ions tolerance　B iolum inescence
收稿日期 : 2009205220
基金项目 :“973”计划项目 (2007CB109203)
作者简介 :李超 (19842) ,男 ,硕士研究生 ,研究方向 :转基因微生物生物安全 ; E2mail: scoutlc1984@ yahoo. com. cn
通讯作者 :张杰 ,教授 ; Tel: 010262815921, E2mail: jiezhang@ caas. net. cn　　L ysR基因是从大肠杆菌中发现的一种调节基因 ,大肠杆菌可以将二氨基庚二酸盐脱羧以产生赖氨酸 ,催化这一反应的酶 ———二氨基庚二酸脱羧酶是 lysA基因的转录产物 ,而 lysR基因编码的蛋白对lysA基因的转录起正调节作用 [ 1～4 ]。类似于 lysR基因调控机制的转录调节子组成了一个调控范围非常广泛的庞大的调节子家族 ,即 lysR 家族。属于 Lys家族的蛋白被称为 LTTR s (LysR2type transcrip tionalregulators) ,它们都具有一个约 270氨基酸残基的保守区 ,此保守区内存在一个“螺旋 2转角 2螺旋 ”结构 , 可能与 DNA结合相关 [ 5, 6 ]。不动杆菌 (Acinetobacter)是一种在土壤和水体中广泛存在的革兰氏阴性菌 ,属于假单胞菌目 ,莫拉氏菌科 ,在各种特征上与莫拉氏菌属非常相近。不动杆菌的氧化酶反应呈阴性 ,接触酶反应呈阳性 ,是严格好氧的化能异养型细菌 ,它可以利用多种芳香族化合物作为碳源和能源生长。Acinetobacter sp. ADP1的基因组全长约 316 Mbp, G + C含量约为 4014% ,共含有3 400多个基因 ,其中 20%的基因是与分解代谢功能相关的 [ 7, 8 ]。调节苯甲酸类降解的 benM 基因 [ 9 ] ,调
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
节邻苯二酚代谢的 catM 基因 [ 10 ] ,调节水杨酸代谢的
salR基因 [ 11 ] ,与抗过氧化氢应答相关的 oxyR基因 [ 12 ]
等都属于典型的 lysR家族基因。
与水杨酸代谢相关的 sa l基因全长约 30 kb,由
4个 ORF组成 : sa lA、sa lR、sa lD和 sa lE。 sa lA基因编
码水杨酸羟化酶 , sa lR基因编码属于 LysR家族的一
种调节子 , sa lD基因编码一种功能未知但是与大肠
杆菌 FadL基因编码产物同源的蛋白 , sa lE基因编码
水杨酸酯酶 ,其中 sa lR基因可以调控 sa lA基因的表
达 ,但是对 sa lE基因无效。 SalA和 SalR蛋白与来
自假单胞菌的与萘降解相关的 NahG和 NahR蛋白
有着很高的相似度 , SalR蛋白具有 LysR家族标志
性的“螺旋 2转角 2螺旋 ”结构 (17～47氨基酸残基 )。
水杨酸经过 SalA蛋白降解后产生邻苯二酚进入β2
酮戊二酸途径 ,最终产物是琥珀酸酰 CoA 和乙酰
CoA,进入三羧酸循环 [ 11 ]。
A cinetobacter ADPWH _ lux是 W ang等 [ 13, 14 ]构建
的工程菌 ,通过在 A cinetobacter sp1ADP1的 sa lA 基
因和 sa lR基因之间插入无启动子序列的报告基因
luxCDAB E得到。该工程菌生物传感器在有水杨酸
存在的环境下 ,可被特异诱导产生生物发光 ,而且发
光度与水杨酸浓度在很大的范围内是成比例的。
目前对 lysR 家族的研究多集中在基因序列、
LTTR s构型以及 DNA结合机制等方面 ,而对于基因
本身的生理生化特性的研究则相对较少 ,例如 ,不同
生长时期 lysR型基因的转录表达活性的差异 ,离子
浓度、pH值等外界环境对 lysR 型基因转录表达活
性的影响。本试验针对上述问题 ,利用这种 lux生
物传感器研究了不同离子浓度对不同时期 A cineto2
bacter sp. ADP1的 sa lR 基因的活性的影响 ,并通过
RT2PCR进行验证 ,揭示了 sa lR 基因的生理生化特
性。这些研究为 sa lA基因生物传感器在环境监测、
微生物群落结构等方面研究创造了有利条件。
1　材料
111　菌种
A cinetobacter ADPWH _ lux菌株由英国环境和水
文中心的 W ang H博士惠赠。
112　培养基
液体 LB培养基的成分为 110% NaCl, 110%蛋
白胨 , 015%酵母提取物 (Oxiod) , 113%琼脂粉。
113　化学试剂与耗材
测试所用的 NH4 Cl、MgCl2 · 6H2 O、AgNO3、
CdCl2 · 215H2 O、NaCl、KCl、ZnCl2、FeCl3、MnCl2、
FeCl2 及水杨酸等化学试剂均购自 Sigma公司 ; Tr2
izol 购 自 Invitrogen 公 司 , MMLV Reverse Tran2
scrip tase、RNase inhibitor、DNase I( RNase2free)等酶
类和 100 bp DNA ladder 均购自 TaKaRa 公司 ;
RNase2free的 Tip和离心管等耗材均购自 Axygen公
司 , Taq M ix购自北京博迈德科技发展有限公司。
114　仪器
多功能酶标仪 : B io2Tek, Synergy HT Multi2De2
tection M icrop late Reader; pH计 : Thermo O rion 3 star
pH benchtop; PCR仪 : B iometra T1 thermocycler。
2　方法
211　细菌培养
离子实验对象包括处于指数生长期和稳定生长
期的不动杆菌。
21111　指数生长期细菌的培养 　挑 A cinetobacter
ADPWH_ lux单菌落接种于 5 m l的 LB 试管中 ,以
30℃, 220 r/m in振荡培养 12 h。按照 1∶100比例转
接于 100 m l的 LB中 ,三角瓶总容量 250 m l。30℃,
220 r/m in振荡培养 2 h后 ,加入水杨酸 ,以终浓度
为 1 mM的菌液作为诱导组 (CK+ ) ,加入等体积灭
菌水的菌液作为空白组 (CK- )。
21112　稳定生长期细菌的培养 　挑 A cinetobacter
ADPWH_ lux单菌落直接接种于 100 m l的 LB中 ,三
角瓶总容量 250 m l。以 30℃, 220 r/m in培养 48 h
后 ,加入水杨酸 ,以终浓度为 1 mM的菌液作为诱导
组 (CK+ ) ,加入等体积灭菌水的菌液作为空白组
(CK- )。
212　发光度试验
将各类无机盐试剂溶于灭菌水中 ,并用 0122
μm滤膜过滤除菌 ,密封于 4℃冰箱保存。使用时 ,
以梯度稀释 10 - 1 ～10 - 6 M的浓度。
分别吸取 20μl各浓度梯度的无机盐溶液与
180μl诱导组菌液加入 96孔板 ,以构成 10 - 2 M ～
10 - 7 M浓度梯度的混合液 ;另外 ,分别吸取 180μl
的诱导组和空白组菌液与 20μl灭菌水加入 96孔
板作为对照 ,立即放入酶标仪中 ,测定发光度的动力
学曲线 ,并测定试验开始及结束时的 OD值。吸光
85
2009年第 9期 李超等 :离子环境对 Acinetobacter sp. ADP1的 sa lR基因活性的影响
度的波长设为 600 nm;发光度的 Em ission filter设定
为 460 /40;温度设定为 30℃;动力学曲线测定设总
时间为 2 h,间隔 215 m in测定一次发光度 ,共 49
次。每次试验中每个样品要重复 6次 ,每个试验都
重复 3次。
分别以 OD600 和相对发光度 ( Lum inescence /
OD600 )为纵坐标 ,时间为横坐标 ,取每个样品各重复
数据的平均值作为试验结果 ,以标准差 ( standard
deviation)作为误差棒 ( error bar) ,作图。
213　RT2PCR
取发光度试验完毕后的菌液提取 RNA。以下
步骤均需在冰上操作 ,试剂与耗材均需去除 RNase。
21311　cDNA的制备 　采用 TaKaRa说明书的方法
提取并纯化 RNA,然后检测 RNA 含量。取 2 μl
RNA作为模板 ,加入下游引物各 1μl,然后 70℃保
温 10 m in,冰上 2 m in。向上述变性液中加入 dNTPs
(018 mM ) 015μl, MMLV ( 200 U /μl) 0125 μl, 5 ×
MMLV buffer 2μl, RNase inhibitor 0125 μl, 补充
DEPC水至总体积 10μl。将反应液 42℃保温 1 h进
行反转 , 70℃保温 10 m in,冰上 2 m in。
21312　细菌 DNA的制备 　取 1 m l菌液离心 ,弃上
清后加入无菌水重悬并洗涤一次 ,离心后弃上清 ,加
入 1 m l无菌水重悬并煮沸 5 m in,离心取上清作为
细菌 DNA模板。
21313　引物的合成 　取 sa lA 基因的一段作为 PCR
扩增区域 ,约 112 kb,引物为 SALf2(5′2AAATTAGTAT2
AGCCATTATTGGTGGTGGTATT23′) , SAL r2( 5′2TTA2
AATCGTTGCAACAGGTTGTATTG23′) , 取 16S rDNA
基因 V2～V4区的一段作为内参 ,约 0165 kb,引物
16Sf2( 5′2AGCGGCGGACGGGTGAGTA23′) , 16Sr2( 5′2
CCTCAGCGTCAGTGTTAG23′) ,引物合成公司为上海
生工生物工程技术服务有限公司。
21314　PCR反应 　PCR溶液体系为 20μl,其中含
模板 2μl,引物各 015μl, 2 ×Taq PCR M ix 10μl:
MgCl2 4 mM , dNTPs 014 mM; Taq polymerase 0105 U /
μl。PCR程序设定 : ①94℃ 4 m in, ②94℃ 1 m in, ③
53℃ 1 m in, ④72℃ 1 m in 30 s(②～④步骤重复 30
个循环 ) , ⑤72℃ 10 m in。
3　结果
311　指数生长期的 OD600和发光度
在 Ag+ , Cd2 + , Zn2 + , Mn2 + , NH4 + , Mg2 + , Na+ ,
K+ , Fe2 +和 Fe3 + 10种金属离子中 ,对指数期细菌生
长有抑制作用的离子共有 4种 ,其浓度和种类分别
是 10 - 2 ～10 - 7 M浓度的 Ag+ , 10 - 2 ～10 - 4 M浓度的
Cd2 + , 10 - 2 M和 10 - 3 M浓度的 Zn2 + , 10 - 2 M浓度的
Mn2 + ;对指数期细菌生长无影响的离子共有 6种 ,
分别是 NH4 + ,Mg2 + , Na+ , K+ , Fe2 + , Fe3 + ;未发现对
指数期细菌生长有促进作用的离子 (表 1)。
表 1　10种不同浓度离子环境对指数期 A cinetobacter
AD PW H_ lux的生长能力的影响
离子 \浓度 (M) 10 - 2 10 - 3 10 - 4 10 - 5 10 - 6 10 - 7
Ag + - - - - - -
Cd2 + - - - / / /
Zn2 + - - / / / /
Mn2 + - / / / / /
NH4 + / / / / / /
Mg2 + / / / / / /
Na + / / / / / /
K + / / / / / /
Fe2 + / / / / / /
Fe3 + / / / / / /
“ - ”代表抑制作用 ,“/”代表无影响
在 10种离子中 ,对指数期细菌发光能力有抑制
作用的离子共有 6种 ,其种类和浓度分别是 10 - 2 ～
10 - 5 M 浓度的 Ag+ , 10 - 2 ～10 - 4 M 浓度的 Cd2 + ,
10 - 2 M 和 10 - 3 M 浓度的 Zn2 + , 10 - 2 M 浓度的
Fe2 + , 10 - 2 M浓度的 Fe3 + , 10 - 2 M浓度的 Mn2 + ;对
指数期细菌发光能力无影响的离子共有 4种 ,分别
是 NH4 + 、Mg2 + 、Na+ 、K+ ;没有发现对指数期细菌发
光能力有促进作用的离子 (表 2)。
表 2　10种不同浓度离子环境对指数期 A cinetobacter
AD PW H_ lux的发光能力的影响
离子 \浓度 (M) 10 - 2 10 - 3 10 - 4 10 - 5 10 - 6 10 - 7
Ag + - - - - / /
Cd2 + - - - / / /
Zn2 + - - / / / /
Mn2 + - / / / / /
NH4 + / / / / / /
Mg2 + / / / / / /
Na + / / / / / /
K + / / / / / /
Fe2 + - / / / / /
Fe3 + - / / / / /
“ - ”代表抑制作用 ,“/”代表无影响
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
31111　以 Cd2 +作为对指数期细菌生长和发光能力
抑制和无影响的代表 　在不同 Cd2 +浓度环境下 ,各
组菌液的初始 OD600值均在 01055附近 , 2 h之后 ,
CK+菌液的最终 OD600值约为 0108。2 h之后 , 10 - 2
M浓度 Cd2 +环境下菌液的 OD600与初始 OD600相近 ,
仅有约 01055, 10 - 3M和 10 - 4M浓度 Cd2 +环境下菌
液的 OD600与初始 OD600相比有略微的升高 ,分别达
到 01057和 01062附近 ,远远小于 CK+的 0108。在
较低浓度的 Cd2 +环境下 ,菌液 2 h之后的 OD600值与
CK+相近 , 10 - 5 ～10 - 7 M 浓度 Cd2 + 环境下菌液的
OD600均达到了 0108附近 (图 1)。
图 1　在不同 Cd2 +浓度环境下 ,指数期 A cinetobac te r
AD PW H_ lux的 OD600和相对发光度
在 Cd2 + 浓度低于 10 - 5 M 的环境下 ,微量的
Cd2 +对 A cinetobacterADPWH_ lux的细菌生长的影响
程度较小 ,基本都可以达到 CK+ 条件下的生长水
平 ,但是高于 10 - 4 M浓度的 Cd2 +会强烈抑制细菌
的生长。各组菌液的初始相对发光度均比较低 ,分
别处在 1 000～1 700之间 , 2 h之后 , CK- 菌液的最
终相对发光度约为 2 733,而 CK+的最终相对发光
度约为 19 203。2 h之后 , 10 - 2M浓度 Cd2 +环境下
菌液的相对发光度仅有约 575,与其初始相对发光
度相当 , 10 - 3M和 10 - 4M浓度 Cd2 +环境下菌液的相
对发光度与 10 - 2M组菌液相比有略微的升高 ,分别
达到 1 073 和 1 495 附近 ,但是仍然处于同期的
CK- 水平上。在较低浓度的 Cd2 +环境下 ,菌液 2 h
后的相对发光度与 CK+相近 , 10 - 5 ～10 - 7 M 浓度
Cd2 +环境下菌液的相对发光度均达到了 16 000以
上 ,而 10 - 7 M组菌液非常接近 19 000 (图 1)。
使用 SPSS软件进行 t检验。CK+ 组菌液与
10 - 2 ～10 - 7 M组菌液 t检验的 P值分别为 01000,
01000, 01000, 01165, 01173, 01832; CK- 组菌液与
10 - 2 ～10 - 7M 组菌液 t检验的 P值分别为 01429,
01583, 01604, 01004, 01008, 01007; CK+ 组菌液与
CK- 组菌液 t检验的 P值也是 01000。所以在 10 - 5
～10 - 7 M浓度的环境下 , Cd2 +对细菌的发光能力的
影响基本是没有影响的 ,而 10 - 2 ～10 - 4 M 浓度的
Cd2 +对细菌的发光能力抑制作用非常显著 ( P <
01005)。
31112　以 K+作为对指数期细菌生长和发光能力抑
制和无影响的代表 　在不同 K+浓度环境下 ,各组
菌液的初始 OD600值均在 0106附近 , 2 h之后 ,各组
菌液的最终 OD600值均在 0112附近 ,各组菌液的初
始 OD600和最终 OD600差值都不大 (图 2)。在 10 - 2 ～
10 - 7M浓度 K+环境下 ,细菌的生长基本不受影响。
各组菌液的初始相对发光度均比较低 ,均处于 1 000
～1 700之间 , 2 h之后 , CK- 菌液的最终相对发光度
约为 406,而 CK+的最终相对发光度约为 18 965。
各组菌液的初始相对发光度之间和除 CK- 外各组
菌液的最终相对发光度之间差值也不大 (图 2)。
图 2　在不同 K +浓度环境下 ,指数期 A cine tobac te r
AD PW H_ lux的 OD600和相对发光度
使用 SPSS进行计算 t检验 , CK+组菌液与 10 - 2
～10 - 7M组菌液 t检验的 P值分别为 01974, 01633,
06
2009年第 9期 李超等 :离子环境对 Acinetobacter sp. ADP1的 sa lR基因活性的影响
01425, 01244, 01276, 01005; CK- 组菌液与 10 - 2 ～
10 - 7M组菌液 t检验的 P值分别为 01000, 01001,
01000, 01000, 01000, 01000; CK+组菌液与 CK- 组菌
液 t检验的 P值也是 01000。所以在 10 - 2 ～10 - 7M
浓度的环境下 , K+对细菌的发光能力的影响基本是
没有影响的 ,而是否添加水杨酸对细菌的发光能力
影响非常显著 ( P < 01005)。
312　稳定生长期的发光度
由于细菌在稳定期 2 h内的 OD600保持基本恒
定 ,所以在此不作离子对细菌生长情况影响的讨论。
在 10种离子中 ,对稳定期细菌发光能力有抑制
作用的离子共有 6种 ,其种类和浓度分别是 10 - 2 ～
10 - 4 M 浓度的 Ag+ , 10 - 2 ～10 - 4 M 浓度的 Cd2 + ,
10 - 2 M浓度的 Zn2 + , 10 - 2M浓度的 Mn2 + , 10 - 2M浓
度的 Fe2 + , 10 - 2M浓度的 Fe3 + ;对稳定期细菌发光
能力无影响的离子共有 4种 ,分别是 NH4 + , Mg2 + ,
Na+ , K+ ;未发现对指数期细菌发光能力有促进作
用的离子 (表 3)。
表 3　10种离子的不同浓度环境对稳定期 Ac inetobacter
AD PW H_lux的发光能力的影响
离子 \浓度 (M) 10 - 2 10 - 3 10 - 4 10 - 5 10 - 6 10 - 7
Ag + - - - / / /
Cd2 + - - - / / /
Zn2 + - / / / / /
Mn2 + - / / / / /
NH4 + / / / / / /
Mg2 + / / / / / /
Na + / / / / / /
K + / / / / / /
Fe2 + - / / / / /
Fe3 + - / / / / /
“ - ”代表抑制作用 ,“/”代表无影响
31211　以 Mn2 +作为对稳定期细菌发光能力抑制和
无影响的代表 　在不同 Mn2 +浓度环境下 ,各组菌液
的初始相对发光度均比较低 ,分别处在 350～750之
间 , 2 h之后 , CK- 菌液的最终相对发光度约为 428,
而 CK+的最终相对发光度约为 9 569。2 h之后 ,
10 - 2 M浓度 Mn2 +环境下菌液的相对发光度仅有 2
386,远远小于同期 CK+ , 10 - 3 ～10 - 7 M浓度 Cd2 +环
境下菌液的相对发光度均在 9 000～10 000范围内
(图 3)。
图 3　在 M n2 +不同浓度环境下 ,稳定期 A cinetobacter
AD PW H_ lux的 OD600和相对发光度
使用 SPSS软件进行 t检验 , CK+组菌液与 10 - 2
～10 - 7M组菌液 t检验的 P值分别为 01000, 01095,
01038, 01009, 01233, 01195; CK- 组菌液与 10 - 2 ～
10 - 7M组菌液 t检验的 P值分别为 01001, 01000,
01000, 01000, 01000, 01000; CK+组菌液与 CK- 组菌
液 t检验的 P值也是 01000。所以在 10 - 3 ～10 - 7M
浓度的环境下 ,Mn2 +对细菌的发光能力基本没有影
响的 ,但是 10 - 2M浓度的 Mn2 +对细菌的发光能力
抑制作用非常显著 ( P < 01005)。
图 4　在 Na +不同浓度环境下 ,稳定期 A cine tobacter
AD PW H_ lux的 OD600和相对发光度
31212　以 Na+作为对稳定期细菌发光能力抑制和
无影响的代表 　在不同 Na+浓度环境下 ,各组菌液
的初始相对发光度均比较低 ,均处于 350～650之
16
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间 , 2 h之后 , CK- 菌液的最终相对发光度约为 349,
而 CK+的最终相对发光度约为 7 139。各组菌液的
初始相对发光度之间和除 CK- 外各组菌液的最终
相对发光度之间差值都不大 (图 4)。
使用 SPSS软件进行 t检验 , CK+组菌液与 10 - 2
～10 - 7M组菌液 t检验的 P值分别为 01138, 01425,
01072, 01821, 01728, 01069; CK- 组菌液与 10 - 2 ～
10 - 7M组菌液 t检验的 P值分别为 01000, 01000,
01000, 01000, 01000, 01000; CK+组菌液与 CK- 组菌
液 t检验的 P值也是 01000。所以在 10 - 2 ～10 - 7M
浓度的环境下 , Na+对细菌的发光能力基本是没有
影响的 ,而是否添加水杨酸对细菌的发光能力影响
非常显著 ( P < 01005)。
313　RT2PCR结果
对指数生长期的 CK+ 、CK- 和加入 K+ 、Cd2 +离
子的诱导组菌液 ,以及对稳定生长期的 CK+ , CK-
和加入 Na+ 、Mn2 +离子的诱导组菌液的 RT2PCR结
果如下 ,电泳图片左侧条带均为 RT2PCR产物 ,而右
侧条带均为 DNA2PCR产物 ,各条带对应分子量如
左侧所示。
11CK + ; 21CK - ; 31CK + /10 - 2M K + ; 41CK + /10 - 2M Cd2 +
图 5　指数期 A cinetobac te r AD PW H_ lux的
RT2PCR产物电泳分析
11CK + ; 21CK - ; 31CK + /10 - 2M Na + ; 41CK + /10 - 2M Mn2 +
图 6　稳定期 A cinetobac te r AD PW H_ lux的
RT2PCR产物电泳分析
在 CK+ 、CK+ /10 - 2M K+环境下 ,指数期 Acineto2
bacter ADPWH_ lux的 RT2PCR产物电泳图谱有 salA
的 112 kb和 16S rDNA的 0165 kb的条带 ,而同样条
件的 CK- 、CK+ /10 - 2M Cd2 +环境下 ,指数期 Acineto2
bacter ADPWH_ lux的 RT2PCR产物电泳图谱中只有
16S rDNA的 0165 kb的条带 ,提取菌液 DNA 进行
PCR后的产物均有 112 kb和 16S rDNA两条带 (图
5)。未加反转录酶的 RT2PCR产物和未加模版的
RT2PCR产物电泳中均未发现任何条带 (图略 )。
这表明 10 - 2 M浓度的 K+环境的确不影响指数
期细菌的 sa lA基因的转录 ,而 10 - 2 M浓度的 Cd2 +
环境完全抑制了指数期细菌的 sa lA基因的转录。
在 CK+ 、CK+ /10 - 2M Na+环境下 ,稳定期 A cine2
tobacter ADPWH_ lux的 RT2PCR产物电泳图谱有 sa2
lA的 112 kb和 16S rDNA的 0165 kb的条带 ,而同样
条件的 CK- 、CK+ /10 - 2 M Mn2 + 环境下 , 稳定期
Acinetobacter ADPWH_ lux的 RT2PCR产物电泳图谱
中只有 16S rDNA的 0165 kb的条带 ,提取菌液 DNA
进行 PCR后的产物均有 112 kb和 16S rDNA两条带
(图 6)。未加反转录酶的 RT2PCR产物和未加模版
的 RT2PCR产物电泳中均未发现任何条带 (图略 )。
这表明 10 - 2 M浓度的 Na+环境的确不影响稳
定期细菌的 sa lA 基因的转录 ,而 10 - 2 M 浓度的
Mn2 +环境完全抑制了稳定期细菌的 sa lA 基因的
转录。
4　讨论
411　菌液 OD600值的变化
加入 10 - 2M浓度的 Ag+ , Fe2 + , Fe3 + 3种离子之
后菌液的 OD600立即升高 ,经过观察可知是由于产生
了沉淀。加入 Ag+ 后产生的沉淀为白色 ,推测为
AgCl;加入 Fe2 +后产生红褐色 ,推测为 Fe2 +被氧化
而产生的 Fe (OH) 3 ;加入 Fe3 +后产生的沉淀也是红
褐色沉淀 ,推测为 Fe (OH ) 3。需要注意的是 ,加入
10 - 3 ～10 - 6 M 浓度的 Ag+离子后 ,菌液的 OD600值
明显低于阳性对照 ,所以推测 10 - 2 M浓度的 Ag+离
子会抑制细菌生长。而加入 10 - 3 ～10 - 7 M的 Fe2 +
和 Fe3 +离子后 ,菌液 OD600值与 CK+组相当 ,所以
10 - 2 M浓度的 Fe2 +和 Fe3 +离子对细菌生长有无影
响需要进一步证实。
412　相对发光度的意义
虽然已采用相对发光度而不仅仅是发光度作为
反映离子环境对 sa lR基因活性的影响程度 ,但是确
切的来说 ,指数生长期的相对发光度并不真正代表
单个细菌的 sa lR基因的活性 ,因为在细菌的指数生
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2009年第 9期 李超等 :离子环境对 Acinetobacter sp. ADP1的 sa lR基因活性的影响
长期 ,刚加入水杨酸时存在的细菌和在此之后由前
者分裂产生的细菌产生的 Lux蛋白的量并不相同。
另外 ,将加入水杨酸诱导后的菌液离心 ,上清基
本没有发光度 ,这表明 Lux蛋白表达之后 ,绝大部分
是处于细胞内部。虽然理论上重金属离子对 Lux蛋
白有着很强烈的毒害作用 ,但是考虑到试验中的各
种条件下 ,能够进入细胞内部的离子浓度难于确定
并且不会很高 ,所以试验中忽略了离子对 Lux蛋白
的影响。如果考虑理想状态 ,应该确定细胞内部的
离子浓度 ,然后总发光度去除这部分离子因素对
Lux蛋白的影响才是真正的 sa lR 基因的活性的
反映。
413　全局调控 ( Global control)
随着大量降解途径的发现 ,代谢抑制使生物传
感器的设计和使用复杂化 ,细菌需要及时有效地调
节某些基因的表达和蛋白的活性来适应新的环境 ,
因此必须结合全局调控来综合考虑生物传感器。而
转录水平上的表达调控 ,即利用不同的σ因子特异
性识别并引导 RNA聚合酶和调控蛋白结合到目的
基因启动子区域上 ,诱导或抑制目的基因的表达 ,无
疑是细菌对其生命活动进行精细调控的最基本、也
是最主要的一种方式。
在土壤微生物中 , 环磷酸腺苷受体蛋白
( cAM P recep tor p rotein, CRP)在代谢抑制体系中似
乎不起作用 ,而许多其他的调节系统在芳香族化
合物降解途径中占主要调控地位 :依赖于 Sigma54
的调控系统 , C rc和 CyoB介导的调控系统 ,二元调
节子系统以及某些特殊的调控系统 ,例如 ,不动杆
菌的与奈降解相关的调控系统就对低氧环境非常
敏感 [ 15, 16 ] 。
本试验中 ,在相同离子环境下由相同浓度的水
杨酸诱导时 ,处于不同生长时期的 Acinetobacter AD2
PWH_ lux的相对发光度差距非常明显 ,稳定期的最
高相对发光度只有指数期的约 30%。处于相同生
长时期由相同浓度的水杨酸诱导时 ,不同离子环境
下的 A cinetobacter ADPWH_ lux的相对发光度差距也
非常明显 ,部分高浓度的重金属离子环境下的相对
发光度基本等同于阴性对照。很明显 ,处于不同生
长时期及不同离子环境下的不动杆菌的 SalA操纵
子活性受到了全局调控系统的调节。虽然没有确切
的证据证明这一全局调控系统的详情 ,但是很多证据
表明某些 lysR型基因的表达依赖于 ppGpp[ 17, 18 ]。
在自然条件下 ,离子环境对于土壤细菌群落是
一个重要影响因子 ,在细菌的各个生长时期遇到的
离子环境会对细菌的生理生化状态产生各种不同影
响。本试验模拟试细菌在自然条件下会遇到的某些
环境压力 ,首次利用生物传感器这一新式工具研究
了离子环境对不同时期 Acinetobacter sp. ADP1 的
sa lR基因的影响 ,为今后类似工作的开展提供了一
种新的思路 ,奠定了部分实验基础。但是环境中各
种离子对 sa lR基因产生影响的机制 ,比如 sa lR基因
中是否存在一些特殊的离子结合位点导致基因失
活 ,或者某些调控蛋白是否因为被离子抑制活性导
致转录活性降低 ,这些可能的原因还有待于研究。
此外 ,其他的 lysR家族的成员是否也会在这些环境
条件下产生与 sa lR基因相同的应答反应 ,以及环境
中其他因子 ,如 pH值 ,对 sa lR基因的影响也是下一
步实验的研究方向之一。
参 考 文 献
1　 Stragier P, et al. J Bacteriol, 1983, 156 (3) : 1198～1203.
2　 Stragier P, et al. J Mol B iol, 1983, 168 (2) : 321～331.
3　 Stragier P, Patte JC. J Mol B iol, 1983, 168 (2) : 333～350.
4　 Stragier P, et al. J Mol B iol, 1983, 168 (2) : 307～320.
5　 Henikoff S, Haughn GW , Calvo JM, et al. Proc Natl Acad Sci
USA, 1988, 85 (18) : 6602～6606.
6　 SchellMA. Annu RevM icrobiol, 1993, 47: 597～626.
7　 Metzgar D, et al. Nucleic Acids Res, 2004, 32 ( 19 ) : 5780
～5790.
8　 Barbe V, et al. Nucleic Acids Res, 2004, 32 (19) : 5766～5779.
9　 Craven SH, et al. MolM icrobiol, 2009, 72 (4) : 881～894
10　Romero2A rroyo CE, et al. J Bacteriol, 1995, 177 ( 20 ) : 5891
～5898.
11　Jones RM, et al. J Bacteriol, 2000, 182 (7) : 2018～2025.
12　GeissdorferW , et al. J Bacteriol, 1999, 181 (14) : 4292～4298.
13　Huang W E, et al. Plant J, 2006, 46 (6) : 1073～1083.
14　Huang W E, et al. Environ M icrobiol, 2005, 7 (9) : 1339～1348.
15　Marques S, et al. Curr Op in B iotechnol, 2006, 17: 50～56.
16　Zimmermann T, et al. J Bacteriol, 2009, 191: 2834～2842.
17　Gerischer U. J MolM icrobiol B iotechnol, 2002, 4 (2) : 111～121.
18　Fang M, Majumder A, Tsai KJ, W u HY. B iochem B iophys Res
Commun, 2000, 276 (1) : 64～70.
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