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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
非洲马瘟病毒群特异性 RT-PCR检测方法的研究
赵文华 杨仕标 王金萍 李富祥
(云南省畜牧兽医科学院 农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室
国家外来动物疫病诊断实验室，昆明 650224)
摘 要: 非洲马瘟病毒(African horse sickness virus，AHSV)为双股 RNA病毒，感染所有马科动物。设计 2 对位于 AHSV
基因组 S7 片段的引物，经 RT-PCR扩增，证实 2 对引物对 6 种血清型的 AHSV RNA均有特异性扩增，且能对同属的蓝舌病病
毒(BTV)、鹿出血热病毒(EHDV)进行区别诊断。经序列测定及 Blast，证实所扩增的条带确为 AHSV S7 相应位置核苷酸序
列，表明已初步建立 AHSV群特异性 RT-PCR检测方法。
关键词: 非洲马瘟病毒 S7 基因片段 RT-PCR 序列测定
Development of RT-PCR Method for Detection of AHSV
Zhao Wenhua Yang Shibiao Wang Jinping Li Fuxiang
(Laboratory of Tropical and Subtropical Animal Virology of MOA，National Exotic Animal Disease
Diagnostic Laboratory，Yunnan Academy of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Kunming 650224)
Abstract: African horse sickness(AHS)is an infectious，noncontagious arthropod-borne disease of equidae，caused by a double-
stranded RNA orbivirus，Reoviridae． The genome of AHSV is composed of 10 double-stranded RNA segments． In this study，two sets of
primers were designed based on the S7 segment according to the reported references and sequences downloaded from GenBank． The
RNA samples extracted from inactivated vaccine virus of 6 serotypes(serotype 2，3，4，7，8 and 9，respectively)all produced specific
products amplified with the two sets primers through RT-PCR method，while the Blue tongue virus(BTV)and Epizootic hemorrhagic dis-
ease virus(EHDV)belonging to the same species showed negative without specific segment amplified with the same primer sets． The
products amplified from AHSV RNA was sequenced and blasted on-line． The result showed that the amplified products contain the nu-
cleotide sequence of S7 segment． Conclusively，the developed RT-PCR method for detection of AHSV in this study is able to be em-
ployed as a technique for AHSV detection．
Key words: African horse sickness virus(AHSV) S7 segment RT-PCR Sequence
收稿日期:2010-10-18
基金项目:公益性行业(农业)科研专项(200903037)
作者简介:赵文华，女，副研究员，研究方向:动物分子病毒学;E-mail:tigerhua74@ yahoo． com． cn
通讯作者:杨仕标，E-mail:yangsb3799@ sina． com
非洲马瘟(African horse sickness，AHS)是由呼
肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus ge-
nus)的非洲马瘟病毒(AHSV)引起的，感染所有马
科动物的一种非接触性传染的病毒性传染病。本病
以呼吸系统和循环系统的病理变化为特征，目前发
现至少有两种库蠓属昆虫可传播该病，9 个血清型。
AHS在非洲的撒哈拉地区呈地方性流行，也曾在非
洲北部、中东欧洲发生，该病呈季节性发生。易感动
物感染后的死亡率最高可达 95%，会给养马业造成
巨大的经济损失，因此国际动物组织(OIE)将其列
为 A类动物疫病［1，2］。
AHSV基因组由 10 个双股 RNA 片段组成，编
码 7 种结构蛋白(VP1 － 7)和 4 种非结构蛋白
(NS1 － 3、NS3A)。其中 VP7 为主要的内衣壳蛋白，
在 9 个血清型的病毒中最为保守，为群特异性抗原
蛋白。编码 VP7 蛋白的 S7 基因片段是进行该病
RT-PCR快速检测时常用的区域［3］。
中国目前没有该病的发生，但随着国际赛马活
动的普及，有必要对该类外来动物疫病进行相应检
测、监测技术的贮备。本试验选择保守的 VP7 蛋白
2011 年第 4 期 赵文华等:非洲马瘟病毒群特异性 RT-PCR检测方法的研究
基因区段设计两对引物，对 AHSV 的 RT-PCR 快速
检测方法进行初步研究。
1 材料与方法
1. 1 材料
AHSV血清型 2、3、4、7、8 和 9 灭活冻干疫苗毒
由国外进口，BTV 病毒株为本实验室所有，鹿出血
热病毒 RNA(美国 NADL1、2 血清型)为美国动物疫
病实验室友情馈赠。所用的菌种为本实验室保存的
DH5α菌;测序载体为 pMD18-T Vector，购自宝生物
工程(大连)有限公司。
1. 2 试剂及耗材
Liquid sample Total NA kit(w7291)、胶回收试
剂盒及小量柱式质粒纯化试剂盒，均购自上海华舜
公司;One-step RNA PCR Kit、Premix Taq 酶及
DL2000 Marker 均购自宝生物工程(大连)有限公
司;氯仿、异丙醇和无水乙醇等其他试剂均为分析纯
试剂。
PCR反应管，AxyGen 公司制品;Blowest Agar-
ose，购自上海生工公司;PCR反应仪器型号为 Gene-
Amp PCR System 9700。
1. 3 引物
根据参考文献［1］和 GenBank 下载的序列，用
DNAstar软件设计 2 对扩增 VP7 基因的引物，引物
情况如下表 1 所示。
表 1 非洲马瘟病毒所用扩增引物情况
引物 位置(X56676) 序列(5→3) 扩增片段(bp)
I-VP7-1 649 － 669 CTTTTGTCACCGTTGATGGAG
415
I-VP7-2 1044 － 1063 AGCACAAGAGCTCTGTTGAT
Fs7 815 － 836 GGCTCCAACACTCACAAGATGT
102
Rs7 896 － 916 GGCGGATTAATAGGCTGCATA
1. 4 病毒基因组 RNA 的提取
先用灭菌水按要求溶解非洲马瘟灭活疫苗冻干
粉，然后取 200 μL待用。在 1. 5 mL 离心管中预先
加入 5 μL poly(A)至管底，再加入 170 μL RLS裂解
液，再加入 200 μL 上述 AHSV 液体，最后加入 25
μL Proteinase K。盖上盖子彻底混匀，55℃消化 20
min。消化完毕加入 200 μL 无水乙醇，颠倒离心管
以混匀。静置 10 min 后将全部液体移入试剂盒吸
附柱中，10 000 r /min离心 30 s。倒掉收集管中的液
体，将吸附柱放回到收集管中。在吸附柱中加入
500 μL W3 液，离心 30 s。倒掉收集管中的液体，将
吸附柱放回到收集管中。用 W3 液共洗涤 2 次。洗
涤完，再离心 1 min。然后将吸附柱取出放入干净的
1. 5 mL 离心管中，在吸附膜的中央加入 35 μL 纯
水，37℃温箱静置洗脱 5 min，然后再 10 000 r /min
离心 2 min。弃掉吸附柱，将收集有 RNA 液体的离
心管，贮存于 － 70℃备用。
1. 5 RT-PCR扩增条件的优化
经条件摸索发现对两对引物均适合的扩增条件
为:55℃，30 min，95℃，3 min，然后进行 35 个循环的
如下 3 步骤，94℃变性 45 s，58℃ 退火 45 s，72℃ 延
伸 1 min，最后再 72℃延伸 7 min。RT-PCR 反应各
成分试剂的配制参见 One-step RT-PCR kit说明书。
1. 6 序列测定与分析
对所扩增的非洲马瘟病毒相关序列进行胶回收
纯化、克隆和测序［4，5］，所测得的序列进行 Blast，比
对是否为非洲马瘟 VP7 蛋白相应位置基因序列。
2 结果与分析
2. 1 两对引物对非洲马瘟病毒的扩增
经一步法 RT-PCR，两对引物对非洲马瘟 6 个血
清型的病毒 RNA 均有特异性扩增条带出现，引物 I-
VP7-1＆I-VP7-2对非洲马瘟血清型 2、3、4、7、8 和 9
RNA的扩增结果(图 1)显示，除血清型 7扩增条带较
弱外，其余血清型均有强阳性扩增，而阴性对照亦成
立。引物 Fs1＆Rs1对非洲马瘟血清型2、3、4、7、8和 9
RNA的扩增结果(图 2)显示，6 个血清型的 RNA 亦
均有特异阳性扩增条带出现，阴性对照成立。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
2. 2 两对引物对非洲马瘟病毒、同属蓝舌病病毒及
鹿出血热病毒的鉴别诊断
应用 2. 1 所述两对引物对与非洲马瘟病毒同属
的蓝舌病病毒(BTV)及鹿出血热病毒(EHDV)进行
RT － PCR扩增，确定是否能对它们进行鉴别。其中
用于扩增的 AHSV RNA 为 6 个血清型的混合 RNA，
BTV RNA为其 8 /14血清型的混合 RNA，EHDV为其
1、2血清型的混合 RNA。扩增结果(图 3)显示，只有
AHSV RNA有特异性扩增，而 BTV 及 EHDV 和阴性
对照均无扩增，证明所设计的两对引物对 AHSV RNA
可特异性扩增，且能与同属相关病毒区分开来。
2. 3 非洲马瘟病毒扩增片段的序列测定和分析
确定
将用两对引物所扩增的 AHSV 基因片段，胶回
收纯化、克隆至 pMD18-T Vector，挑取阳性菌抽提质
粒，送测序公司进行测序确定。然后将所获得序列
用 Blast软件进行比对，确定其是否为非洲马瘟病
毒相应基因序列。结果显示所测得的序列经比
对确定为 AHSV VP7 基因片段，与已发表的参考
序列同源性大于 90%。引物 Fs1＆Rs1 扩增序列
长度为 102 bp(图 4) ，引物 I-VP7-1＆I-VP7-2 扩
增序列长度为 415 bp(图 5) ，与设计预期扩增片
段长度一致。
3 讨论
AHS是马类疾病中致死率最高的一种疾病，库
蠓属的某些叮咬昆虫是该病传播的主要媒介。目前
我国还没有该病的发生，对我国来说是属于“外来
病”的范畴。但随着国际贸易的日益频繁及赛马活
动的普及，对于该病必须要进行严格的防范，以便防
患于未然。因此有必要进行相关的技术储备，这也
是进行此项研究的最终目的。通过本研究已初步建
立了用于检测 AHSV群特异性 RT-PCR的方法。
AHSV基因组为 10 个大小不等的双链 RNA 片
段，3 个较大片段(名为 L1 － L3) ，3 个中等片段(M4
－ M6) ，以及 4 个较小片段(S7 － S10) ，每个片段至
少编码 1 个多肽［6］。外衣壳由两个蛋白 VP2 和
VP5 构成;VP2 是抗原性变异最大的蛋白［7］。内衣
壳由 2个主要蛋白 VP3 和 VP7 以及 3 个微量蛋白
VP1、VP4和 VP6 构成［8］;这些蛋白共同形成群特异
性抗原表位［9］。本研究所设计的引物即位于基因组
M． DL2000 Marker;1．血清型 2;2．血清型 3;3．血清型 4;
4．血清型 7;5．血清型 8;6．血清型 9;7．阴性对照
图 1 引物 I-VP7-1＆I-VP7-2 对非洲
马瘟病毒的扩增电泳图
M． DL2000 Marker;1．血清型 2;2．血清型 3;3． 血清型 4;4．
血清型 7;5．血清型 8;6．血清型 9;7．阴性对照
图 2 引物 Fs1＆Rs1 对非洲
马瘟病毒的扩增电泳图
M． DL2000 Marker;1 － 4．引物 I-VP7-1＆I-VP7-2 对不同病毒
RNA的扩增结果，其中 1 为 AHSV，2 为 BTV，3 为 EHDV，4
为阴性对照;5 － 8．引物 Fs1＆Rs1 对不同病毒 RNA 的扩增
结果，其中 5 为 AHSV，6 为 BTV，7 为 EHDV，8 为阴性对照
图 3 两对引物(I-VP7-1＆I-VP7-2 及 Fs1＆Rs1)
对 AHSV、BTV及 EDHV的扩增结果
图 4 引物 Fs1＆Rs1 扩增的 AHSV
片段代表序列(5→3)
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2011 年第 4 期 赵文华等:非洲马瘟病毒群特异性 RT-PCR检测方法的研究
图 5 引物 I-VP7-1＆I-VP7-2 扩增的
AHSV片段代表序列(5→3)
片段 S7 所编码的 VP7 蛋白区域，为群特异性
区段。其中引物对 Fs1＆Rs1 为 OIE 所推荐的引
物，引物对 I-VP7-1＆I-VP7-2 为自己根据参考序列
所设计的引物;两对引物均可对 6 种血清型的
AHSV RNA进行敏感、特异的扩增，但从扩增片段
的长度来看(分别为 102 bp 和 415 bp) ，新设计的
引物对 I-VP7-1＆I-VP7-2 用于 AHSV 的快速检测
更为合适。
AHS目前已知有 9 个血清型，各型之间有一
定的交叉保护，尤其是在 AHSV-1 和 2、AHSV-3 和
7、AHSV-5 和 8 以及 AHSV-6 和 9 之间［10］。南非
Onderstepoort兽医研究所是 OIE 指定的 AHS 的参
考实验室(Reference Laboratory)［10］。本试验研究
只得到 6 种血清型(2、3、4、7、8 和 9)的 RNA，但因
所设计的引物是针对序列较为保守的 VP7 蛋白基
因片段，变异程度不是太大。既然此两对引物可
对已有的 6 种血清型进行特异扩增，理论上对两
种血清型亦应可扩增，但尚需实际应用证实。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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