全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
牛流行热病毒 LUXTM荧光 RTPCR检测方法的建立
刘志玲 1, 2 陈茹 1 邱索平 1 马静云 2 曾碧健 1 周科 1
( 1广东出入境检验检疫局,广州 510623; 2华南农业大学动物科学院,广州 510642)
摘 要: 采用 LUXTM荧光 PCR技术原理, 以牛流行热病毒 ( BEFV )糖蛋白抗原 G基因保守序列为模板设计特异荧光
PCR扩增引物,建立 BEFV LUXTM实时荧光 RTPCR快速检测方法。试验结果显示, 所建立的荧光 RTPCR可特异检测牛流行
热病毒 RNA, 而对蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻 粘膜病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛白血病病毒以及与 BEFV同种属
的狂犬病病毒核酸检测呈阴性反应。敏感性试验表明 LUXTM荧光 RTPCR对 BEFV RNA的检测敏感性比常规 RTPCR方法
提高达 100倍以上。该 LUXTM荧光 RTPCR的批内检测变异系数 0. 64% - 1. 17% ,批间检测变异系数均小于 2% ,表明检测体
系稳定、重复性好。通过人工添加灭活病毒液的方法制备 30份模拟感染牛血清样品, 采用上述所建立的 BEFV LUXTM荧光
RTPCR方法检测均呈阳性。
关键词: 牛流行热病毒 LUXTM荧光引物 实时荧光 RTPCR
Establishment of LUX
TM
Realtime Assaies for Rapid
Detection of Bovine Ephemeral Fever Virus
L iu Zhiling
1, 2 Chen Ru1 Q iu Suoping1 M a Jingyun2 Zeng Bijian1 Zhou Ke1
(
1
Guangdong EntryEx it Insp ection and QuarantineBureau, Guangzhou 510623;
2
College of A nimal Science; South China Agricultural University, Guangzhou 510642)
Abstrac:t A LUXTM flourescent RTPCR /PCR assayw as estab lished for detecting bov ine ephem e ra l feve r v irus. The LUXTM prim
e rs w ere des igned based on G gene sequence. BLAST ana lysis show ed that the pr im er s sequences w ere BEFV spec ific and h igh ly con
serv ed. The spec ific ity o f the assayw as confirm ed w ith BEFV RNA, but negative result was obta ined by testing o ther re lated bov ine v irus
( BLV, BVD, VSV, FMD) and genom icRNA from hea lthy cattle. The resu lt o f LUXTM RTPCR assay show 100fo ld increase in sensitiv
ity when compared to a conventional PCR me thod. A ll o f the coe fficien t o f variation of intraassay and interassay w ere less than 1% in
the quantitative tests. It takes less than 3 h to comp le te the who le procedure, inc lud ing RNA extrac tion, realtime amp lifica tion and dis
sociation ana lysis.
Key words: BEFV LUXTM prim ers Rea ltim e PCR
收稿日期: 20100113
基金项目:国家质检总局科研项目 ( 2006IK019)
作者简介:刘志玲,女,在读硕士,研究方向:动物营养与免疫; Em ai:l jol in_yaya@ 126. com
通讯作者:陈茹, Em ai:l chen r@ gq ciq. gov. cn
牛流行热 ( bov ine ephemera l fever, BEF )又称牛
暂时热、牛三日热、僵硬病等, 是由弹状病毒科
( Rhabdov iridae)成员牛流行热病毒 ( BEFV )引起牛
和水牛的一种急性热性传染病。其特征是突发高
热、呼吸迫促、消化道机能障碍以及跛行和肢体僵
直 [ 1]。本病虽然死亡率低但发病率高、传播迅速。
该病可导致奶牛产奶量和奶质下降, 种公牛精子畸
形,役用牛跛行或瘫痪,部分怀孕母牛流产等,给养牛
业造成严重的经济损失。从 1955年起,我国曾发生 7
次 BEF大流行 [ 2] ,目前我国北方和南方一些省份时
有发生此病。牛流行热的传播媒介是按蚊、库蠓等吸
血昆虫。BEFV病毒主要存在于病牛的血液中, 感染
牛发病期的血液中含有大量病毒,是重要的传染源。
牛流行热引起牛发热、流产、产乳量和生殖力下
降等临床症状与 IBR相似,后者是我国进境动物检
验二类动物疫病, 建立 BEFV特异检测方法可快速
2010年第 8期 刘志玲等:牛流行热病毒 LUXTM荧光 RTPCR检测方法的建立
鉴别 IBR与 BEF,对于活牛进出境检疫以及国内疫
情监测均有重要意义。
牛流行热的诊断方法已报道的主要有 ELISA
和微量血清中和试验等血清学检测方法 [ 3. 4] , 国内
目前主要采用微量血清中和试验方法 [ 5] , 由于需采
用活毒,存在病毒污染扩散的风险,影响了牛流行热
及时诊断。荧光 PCR等分子生物学检测技术具有
快速、高灵敏、高特异、高通量等优点,已广泛应用于
各重要疫病病原体的检测。建立针对牛流行热等急
性传染病分子生物学快速诊断方法具有实用意义。
目前, 牛流行热分子生物学诊断方法报道仅有国外
一篇报道, 即采用 TaqM an探针技术原理建立特异
检测牛流行热病毒的实时荧光 RTPCR方法 [ 6 ]。国
内目前亟需建立该病的快速检测方法。
本研究采用 LUXTM ( L ight upon extension)新型
荧光 PCR技术原理, 以 BEFV糖蛋白 G基因为靶基
因建立实时荧光 PCR检测方法。 LUXTM新型荧光
PCR技术将目标特异的引物对中任意一条设计为
带有末端回文结构,并在 3末端标记荧光素。在没
有目标片段的时候, 引物与模板配对, 发夹结构打
开,产生特异的荧光信号。LUXTM荧光 PCR的特异
性、敏感性与双标记 TaqM an探针技术相当, 但成本
较低。国内外已有多篇应用 LUXTM PCR技术进行
动植物疫病检测研究的报道 [ 7- 10]。本研究旨在首
次建立可特异检测牛流行热病毒感染的 LUXTM实时
荧光 RTPCR检测方法。
1 材料与方法
1. 1 病毒样品
BEFV弱毒株购自中国兽医与药品监督所。牛病
毒性腹泻黏膜病毒 ( BVDV), 灭活口蹄疫病毒 ( FM
DV)、蓝舌病病毒 (BTV)、水泡性口炎病毒 (VSV )、牛白
血病病毒 (BLV)、牛传染性喉鼻气管炎病毒 ( IBRV )为
广东出入境检验检疫局技术中心保存。
1. 2 病毒核酸提取方法
病毒液、模拟阳性临床样品采用病毒 RNA提取
试剂盒 (天根 Ca.t DP315R )提取 RNA。低速离心
取上清,按试剂盒说明书步骤提取总 RNA, 最后以
50 L洗脱。
1. 3 模拟阳性临床样品的制备
取 BEFV灭活病毒液适量,添加到 30份阴性牛
血清样品中,按 1. 2的方法提取病毒 RNA。
1. 4 LUXTM引物的设计及序列特异性分析
根据 BEFV G 基因序列 ( GenBank 登录号:
AF208840),采用在线 LUXTM专业软件 ( http: / /www.
inv itrogen. com / lux )设计 LUXTM荧光 RTPCR引物,对
软件产生的多对引物进行配对及筛选,并采用 NCB I
BLAST在线分析软件,对各引物进行特异性和病毒适
配性分析,根据分析结果选择合适的引物组合。所选
定的引物扩增区对应 GenBankAF208840序列1 650-
1 704 bp区域,上游引物为 BEFVF: 5CGTTGTCTG
TAGGTGCAATAGTCACAACG3,下游引物为 BEFV
R: 5CCTTCCAGATCAGTTTCATTATGC3。上游引物
5端添加发夹形成序列, 3端标记 FAM荧光基团。引
物由美国 Invitrogen公司合成并标记 FAM荧光基团。
1. 5 BEFV LUXTM荧光 RTPCR反应体系的建立与
优化
采用 Inv itrogen一步法 RTPCR试剂盒 ( Invitro
gen ca.t 11732020), 以 BEFV RNA作为模板, 建立
BEFV LUX
TM荧光 RTPCR检测方法。通过梯度试
验, 对引物浓度、Mg2+浓度、模板浓度、退火温度、循
环次数等反应条件进行优化。
1. 6 BEFV LUXTM荧光 RTPCR检测方法特异性的
检测
将感染牛常见的各种 RNA病毒 ( FMDV、BTV、
BVDV、BLV、VSV IN型、VSV N J型 ) ,以及与 BEFV
同种属的狂犬病病毒 ( RV )、健康牛肉组织、培养
BEFV的 BHK21细胞等按 1. 2提取 RNA后, 作为
对照模板进行 BEFV荧光 RTPCR检测,同时设 BE
FV核酸阳性对照及水阴性对照,以验证 LUXTM荧光
RTPCR检测 BEFV RNA的特异性。
1. 7 BEFV LUXTM荧光 RTPCR检测敏感性确定
BHK21 /BEFV细胞培养液反复冻融后低速离
心, 取上清, 按 1. 2的方法提取 RNA后, 测定 RNA
核酸的浓度为 21 ng /L。用无菌双蒸水做 10倍系
列稀释,取 100 - 104个稀释度的核酸样品各 3 L进
行 LUXTM荧光 RTPCR检测, 每个稀释度做两个平
行。测定该方法的检测灵敏度,并绘制标准曲线。
1. 8 BEFV LUXTM荧光 RTPCR对模拟临床样品的
检测
采用优化的 BEFV LUXTM荧光 RTPCR方法对
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
1. 2提取的模拟临床样品核酸进行检测。
2 结果
2. 1 BEFV LUXTM荧光 RTPCR反应体系的建立与
优化
将荧光 RTPCR反应体系和反应条件进行优
化,确定反应体系为 25 L, 含 12. 5 L RTPCR预
混液 ( Inv itrogen ca.t 11732020), 1- 2 un it RT /P lat i
num
Taq酶, 5 L模板, BEFVF、BEFVR LUXTM上
下游引物 ( 10 mo l/L )各 1 L。荧光 RTPCR反应
条件: 60 15m in, 95 2m in;然后 95 15 s, 65
40 s, 45个循环; 在每个循环 65 反应时采集荧光
信号; 熔解曲线分析采用设备预设条件。反应结束,
根据扩增曲线和熔解曲线检测分析结果进行判定。
本研究荧光 RTPCR反应在 ABI 7500荧光 PCR仪
上进行。
2. 2 BEFV荧光 RTPCR特异性试验
BEFV荧光 RTPCR特异性试验结果 (图 1A )
显示,对不同代次的 BHK21BEFV RNA呈典型的 S
型曲线,为阳性反应, 而对 FMDV、BTV、BVDV、VSV
IN型、VSV N J型、RV、BHK21细胞、健康牛血清、
健康牛肉组织的 RNA及水呈阴性反应。溶解曲线
(图 1B)分析表明表明 LUXTM荧光 RTPCR反应只
有单一溶解曲线峰, 反应产物熔点在 78 - 81 之
间。
A.扩增曲线; B.熔解曲线
图 1 牛流行热 LUXTM荧光 RTPCR特异性试验
2. 2 BEFV荧光 RTPCR敏感性试验
敏感性试验结果 (图 2, 表 1)表明, LUXTM荧光
RTPCR检测 BEFV RNA的灵敏度可达 103稀释度,
相当于 63 pg /L RNA。以临界循环数 ( thresho ld cy
cle, C t)为 y轴,对应的核酸浓度为 x轴,制作标准曲
线 (图 3),所得标准曲线斜率为 - 3. 178,反应的相关系
数为 0. 996,标准曲线方程为 y= - 3. 178x+ 46. 938。
采用与 LUXTM荧光 RTCPR相同序列的常规引
物对上述系列稀释的病毒 RNA模板进行常规 RT
PCR检测, 比较两种方法的检测敏感性, 结果显示,
LUX
TM荧光 RTPCR方法的敏感性比常规 RTPCR
方法提高达 100倍。
A.扩增曲线; B.熔解曲线
图 2 BEFV LUXTM荧光 RTPCR对稀释模板检查敏感性试验
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2010年第 8期 刘志玲等:牛流行热病毒 LUXTM荧光 RTPCR检测方法的建立
图 3 BEFV LUXTM荧光 RTPCR标准曲线
表 1 BEFV LUXTM荧光 RTPCR对病
毒核酸的检测敏感性试验
稀释度 C t值 熔解曲线吸收峰值
100 27. 5 30 000
101 30. 8 30 000
102 33. 6 28 000
103 37. 2 20 000
104 > 45
2. 3 对模拟阳性临床样品检测试验
对 30份模拟阳性牛血清样品按 1. 3的方法提
取 RNA后进行 LUXTM荧光 RTPCR检测, 结果 (图
4)均呈阳性反应, 荧光 RTPCR 反应 C t值为
31- 33。
2. 4 重复性和稳定性试验
选取 3. 1 10- 1、3. 1 10- 2、3. 1 10- 3 ng /L
三个浓度的 BEFV RNA核酸作为模板, 进行 BEFV
LUX
TM荧光 RTPCR重复性和稳定性检测试验。
分别对每份核酸样品进行 4孔重复检测试验, 比
较 C t值差异并计算变异系数 (批内变异系数, in
terassay CV% )。对每份病毒核酸样品进行 4次
重复检测, 比较 C t值并计算变异系数 (批间变异
系数, intraassay CV% )结果如表 2所示,批内检测
变异系数 0. 64% - 1. 17% , 批间检测变异系数均
小于 2%。
A.扩增曲线; B.熔解曲线
图 4 BEFV LUXTM荧光 RTPCR对模拟阳性样品的检测试验。
表 2 重复性试验结果
核酸样品
(模板浓度 ng /L)
批内变异系数
(% )
批间变异系数
(% )
3. 1 10- 1 0. 64 0. 74
3. 1 10- 2 1. 17 0. 33
3. 1 10- 3 0. 66 0. 84
3 讨论
建立牛流行热快速诊断方法对于进出境动物检
疫、养牛业疫病防控均有重要的现实意义。我国引
进良种奶牛的主要贸易国澳大利亚是 BEF流行地
区, 目前双边检疫条款尚未将本病列入检疫名录。
我国曾在对进境牛检疫过程中发现牛群发生发热症
状, 最后诊断为牛流行热,说明从国外引进活牛存在
发生牛流行热的风险,进出境检验检疫部门有必要
针对牛流行热建立有效的监控和检测手段。牛流行
热在临床症状上与牛传染性鼻气管炎相似, 后者是
进境牛重点检疫疫病,国内外均已建立分子生物学
快速检测方法,而牛流行热的分子生物学诊断研究
在国内外都很少报道,本病快速诊断方法的缺乏不
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利于进境牛检疫工作。除牛传染性鼻气管炎外,牛
流行热的诊断常需与牛茨城病、牛病毒性腹泻黏膜
病、牛副流行性感冒、恶性卡他热等病相区别, 这几
种病临床症状均有相似之处,临床诊断需具备丰富
的经验,开展牛流行热分子生物学快速诊断方法研
究将为快速准确诊断本病提供技术手段。
牛流行热病毒 ( BEFV )属弹状病毒科, 是一种
单链负链 RNA病毒,其基因组大小约 1. 49 kb,编码
5种结构蛋白, 包括核蛋白 ( N )、聚合酶结合蛋白
( P )、基质蛋白 (M )、病毒 RNA聚合酶 ( L )以及表面
糖蛋白 ( G ) [ 11]。表面糖蛋白 G是种属特异的主要
免疫原性蛋白, 因此本研究选择 BEFV G基因保守
区域设计 LUX引物,经 NCB I在线 BLAST分析所设
计的引物为 BEFV特异, 与其它牛源传染病病毒基
因序列无交叉。
本研究首次建立了 LUXTM荧光 PCR检测牛流
行热病毒快速的方法。LUXTM荧光核酸扩增技术于
2002年由美国一家生物技术公司发明,与依赖荧光
标记探针的 T aqM an、MGB荧光 PCR技术相比,具有
设计简便、性价比高等优点。LUXTM荧光 PCR技术
的原理是在其中一条扩增引物序列中引入发夹结构
并标记上荧光基团,在 PCR循环过程中当引物与靶
序列配对时,发夹结构打开、抑制作用解除、荧光恢
复从而产生可检测的光信号。LUXTM荧光 PCR技术
与目前广泛应用的 TaqM an探针技术相比, 简化了
扩增体系,使反应更易优化,不用合成探针还节省了
成本。此外, 采用 LUXTM实时荧光 PCR技术, 可对
扩增反应产物进行熔解曲线分析, 充分保障检测结
果的特异性。研究过程发现,一些在扩增反应过程
中呈现阳性反应的样品, 经熔解曲线分析辨明为引
物二聚体或非特异扩增产物。因此, LUXTM荧光
PCR /RTPCR技术除通过特异引物扩增, 还可采用
熔解曲线分析作为特异性的第二重保障。
在进出境牛检疫工作中,普遍通过采血样进行
各种疫病的检测工作, 目前从血液中提取病毒核酸
的技术非常成熟。牛流行热病毒主要存在于患病牛
的血液中,便于临床样品采集并提取核酸进行病原
快速检测。本研究制备模拟感染血样, 证实所建立
的方法检测敏感高效。本研究建立的 LUXTM荧光
RTPCR方法可应用于对进出境牛进行 BEFV感染
调查,开展风险分析等工作。牛流行热的传播媒介
是吸血昆虫,本方法也可用于对蚊、蠓等昆虫带毒的
快速检测调查,有助于及时防疫本病。
本研究所建立的 BEFV LUXTM荧光 RTPCR方
法,整体检测时间包括样品处理、熔解曲线分析,
可在 3 h内完成, 达到快速诊断的目的。试验结果
表明, 本方法能特异检测 BEFV病毒核酸, 与其它
常见牛病原以及牛基因组核酸样品无非特异性交
叉反应。检测敏感性比常规 RTPCR方法可提高
100倍以上,能满足临床诊断要求。对模拟感染牛
血液样品的检测试验证实, 本研究所建立的
LUX
TM荧光 RTPCR可快速检测到牛血样中的牛
流行热病毒。
综上所述, 本研究提供了一种快速检测牛流行
热病毒的新型 LUXTM荧光 RTPCR快速检测方法,
在进出境检疫以及临床动物疫病防控领域均有推广
应用价值。
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