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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
卵巢运输温度及卵母细胞促成熟因子对山羊卵母
细胞体外成熟和体外受精的影响
孙新明 戴彩华  罗婷
(井冈山大学医学院,吉安 343009)
  摘  要:  探讨山羊卵母细胞体外成熟培养的影响因素 , 为优化山羊体外受精程序奠定基础。比较从屠宰场采摘的
山羊卵巢运输温度和体外培养促成熟因子对卵母细胞体外成熟培养和体外受精效果的影响。结果表明, 在运输温度接
近室温 ( 25 2) ! 时的卵母细胞成熟率显著高于接近体温 ( 36 2 ) ! 时的运输温度 (成熟率分别为 53
8% , 35
0% ,
P < 0
01) , 两种运输温度的卵巢卵母细胞成熟培养后体外受精率无显著差异 (分别为 37
9% , 36
6% , P > 0
05 )。与
在体外成熟基础培养液 (M 1: M 199 m ed ia+ 1
g /mL E2 + 10
g /m L FSH + 10
g /mL LH + 20% EGS)中进行成熟培养相
比 , 在基础培养液中仅添加 20 ng /mL EGF ( M
2
)和另外添加 10% GFF ( M
3
) 进行体外成熟培养的卵母细胞成熟率均有
明显提高, 其中成熟率在 M 1为 53
8% , 极显著低于 M 2的 69
5%和 M 3的 72
6% , P < 0
01; M 2和 M 3间差异不显著;
卵母细胞成熟培养后体外受精率在三者间无明显差异分别为 37
9% , 39
5%和 40
6% , P > 0
05。山羊体外受精时从
屠宰场采摘的卵巢宜在室温条件下进行运输 , 在体外成熟培养体系中加入 EGF和 GFF均可有效促进山羊卵母细胞的
体外成熟, 但 EGF起关键作用。
关键词:  卵巢运输温度  促成熟因子  体外成熟  体外受精  山羊
The Effect ofOvary Transfer Temperature andMaturationpromoting
Factors on in vitroMaturation and in vitro Fertilization ofOocytes inGoats
Sun X inm ing Da iCaihua Luo T ing
(College of M edicine, J inggangshan University, Ji
an 343009)
  Abstrac:t  The facto rs influenc ing m atura tion of goat oocytes in vitro w ere investigated to optim ize the precedures of in v itro fertili
zation in goats
The experim ents w ere carr ied out to compare the effect of deferent transferring temperature o f ova ries collec ted from
slaughtered goa ts and in vitro m aturationprom oting factors on the effic iency of in vitro m atu ration and in vitro fertilization o f oo
cy tes
Them a turation rate o f oo cy tes com e from the ovar ies transferred at room tem pe ra ture( 25 2) ! w as sign ificantly h igher than that
at body tem perature( 36 2) ! ( 53
8% vs 35
0% , P < 0
01)
But there was no s ignificant d ifferences betw een the fertilization rates
o fm a ture oocy tes com e from the ovar ies transferred at the two tem pe ra tures( 37
9% vs 36
6% , P > 0
05)
Them a turation rate of oo
cy tes cultured in basicm edia(M 1: M 199 m edia+ 1
g /mL E2 + 10
g /mL FSH + 10
g /mL LH + 20% EGS) was s ignificantly low er
than that cultured in the basic m ed ia supplem en ted w ith 20 ng /mL EGF (M 2 ) ( 69
5% vs 53
8% , P < 0
01) and in the basic m ed ia
w ith 20 ng /mL EGF and 10% GFF( M
3
) ( 72
6% vs 53
8% , P < 0
01)
But them aturation ra tes of oocy tes cu ltured in M
2
andM
3
w ere
not significantly different(P > 0
05)
There were no sign ificant differences am ong the fertilization rates o fm ature oocy tes cu ltured in the
three m ed ia( 37
9% , 39
5% and 40
6% , P > 0
05)
The results ind icated that the goat ova ries shou ld be transferred at room tem pera
tu re, both EGF and GFF can promo te in vitro ma turation o f goa t oocy tes e ffectively, bu t EGF plays a key ro le

Key words:  T ransferr ing tem perature o f ova ries M aturationprom oting fac tors In v itro m atu ration In vitro fertilization Goats
收稿日期: 20100107
作者简介:孙新明,男,博士,副教授,从事胚胎工程和医学基础教学与科研; Em ai:l sunx inm ing2007@ 163
com
体外成熟培养 ( IVM )是现代胚胎工程中的一个 主要技术环节,其主要目的是充分利用卵巢上丰富
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
的卵母细胞资源用于体外受精、核移植和转基因等
相关胚胎工程技术以及发育生物学机理等的研究。
随着体外受精技术的发展, IVM已成为体外生产胚
胎的限制因素,卵母细胞的成熟质量对受精卵的发
育能力有重要影响。有试验表明, 体外受精囊胚前
期的胚胎代谢活动主要是母源性基因及其代谢产
物,如 mRNA、RNA、蛋白质等的调控,受精率和囊胚
发育率的高低取决于卵母细胞的成熟情况。影响卵
母细胞体外成熟的因素很多,现已知影响卵母细胞
成熟的因素主要包括:动物种类和年龄、卵巢发育阶
段及其运输保存温度和时间、卵丘卵母细胞复合体
的质量、成熟培养液的选择、培养液中的激素及生长
因子、卵泡的大小、其他添加物,还有培养时间的长
短等。本试验就屠宰场采摘的山羊卵巢运输温度和
体外培养成熟因子对山羊卵母细胞体外成熟和体外
受精能力的影响进行研究, 旨在为优化山羊体外受
精程序奠定基础。
1 材料与方法
1
1 材料
1
1
1 试验动物 试验用山羊卵巢采自屠宰场;试
验用公羊为 2- 3岁、健康、有正常繁殖能力的南疆
黄羊。
1
1
2 试剂  M199、E2、FSH、LH、IA 23187、EGF、
透明质酸酶及 BSA均购于美国 S igm a公司; 肝素
( heparin)购于华美生物工程公司; 山羊卵泡液
( GFF)、发情山羊血清 ( EGS)自制;其他常规普通试
剂均为国产分析纯。
1
1
3 仪器  体视显微镜: (日本 N ikon SM Z45) ;
CO2培养箱 (德国 HERAEUS B5060) ; DF200A型电
子分析天平 (常熟市衡器厂 DF200A)。
1
2 方法
1
2
1 卵巢运输及卵母细胞采集 屠宰场采集
山羊卵巢后放入含双抗的灭菌生理盐水中进行运
输, 运输温度分别采用在采用接近室温 ( 25 2) !
和接近体温 ( 36 2) ! , 以比较屠宰场采取的山羊
卵巢运输温度对卵母细胞体外成熟和体外受精能
力的影响。卵巢在 2 h内到达实验室后用 37! 含
双抗灭菌生理盐水洗 3次, 用注射器吸取卵巢表
面直径为 2- 6 mm 的卵泡卵母细胞, 将吸取的卵
泡液倒入平皿内,显微镜下选择 A级 (卵丘为 3层
或以上、包裹致密, 卵母细胞胞质黑色均一 )、B级
(卵丘为 1- 2层、包裹较为致密, 胞质黑色均一 )卵
丘卵母细胞复合体 ( COCS ), 在卵母细胞体外成熟
基础培养液 ( M1, 见 1
2
2 )中于培养箱条件
( 38
5! 、5% CO 2、饱和湿度 )下体外培养 24- 27 h
后,观察透明带周围颗粒细胞扩展情况,并经 0
1%透
明质酸酶 mPBS消化吹打去丘, 解剖显微镜观察第
一极体 ( PB1) ,统计卵母细胞成熟率 (以周围卵丘细
胞充分扩展和卵母细胞释放 PB1为卵母细胞成熟
的标志 )。对培养成熟的卵母细胞进行体外受精。
1
2
2 卵母细胞体外成熟培养 用 1
2
1中成熟
培养效果较好的运输温度采集的山羊卵丘卵母细胞
复合体 (A、B级 )在卵母细胞基础培养液 (M 199培
养液 + 1
g /mL E2 + 10
g /mL FSH+ 10
g /mL LH
+ 20% EGS, 记为 M 1 )、卵母细胞基础培养液 + 20
ng /mL EGF(记为 M 2 )和卵母细胞基础培养液 ( EGS
浓度改为 10% ) + 20 ng /mL EGF + 10% GFF (记为
M3 ) 3种培养体系中按 1
2
1中方法进行成熟培养
和观察,统计卵母细胞成熟率,并对培养成熟的卵母
细胞进行体外受精。
1
2
3 成熟卵母细胞体外受精 采集公羊鲜精液,
用不含葡萄糖的 mDM液 + 10mmol /L咖啡因 1 500
r/m in离心洗涤 3次,调节精子浓度为 1 ∀ 106 - 2 ∀
10
6个 /mL, 等量加入 50
L 预平衡 1 - 2 h含
20
g /mL Heparin的 mDM液 [ 1] ,制成 100
L受精
微滴,在培养箱 ( 38
5! 、5% CO2空气、饱和湿度 )中
获能 40- 60m in。对 1
2
1和 1
2
2中培养 27 h的
成熟卵母细胞轻轻吹打部分去丘, 在受精液中洗涤
3次,移入受精微滴,每滴 20- 25枚卵, 精卵共同作
用16- 20 h后, 用改良的合成输卵管液 ( mSOF ) [ 2]
洗涤 3次,去除卵母细胞周围的精子和卵丘细胞, 转
入 50
L mSOF + 6mg /mL BSA +卵丘细胞单层饲
养层 ( cumu lus cell mono layer, CC )胚胎培养体系中
培养箱条件下进行培养。每隔 12 h观察并统计卵
子的受精情况,比较几种来源的成熟卵母细胞在体
外受精后的受精率 (以释放第二极体和卵裂为
标志 )。
1
2
4 统计方法 用 SPSS软件 forW indow s( 11
0)
软件中 Oneway Anova对试验结果进行统计分析,并
用 LSD方法进行多重比较。
184
2010年第 8期  孙新明等:卵巢运输温度及卵母细胞促成熟因子对山羊卵母细胞体外成熟和体外受精的影响
2 结果
2
1 体外运输温度对卵母细胞体外成熟的影响
山羊卵巢不同运输温度下卵母细胞体外成熟
和体外受精的结果见表 1。统计结果显示, 在运输
温度接近室温 ( 25 2 ) ! 时的卵母细胞成熟率和
体外受精率均显著高于接近体温 ( 36 2) ! 时的
运输温度, 其中成熟率分别为 53
8% 和 35
0%,
P < 0
01; 受精率分别为 37
9% 和 36
6% , P >
0
05。表明后续试验宜选用接近室温的温度进行
卵巢运输。
表 1 山羊卵巢不同运输温度下卵母细胞
体外成熟和体外受精结果
运输温度 卵母细胞数 成熟卵数
(成熟率% )
卵裂卵数
(受精率% )
接近室温 156 84( 53
8) a 32( 37
9 )
接近体温 140 49( 35
0) b 18( 36
6 )
 同列肩注字母 a与 b间表示差异极显著 (P < 0
01)
2
2 促成熟因子对卵母细胞体外成熟和体外受精
的影响
体外培养体系中添加不同促成熟因子的卵母细
胞体外成熟和体外受精结果见表 2。统计结果显
示,与在体外成熟基础培养液 (M1 )中进行成熟培养
相比, 在基础培养液中仅添加 20 ng /mL EGF(M 2 )
和另外添加 10% GFF(M3 ) 进行体外成熟培养的卵
母细胞成熟率与受精率均有明显提高, 其中成熟率
在 M1为 53
9%, 极显著低于 M2的 69
5%和 M3的
72
6%, P < 0
01; M2和 M3间差异不显著。受精率
在三者间无显著差异, 分别为 37
9% , 39
5% 和
40
6%, P > 0
05。
表 2 山羊卵巢不同运输温度下卵母细胞体外
成熟和体外受精结果
成熟培养
系统 卵母细胞数
成熟卵数
(成熟率% )
卵裂卵数
(受精率% )
M 1 156 84( 53
8) a 32( 37
9 )
M 2 164 114( 69
5) b 45( 39
5 )
M 3 176 128( 72
6) b 52( 40
6 )
 同列肩注字母 a与 b间表示差异极显著 (P < 0
01)
3 讨论
3
1 卵巢运输温度对卵母细胞体外成熟培养效果
的影响
研究发现, 从屠宰场采取的各种动物卵巢运输
到实验室过程中的运输温度对随后卵母细胞的体外
成熟培养均有明显的影响, 但不同作者报道的结果
差别较大。文国艺 [ 3]的研究报道认为,卵巢的运输
温度不仅影响卵母细胞的成熟, 而且对卵母细胞随
后的体外受精有着重要的影响, 在体温以下运输保
存卵巢时随温度降低,卵巢卵母细胞的受精率逐渐
下降。但李华威等 [ 4]对猪卵巢卵母细胞的体外受
精和体外发育研究结果与此差别很大,当运输温度
接近室温 ( 27 2) ! 时,体外受精率为 53
0% ,显著
高于运输温度接近体温 ( 36 2) ! 时的受精率
( 39
1% ), 但 2组的囊胚形成率无显著差异, 当温
度降为 ( 20 2) ! 时, 受精率下降到 32
4%。库尔
班
吐拉克等 [ 5]的研究结果显示, 野生梅花鹿卵巢
在 20- 25! 下保存 12 h,卵母细胞成熟率为 77%,
无变形卵子出现, 但其保存时间延长到 24 h时, 卵
母细胞成熟率降至 35% , 变形率高达 62% ; 而在
10- 15! 下保存 12 h, 卵母细胞成熟率为 45% , 卵
母细胞变形率为 18%, 表明不仅运输温度对卵母细
胞成熟有明显影响,成熟培养前的运输保存时间对
卵母细胞的体外成熟也有重大影响。这些试验结果
结果均表明,各种动物卵巢不宜在低于室温条件和
体外长时间进行运输保存。
本试验比较了山羊卵巢在短时间 ( 2 h)内于接
近体温和接近室温两种运输温度对卵母细胞体外成
熟及体外受精的影响,结果显示, 接近室温运输保存
更有利于随后卵母细胞的体外成熟培养,获得的体
外成熟率显著高于接近体温运输保存卵巢, 与刘青
春等 [ 6]在绵羊的研究结果相似。推测认为, 体温条
件下活组织中各种代谢酶的生物活性可能最高, 这
反而不利于活组织细胞的体外暂时保存,但两者在
卵母细胞体外成熟培养后的受精率无显著差异, 与
文国艺 [ 3]及李华威 [ 4]的研究报道呈现不同结果。
我们认为,这不仅是由动物品种差异导致,更为重要
的是,本研究是基于对挑选出来的成熟卵母细胞进
行体外受精,而他们用于体外受精的卵子是所有进
行成熟培养的卵母细胞, 即计算的基数不一样。一
185
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
般认为,在进行体外成熟培养后,应挑选培养成熟的
卵母细胞进行体外受精处理,对成熟培养过程中发
生退化的卵母细胞进行受精处理是毫无价值的。
3
2 体外培养成熟因子对卵母细胞体外成熟培养
效果的影响
体内卵母细胞生长、发育和成熟主要依赖于促性
腺激素特别是 FSH和 LH调控,因此卵母细胞体外成
熟培养时,通常在培养基中加入激素 [ 7]。同时,血清
是体外培养系统中卵母细胞生长发育的蛋白和各种
生长因子主要来源,因而通常在成熟培养基中加入
10% - 20% FCS或 6 g /L BSA。近年来发现发情动物
血清被用于替代 FCS或 BSA,但关于发情动物血清效
果的报道,研究者的结果相互矛盾 [ 810] ,一般认为, 发
情血清较 FCS更有利于卵丘充分扩散,受精后的卵裂
率明显升高,提示发情血清有助于胞质成熟 [ 9]。因此,
本试验利用 M199培养液 + 1
g /mL E2 + 10
g /mL
FSH + 10
g /mL LH+ 20% EGS作为卵母细胞基础培
养液。
本试验结果显示,基础培养液中加入 EGF ( ep i
dermal g row th factor)和另加入山羊卵泡液 ( goat fo llic
u lar flu id, GFF)培养的卵母细胞体外成熟率极显著
高于基础培养液,而另加入 GFF培养的卵母细胞体
外成熟率略高于在基础培养液中仅加入 EGF培养
组,表明 EGF和 GFF均可有效促进山羊卵母细胞的
体外成熟,但 EGF起关键作用。培养基中促性腺激
素和蛋白质是保证卵母细胞体外成熟的前提, 但加
入其它因子, 如 EGF等, 是增加卵子体外成熟率的
必要措施, EGF能诱导卵母细胞生发泡破裂 ( germ i
nal vesicle breakdown , GVBD )的发生, 而促进动物
卵母细胞的成熟 [ 1113]。 Lonergan等 [ 14]研究认为,
EGF可促进卵丘充分扩展, 显著增加体外培养的牛
卵母细胞达到减数分裂 II期的比例和增加受精后
卵裂率及受精后 72 h发育至 5- 8细胞胚胎的比
例。Lorenzo等 [ 15]研究认为, EGF可促进体外培养
的马卵子细胞核成熟率, 并检测到卵丘卵母细胞复
合体有 EGF受体的存在。关于卵泡液对卵母细胞成
熟的影响,研究结果差异较大,甚至相互矛盾, Ayoub
等 [ 16]比较了各发情阶段不同大小的牛卵泡液 ( BFF)
对卵母细胞体外成熟培养的影响, 结果表明,从发情
后期大卵泡收集的卵泡液对牛卵泡 GVBD的抑制效
应小于从发情后期末和发情间期早期大卵泡收集的
BFF,而从发情期中、小卵泡收集的 BFF却能强烈的
抑制 GVBD的发生。但李红等 [ 17]对山羊卵泡卵母细
胞体外培养结果表明, 在成熟培养液里添加 20%卵
泡液,卵母细胞体外培养成熟卵率比未加卵泡液的卵
母细胞成熟率高 ( 66
7%与 54
5% ),但差异不显著。
Moo r等 [ 18]研究认为,卵泡液中足够的孕酮含量对卵
母细胞的成熟具有促进作用。
本试验结果表明,屠宰场采取的山羊卵巢宜在
接近室温环境下进行短期运输保存, 成熟培养液中
除了一般的蛋白质和激素外, 还应加入表皮生长因
子 ( EGF)和山羊卵泡液 ( GFF)等因子,以有效促进
卵母细胞的体外成熟。
参 考 文 献
[ 1] Izqu ierdo D, V il lam ed ian a P, Palom oM J, et a.l E ffect of capacitation
and fert ilizat ion m edia on IVF and early emb ryo developm en t of p re
pubertal goat oocyte. Theriogenology, 1998, 49 ( 8) : 15011513.
[ 2] 陈大元.受精生物学 [M ] .北京:中国科学出版社, 1995.
[ 3] 文国艺.卵巢保存温度对猪体外受精的作用. 广西农学报, 2000
( 1) : 2224

[ 4] 李华威,朱淑文,华修国,等.卵巢运输温度对猪卵母细胞体外受
精和发育的影响.中国兽医学报, 2004, 24( 6) : 617618

[ 5] 库尔班
吐拉克,高橘芳幸,片桐成二,等.卵巢运输保存温度和
时间对野生梅花鹿卵母细胞体外成熟的影响.新疆农业大学学
报, 2008, 31 ( 6) : 6366

[ 6] 刘青春,李武峰,岳文斌,等.不同卵巢运输温度和培养方法对卵
母细胞体外成熟的影响.畜牧兽医杂志, 2008, 27( 4) : 1617

[ 7] M ao JD, Wu GM, Sm ithMF, et al
E ffects of cu lture m ed inm, serum
type, and variou s concen trations of foll icle stim u lat ing horm on e on
porcine preantral fol liclar developm ent and antrum form ation in
vi tro
B iolReprod, 2002, 67: 11971203

[ 8] Ta jik P, E sfandabad i NS
In vitro m atu ration of cap rine oocytes in
differen t cu ltu re m ed ia
Sm all Rum in Res, 2003, 47: 155158

[ 9] Izqu ierdo D, V illam ed iana P, L pezB ejar M et al
E ffect of in v itro
and in v ivo cu lture on em bryo d evelopm ent from p repubertal goat
IVM IVF oocytes
Theriogenology, 2002, 57: 14311441

[ 10] Rho GJ, H ahnel AC, Betteridge K J
Com parison s of oocyte m atu ra
tion t im es and of th ree m ethods of sperm preparat ion for their ef fects
on the produ ct ion of goat em bryos in vi tro
Theriogenology, 2001,
56 : 503516

[ 11] Wns SM
Specificity of ep id erm al grow th factor act ion onm atu ration
of the m urine oocyte and cumu lu s oophorus in v itro
B iol Rep rod,
1989, 41: 371379

[ 12 ] S ingh B, B arb cG J, A rm strong DT
Factors in fluen cing resum pt ion of
186
2010年第 8期  孙新明等:卵巢运输温度及卵母细胞促成熟因子对山羊卵母细胞体外成熟和体外受精的影响
m eiot ic m aturat ion and cumu lu s expans ion of porcine oocytecum u
lus com p lexs in vitro
M olRep rod Dev, 1993, 36: 113119

[ 13 ] Arellano J
Epidermal grow th factor enhances porcine oocytem aturation
in vitro in the ab sence of foll icular f luid or hormones
Theriogenolgy,
1993, 39: 180186

[ 14 ] Lon ergan P, Carolan C, V an Langendonck tA, et al
Role of ep ider
m al grow th factor in bovine oocyte m atu ration and preim p lan tat ion
em bryo d evelopm ent in v itro
B iology of Reproduction, 1996, 54:
14201429.
[ 15 ] Loren zo PL, L iu IK, Carneiro GF, et al
E qu in e oocyte m aturat ion
w ith epiderm al grow th factor
Equ ine Vet J, 2002, 34( 4 ): 37882

[ 16 ] AyoubMA, H un ter AG
Inh ib itory ef fect of bovine follicu lar flu id on
in vitro maturat ion of bovin e oocytes
Journal of Dairy S cien ce,
1993, 76( 1 ): 95100

[ 17] 李红,张红,周洪群
山羊卵母细胞体成熟培养条件的研究

四川畜牧兽医, 2003, 30 ( 8) : 2022

[ 18] M oor RM, Trounson AO. H orm onal and foolicu lar factor affecting
m atu ration of sheep oocytes in v itro and their subsequen t develop
m en ta l cap acity. J Rep rod Fert, 1977, 49 ( 1) : 101109.
187