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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
用于丝状真菌的苯菌灵标记基因 benA表达载体的构建
张雄鹏1，2 农向群2 张泽华2
(1沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110161;2中国农业科学院植物保护研究所，北京 100081)
摘 要: 为了构建适用于丝状真菌遗传转化的表达载体，在质粒 pAN52-1 的高效组成型三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动
子 PgpdA和色氨酸 C基因终止子 TtrpC之间加入内切酶 NotⅠ和 ClaⅠ两个位点，构成质粒 pAN52-2;把质粒 pAN52-2 中从启
动子 PgpdA到终止子 TtrpC的基因片段通过 PstⅠ和 XbaⅠ酶切位点导入到 pUC19 载体上，并且应用 PCR的方法在启动子 Pg-
pdA的前端引入 HindⅢ酶切位点，构成质粒 pUCPT-2;通过 PCR，在苯菌灵抗性基因 benA两端分别加入内切酶 NotⅠ和 ClaⅠ
酶切位点，并克隆到 pGEM-T载体上，得到质粒 pGEM-Ben;用 NotⅠ分别酶切质粒 pUCPT-2 与 pGEM-Ben，连接苯菌灵抗性基
因 benA到 pUCPT-2 上，得到了 pUCPT-Ben载体。经 PCR、酶切和核苷酸序列检测，证实了 PgpdA-benA-TtrpC 表达元件连接
成功，即得到了苯菌灵抗性基因高效表达载体。
关键词: PgpdA启动子 TtrpC终止子 苯菌灵抗性基因 benA 表达载体构建 丝状真菌
Construction of Expression Plasmid of Benomyl Resistance Gene
benA as Selectable Marker for Filamentous Fungi
Zhang Xiongpeng1，2 Nong Xiangqun2 Zhang Zehua2
(1College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161;
2 Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081)
Abstract: The experiment aim to construct expression plasmid for genetic transformation in filamentous fungi based on expression
vector pAN52-1，the restriction sites NotⅠand ClaⅠ were inserted between the promoter of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogen-
ase gene gpdA and terminator of tryptophan C gene trpC. The fragment，from promoter PgpdA to terminator TtrpC，was cut down and
imported in the vector pUC19 at restriction sites PstⅠand XbaⅠ. New restriction site Hind Ⅲ was added to the front-end of promoter
PgpdA by primer design and PCR. The constituted plasmid was named pUCPT-2. Benomyl resistance gene benA was cloned into the
pGEM-T vector after appended restriction site NotⅠand ClaⅠat the both ends and PCR. The constituted plasmid was named pGEM-
Ben. Plasmids pUCPT-2 and pGEM-Ben were disgested by the restriction enzymes NotⅠ，respectively. Then target gene benA was liga-
ted in disgested pUCPT-2 to form last plasmid pUCPT-Ben. It was approved that expression unit PgpdA-benA-TtrpC was constructed
successfully in the plasmid pUCPT-Ben by tests of PCR，restriction cut and nucleotide sequence.
Key words: Promoter PgpdA Terminator TtrpC Benomyl resistance gene benA Expression vector Filamentous fungi
收稿日期:2010-04-26
基金项目:科技部支撑计划(2006BAD08A02) ，农业部“948”项目(2006-G54)
作者简介:张雄鹏，男，硕士研究生，主要研究方向:生物农药;E-mail:zhangxiongpeng@ yahoo. cn
通讯作者:农向群，女，副研究员，主要研究方向:昆虫病原真菌研究与应用;E-mail:xqnong@ sina. com
由于生物农药具有长效、无毒、无残留等特点，
使其在农业病虫害防治中得到广泛的应用。丝状真
菌中的绿僵菌(Metarhizium anisopliae)用于防治蝗
虫、蛴螬、椰心叶甲，球孢白僵菌(Beauveria bassi-
ana)用于防治松毛虫和玉米螟，淡紫拟青霉(Paeci-
lomyces lilacinus)用于防治根结线虫等，均取得了显
著效果［1-8］。然而来源于自然环境中的菌株大多数
受其自身生物学特性的限制，如毒力作用慢、保存时
间短、环境存活率低等，不利于规模化生产和田间
应用，需要对其进行优化改良。基因工程技术是
一种高效定向改良真菌菌株的优良方法，已被应
用于丝状真菌菌株的改良中，如将类枯草杆菌蛋
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
白酶 Pr1、蝎毒基因、蜘蛛毒素基因导入真菌中，使
其毒力作用增强 ［9-11］。目前适用于丝状真菌基因
工程的标记基因并不多，常用的有苯菌灵(beno-
myl)抗性基因 benA 和草丁膦(phosphinothricin)抗
性基因 bar ［12］。来源于粗糙脉孢霉(Neurospora
crass)的苯菌灵抗性基因 benA ［13］常用作真菌遗传
转化的标记基因。在构建基因表达载体时，选择
适宜的启动子是外源基因得以有效表达的重要因
子，例如，在多种植物的基因转化中，烟草花叶病
毒基因的启动子 CaMV35S 都能够有效驱动基因
表达［14］，然而这个启动子用于真菌遗传转化时常
常不能使目的基因得到快速高效表达，甚至难以
得到转化子［15，16］。至今用于丝状真菌基因转化的
启动子屈指可数，例如来源于构巢曲霉(Aspergillus
nidulane)三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子 PgpdA
与色氨酸 C 基因终止子 TtrpC 组合，已在多种丝
状真菌包括昆虫病原真菌白僵菌和绿僵菌的遗
传转化中使用，而且使目的基因获得高效的表
达［16，17］。本试验为了实现丝状真菌，特别是昆虫
病原真菌遗传转化的高效表达，用亲缘关系相近
的启动子 PgpdA 与色氨酸 C 基因终止子 TtrpC，
构建苯菌灵抗性基因 benA 的表达载体。此高效
表达载体的构建为以后昆虫病原真菌的遗传改造
打下良好的基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株及质粒 大肠杆菌 Escherichia coli JM110
菌株，由本实验室保存。质粒 pGPS(含有苯菌灵抗
性基因) ，由中科院上海植物生理研究所王成树研
究员馈赠;质粒 pAN52-1(含有启动子 PgpdA 和终
止子 TtrpC) ，由荷兰营养与食品研究院(TNO Nutri-
tion and Food Research Instritute)Dr. Punt 馈赠;质
粒 pUC19 购于宝生物工程(大连)有限公司;pGEM-
T Easy Vector 购自 Promega公司。
1. 1. 2 主要试剂 保真酶 EX Taq，DNA Marker ，碱
性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，CIAP) ，T4 DNA
Ligase和各种限制性内切酶购于宝生物工程大连有
限公司;质粒提取和回收试剂盒购于爱思进生物技
术有限公司;其它常规化学试剂均为国产分析纯。
物合成和质粒核苷酸测序由上海生工生物工程技术
服务有限公司完成。
1. 2 方法
1. 2. 1 质粒 pAN52-1 的改造 利用软件工具 DNA
MAN分析质粒 pAN52-1 和质粒 pGPS 的酶切位点，
发现在启动子 PgpdA和终止子 TtrpC之间没有适合
于苯菌灵抗性基因插入的位点，因此需要对质粒
图 1 质粒 pAN52-1 的改造流程
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2010 年第 6 期 张雄鹏等:用于丝状真菌的苯菌灵标记基因 benA表达载体的构建
pAN52-1 进行改造，拟在启动子 PgpdA 和终止子
TtrpC之间加入 NotⅠ和 ClaⅠ酶切位点，将此改造
完的质粒命名为 pAN52-2。改造流程如图 1 所示。
首先合成两条互补的寡核苷酸序列(NotⅠF:
5′-GATCCATCGATGCGGCCGCGG-3′，Not Ⅰ R:5′-
GATCCGCGGCCGCATCGATGG-3′) ，其 两 端 都 是
BamHⅠ的粘性末端，中间是 NotⅠ和 ClaⅠ内切酶
位点。提取载体质粒 pAN52-1，用 BamH I单酶切，
电泳回收目的条带。另外，分别取寡核苷酸片段
NotⅠF 和 NotⅠR各 10 μL，终浓度为 100 μmol /L，
混合均匀并离心，于 95℃保温 3 min，慢慢冷却，待
冷却后用试剂盒纯化回收片段，16℃下与酶切后的
质粒 DNA 片段连接，之后热激转化于大肠杆菌
JM110感受态细胞。最后对阳性克隆分别进行 NotⅠ
和 ClaⅠ单酶切鉴定，并且通过核苷酸测序鉴定其连
接方向。
1. 2. 2 质粒 pAN52-2 的进一步改造 由于质粒
pAN52-2 的启动子 PgpdA 的前端没有适合的酶切
位点，对以后的双元载体的构建带来不便，因此拟将
质粒 pAN52-2 中的启动子 PgpdA和终止子 TtrpC片
段导入中间载体 pUC19 中，并且通过 PCR的方法在
其启动子 PgpdA的前端引入 Hind Ⅲ酶切位点。
分步酶切构建质粒 pUCPT-1。分析质粒 pAN52-2
和 pUC19 的酶切位点以后，先用 PvuⅠ对质粒 p52-
1 进行酶切，再用 XbaⅠ和 PstⅠ对质粒 pAN52-2 进
行双酶切，之后连接于双酶切后的 pUC19 载体。
用 PvuⅠ酶切质粒 pAN52-2，回收纯化目的片
段即大片段，再用 XbaⅠ和 PstⅠ双酶切。酶切体系
为:10 × M Buffer 4 μL，pAN52-2-PvuⅠ 5 μL ，Xba
Ⅰ 1 μL ，PstⅠ 1 μL，用水补到 50 μL。酶切 1 h，用
试剂盒回收纯化酶切产物，与用 XbaⅠ和 PstⅠ双酶
切质粒 pUC19 后的回收纯化产物连接。对连接产
物进行蓝白斑筛选，提取质粒作酶切鉴定。
在质粒 pUCPT-1的启动子 PgpdA前端引入Hind
Ⅲ酶切位点，此质粒命名为 pUCPT-2 设计引物 1(5′-
CCAAGCTTAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG-3′)和
引物 2(5′-GCATCGATGGGATCCATGGTGATGT-3′) ，
引物 1 5′端引入 Hind Ⅲ酶切位点。根据两条引物的
特征，做温度梯度 PCR，筛选出最佳退火温度55℃，反
应条件:94℃预变性 5 min ，94℃变性1 min ，55℃退
火 1 min ，72℃延伸 2. 5 min ，30个循环，于 72℃延伸
10 min。对 PCR产物纯化回收，用 Hind Ⅲ和 ClaⅠ直
接双酶切回收产物。反应体系:10 × M Buffer 4 μL，
回收产物 6 μL，Hind Ⅲ 1 μL，ClaⅠ1 μL，最后用水补
到 50 μL。用 HindⅢ和 ClaⅠ双酶切质粒 pUCPT-1，回
收纯化目的片段，与酶切后的 PCR 产物连接。连接
体系:10 × Buffer 2. 5 μL，目的片段 10 μL，载体片段
3 μL，最后用水补到25 μL。对连接产物进行转化，酶
切鉴定。
1. 2. 3 pGEM-Ben 质粒的构建 通过 PCR 从质粒
pGPS3上扩增得到苯菌灵抗性基因 benA，并且连接
到 pGEM-T载体上，构建质粒 pGEM-Ben。设计引物
1 (5′-TTGCGGCCGCGGCCAGCAGTAGACACTTGGAA-
3′)和引物 2(5′-CCATCGATCTCGACAGGGGGCCTTC-
CA-3′) ，在 benA 两端分别引入 NotⅠ和 ClaⅠ酶切
位点。
PCR扩增反应体系:10 × Ex Taq Buffer 5 μL，
dNTP Mixture 4 μL ，模板 DNA 1 μL，引物 1 1 μL，引
物 2 1 μL，Ex Taq 0. 25 μL ，ddH2O 37. 75 μL，总体
积 50 μL。PCR反应条件:94℃ 5 min;94℃ 1 min、
55℃ 1 min、72℃ 3 min，进行 30 次循环;72℃ 10
min。对 PCR产物回收纯化，与 pGEM-T载体连接。
对转化子进行蓝白斑筛选、菌液 PCR、酶切和测序
鉴定，鉴定正确后命名为 pGEM-Ben。
1. 2. 4 苯菌灵抗性基因表达载体 pUCPT-Ben 的构
建 由于 pUCPT-2 载体的 NotⅠ和 ClaⅠ酶切位点是
相邻的，在双酶切时酶切的效果不理想，而质粒
pGEM-Ben在苯菌灵基因的两端都含有 NotⅠ酶切位
点，因此，选用 NotⅠ酶切位点把菌灵基因插入到启动
子 PgpdA和终止子 TtrpC之间，操作流程如图 2。
用 NotⅠ酶切质粒 pUCPT-2，并回收纯化。为
了防止质粒线性化后发生自连，对其进行去磷酸化
处理。体系为纯化产物 20 μL，10 × Buffer 5 μL，
CiAP 2 μL，ddH2O 23 μL，总体积为 50 μL。
用 NotⅠ酶切质粒 pGEM-Ben，回收纯化目的片
段即大片段(5. 5 kb 左右) ，与载体片段连接，连接
的反映体系为:T4 DNA Ligase Buffer 3 μL，目的片段
20 μL，载体片段 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，总体积
为 25 μL。16℃过夜连接，转化后进行菌液 PCR、质
粒酶切鉴定，最后进行测序确证。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
图 2 质粒 pUCPT-Ben的构建流程
2 结果与分析
2. 1 质粒 pAN52-2 的构建
将合成的含 NotⅠ和 ClaⅠ内切酶位点且两
端带有 BamHⅠ酶切位点粘性末端的核苷酸片
段，经双链化后插入到质粒 pAN52-1 的启动子
PgpdA和终止子 TtrpC 中间。对连接质粒分别用
NotⅠ和 ClaⅠ单酶切鉴定，电泳得到一条 5. 7 kb
左右的条带(图 3) ，说明连接成功。对质粒进行
了核苷酸序列检测，结果(图 4)证明插入方向为启
动子 PgpdA-BamHⅠ-ClaⅠ-NotⅠ-BamHⅠ-终止子 Ttr-
pC，即连接方向正确，将此质粒命名为pAN52-2。
2. 2 质粒 pUCPT-2 的构建
把质粒 pAN52-2 中的启动子 PgpdA 和终止子
TtrpC片段导入中间载体 pUC19 中，同时在其启动
子 PgpdA的前端引入 Hind Ⅲ酶切位点。
1. λEcoT-14Ⅰdigest Marker;2. pAN52-2 的 NotⅠ单酶切;
3. pAN52-2 的 ClaⅠ单酶切;4.质粒 pAN52-2
图 3 对质粒 pAN52-2 鉴定
图 4 质粒 pAN52-2 插入位点序列鉴定
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2010 年第 6 期 张雄鹏等:用于丝状真菌的苯菌灵标记基因 benA表达载体的构建
2. 2. 1 质粒 pUCPT-1的构建 先对质粒 pAN52-2进
行 PvuⅠ酶切，再进行 XbaⅠ和 PstⅠ双酶切，得到含
有启动子 PgpdA 和终止子 TtrpC 的目的片段，大小
为 2. 85 kb(图 5，泳道 2)。对 pUC19 进行 XbaⅠ和
PstⅠ双酶切，得到 2. 6 kb 的载体片段(图 5，泳道
4)。分别回收目的片段和载体片段，二者连接。对
阳性克隆进行蓝白斑筛选，用通用引物 M13 进行菌
液 PCR，得到 2. 8 kb的片段(图 5，泳道 8)符合预期
的目的片段大小;再用 XbaⅠ和 PstⅠ双酶切连接的
质粒，得到大小分别为 2. 8 kb 和 2. 6 kb 两片段(图
5，泳道 7) ，符合预期结果，说明连接成功。最后通
过核苷酸序列检测证明目的片段成功连接到载体
pUC19 上，命名该质粒为 pUCPT-1。
1. pAN52-2 质粒;2. pAN52-2 的 XbaⅠ和 PstⅠ的双酶切;
3. pUC19 质粒 ;4. pUC19 的 XbaⅠ和 PstⅠ酶切的双酶切;
5. pUCPT-1 质粒;6. pUCPT-1 质粒的 PstⅠ单酶切鉴定;
7. pUCPT-1的 XbaⅠ和 PstⅠ的双酶切验证;8. pUCPT-1 菌
液 PCR鉴定;9. λEcoT-14Ⅰdigest Marker
图 5 质粒 pUCPT-1 的鉴定
1. λEcoT-14Ⅰdigest Marker;2.启动子 PgpdA片段的 PCR
产物;3.质粒 pUCPT-1;4. pUCPT-1 的 HindⅢ和 ClaⅠ双
酶切;5. 质粒 pUCPT-2;6. 质粒 pUCPT-2 的 HindⅢ和
ClaⅠ双酶切验证;7.质粒 pUCPT-2 的 PCR鉴定
图 6 质粒 pUCPT-2 的鉴定
2. 2. 2 质粒 pUCPT-2 的构建 用前端添加 Hind
Ⅲ酶切位点的引物对启动子 PgpdA进行 PCR扩增，
首先通过温度梯度选择获得最佳退火温度 55℃，用
保真酶 Ex Taq进行扩增反应，得到 2. 2 kb左右的目
的片段(图 6，泳道 2) ;用 Hind Ⅲ和 ClaⅠ双酶切质
粒 pUCPT-1，回收得到 3. 56 kb左右的载体片段(图
6，泳道 4)。
将以上的目的片段和载体片段于 16℃过夜连
接，并转化于大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆，进
行菌液 PCR检测;对扩增产物为 2. 2 kb 左右的菌
液提质粒，用 Hind Ⅲ和 ClaⅠ双酶切鉴定，得到
大小分别为 2. 2 kb 和 3. 56 kb 的条带(图 6，泳道
6) ，与预期相符，说明连接成功。对该质粒的 Pgp-
dA部分进行核苷酸序列检测，将测序结果与原序
列进行比对，结果表明二者 PgpdA 核苷酸序列完
全一致，并且构建的质粒在 PgpdA 前端含有 Hind
Ⅲ酶切位点。
2. 3 质粒 pGEM-Ben的构建
用两端分别添加了 NotⅠ和 ClaⅠ酶切位点的
苯菌灵抗性基因 benA 引物，对质粒 pGPS3 进行扩
增，通过退火温度梯度选择，确定最佳退火温度为
55℃，并扩增得到目的片段。该片段克隆到 pGEM-T
载体后，选择阳性克隆进行菌液 PCR检测，得到 2. 6
kb左右扩增产物(图 7，泳道 6)。对阳性克隆的质
粒用 NotⅠ和 ClaⅠ双酶切，得到大小约 3. 0 kb 和
2. 6 kb的两条带(图 7，泳道 5) ，与预期符合，说明连
接成功。最后对连接的质粒进行核苷酸测序，结果
证明苯菌灵抗性基因 benA 已克隆到 pGEM-T 载体
上，而且两端成功添加了 NotⅠ和 ClaⅠ酶切位点，
命名该质粒为 pGEM-Ben。
2. 4 苯菌灵抗性基因表达载体 pUCPT-Ben的构建
通过 NotⅠ单酶切将质粒 pGEM-Ben 上的苯菌
灵抗性基因 benA连接到质粒 pUCPT-2 上。用 Not
Ⅰ单酶切质粒 pUCPT-2 得到大小为 5. 76 kb 的线
性载体片段(图 8，泳道 5)。用 NotⅠ酶切质粒
pGEM-Ben 后，回收纯化 2. 6 kb 左右的苯菌灵抗
性基因 benA目的片段(图 8，泳道 3)。将目的片
段与载体片连接并转化于大肠杆菌，挑选阳性克
隆进行菌液 PCR检测，得到预期的 2. 6 kb 左右的
条带(图 8，泳道 9)。提取质粒后用 NotⅠ酶切鉴
定，得到两条大小分别为 2. 6 kb 和 5. 7 kb 左右的
条带 (图 8，泳道 7) ，与预期相符。另用 ClaⅠ单
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
酶切连接质粒，得到一条 8. 3 kb 左右的条带(图
8，泳道 8) ，说明已经连接成功，并且方向正确，即
连接方向为 PgpdA-BamHⅠ-ClaⅠ-NotⅠ-ClaⅠ-
benA -NotⅠ-BamHⅠ-TtrpC。对该质粒的苯菌灵
抗性基因 benA 两端分别进行核苷酸序列测定，结
果证明构建各单元的顺序及位点与预期的一致，
即得到了预期的表达载体。
1. λEcoT-14Ⅰdigest Marker;2.质粒 pGPS3 扩增的 benA
基因片段;3. pGEM-T Vector;4.质粒 pGEM-Ben;5.质粒
pGEM-Ben的 NotⅠ和 ClaⅠ双酶切鉴定;6. pGEM-Ben
的 PCR检测
图 7 质粒 pGEM-Ben的鉴定
1. λEcoT-14Ⅰdigest Marker;2.质粒 pGEM-Ben;3. benA的
回收;4.质粒 pUCPT-2;5.质粒 pUCPT-2 的 NotⅠ酶切回
收;6.质粒 pUCPT-Ben;7. 质粒 pUCPT-Ben 的 NotⅠ酶
切鉴定;8. 质粒 pUCPT-Ben 的 ClaⅠ酶切鉴定;9. 质粒
pUCPT-Ben的 benA的 PCR检测
图 8 质粒 pUCPT-Ben质粒的鉴定
3 讨论
构建高效稳定的表达载体是丝状真菌遗传
转化的基础和关键。在遗传转化中，有效的标记
基因可快速的选取阳性克隆，减少筛选转化子的
盲目性和工作量。潮霉素(Hygromycing)抗性基
因在丝状真菌遗传转化中广泛应用［18］，但大多数昆
虫病原真菌对其不敏感，在使用上受到限制。目前昆
虫病原真菌遗传转化研究中用到的选择标记有营养
缺陷性互补标记和抗性显性标记两类，前者只有
niaD基因，已用于金龟子绿僵菌(Metarhizium aniso-
pliae)和球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的营养突
变体遗传转化［19］，后者有苯菌灵抗性基因 benA 和
除草剂抗性基因 bar ［20］。苯菌灵抗性基因 benA 已
经在金龟子绿僵菌 ［21-25］、玫烟色拟青霉(Paecilomy-
ces fumosoroseus)和淡紫拟青霉 ［26］的遗传转化中应
用;bar标记基因也应用于球孢白僵菌和玫烟色拟
青霉的遗传转化［27］。本试验之前，笔者也试图采用
抗草丁膦抗性基因 bar，但在用草丁膦对 60 多株白
僵菌和绿僵菌进行筛选试验后发现，在选择浓度高
达 1 200 μg /mL时，仍然没有筛选出敏感菌株，而苯
菌灵在 5 － 10 μg /mL 时就能有效抑制各个菌株的
生长，是昆虫病原真菌的敏感标记，因此可选用苯菌
灵抗性基因 benA作为昆虫病原真菌白僵菌和绿僵
菌遗传转化的标记基因。
启动子是影响外源基因在受体基因组中获得
表达活性的最重要因素之一，在构建表达载体时，
选用与受体同源性相同或相近的物种启动子有利
于外源基因的有效表达［28］。构建丝状真菌抗性基
因表达载体时，使用烟草花叶病毒基因启动子
CaMV35S，这会影响到抗性基因的快速高效的表
达［29］，目前已有几种来源于真菌的启动子用于真
菌遗传转化的载体构建，如启动子 PgpdA、PtrpC
等［16，17，29］。Godio等(2004)在对担子菌粟蕈(Hy-
pholoma sublateritium)进行基因转化时发现，来源
于子囊菌的启动子不能有效驱动担子菌的表达，
说明同源启动的重要性。本试验选用的能在丝状
真菌中高效表达的外源基因启动子构巢曲霉(As-
pergillus nidulane)三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动
子 PgpdA和色氨酸 C 基因终止子 TtrpC，在多种丝
状真菌中均能高效表达的外源基因，是促进高效
表达的强启动子［16，17］。
在构建表达载体时常常遇到原载体上没有合
适的酶切位点，需要增加适宜的酶切位点。这时
可以选择合成含有新酶切位点的核苷酸片段的方
法。在设计酶切位点时，首先要分析新合成的酶
切位点是否存在于目的片段和载体片段中，其次
842
2010 年第 6 期 张雄鹏等:用于丝状真菌的苯菌灵标记基因 benA表达载体的构建
得考虑合成的酶切位点的酶切效率、酶切温度和
酶的价格等因素。合成酶切位点时最好在将要用
到的两个酶切位点之间加入多个核苷酸，以防止
双酶切时由于两个酶切位点相距太近可能影响
到酶切效率。本试验最初设计的 NotⅠ和 ClaⅠ
两个酶切位点由于相邻而造成双酶切困难，只得
选择 NotⅠ单酶切连接，增加了筛选连接方向的
步骤。
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2005.
(上接第 230 页)
酶最佳的液体发酵的最佳条件为麸皮 4%，葡萄糖
0 1%，(NH4)2SO4 2 0%，吐温-800 1%，KH2 PO4
0 2%，MgSO4·7H2 O 0 05%，培养基初始 pH5，
250 mL 三角瓶的装液量为 50 mL。在 30℃，摇瓶
转速220 r /min的条件下，培养 72 h 木聚糖酶活力达
139 IU /mL。对生物、食品等行业的发展具有积极的
指导意义，同时为人类解决粮食、能源、资源等危机
提供重要途径。
参 考 文 献
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11-3.
·科学出版社新书·
事件相关电位原理与技术
魏景汉 等编著
978-7-03-027152-5 ￥ 48. 00 2010 年 4 月出版
内容简介:本书内容主要包括事件相关电位(ERP)的发展与基础，数据记录
与提取的基本技术原理与方法，主要 ERP 成分与实验范式、刺激方法，ERP 的数
据测量和统计分析方法。本书的论述深入浅出，兼顾基本原理的系统性和内容的
实用性。
本书既是初学 ERP 的入门教材，又是深入研究 ERP 的高级参考书，可供心理
学、生理学、医学、认知科学、神经科学及其他生命科学有关专业的科研人员、教
师、工作人员、博士研究生、硕士研究生、本科生学习和参考。
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