全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-30
基金项目:新疆农科院青年基金(2005Q02)
作者简介:刘文玉(1979-),女(汉族),甘肃临洮人,在读硕士,从事生物技术与酶工程研究,E-mail:liuwenyu20052004@126.com
通讯作者:娄恺(1968-)男,新疆人,研究员,博士,从事代谢工程与基因工程工作,(Tel)0991-4521590,E-mail:loukai02@mail.tsinghua.edu.cn
β-半乳糖苷酶(β-D-Galactosidase),俗称乳糖酶(Lactase),可来源于动物、植物和微生物。乳糖在牛乳
中的含量为 4.5%~5.0%[1],是其中最主要的碳水化合物,但是乳糖不能被人体直接吸收,需经体内乳糖酶
将其水解为葡萄糖和半乳糖才能够被机体利用,有些人群体内乳糖酶缺乏(Lactasedeficiency),摄入牛乳或
乳制品后,会发生腹胀,腹鸣甚至腹泻的症状,这种由乳糖吸收不良引起的症状称为乳糖不耐症[2](Lactose
intolerance)。我国乳糖不耐症发生率为 90%左右,而且随着人的年龄增长,体内乳糖酶分泌能力下降,其发
生率有所提高 [3]。目前,解决乳糖不耐症的最佳方法是用乳糖酶水解乳糖来生产低乳糖或者无乳糖乳制
品,而现在商业乳糖酶是中温性乳糖酶,酶的最适反应温度是 37℃左右或者更高,在低温下酶的催化效率
降低或者没有活性,但是对于乳品加工业,许多长时间的操作工艺以及贮存和运输都是在低温(4℃以下)
下进行,而低温 β-半乳糖苷酶在低温下具有高活性,有着中温和高温乳糖酶无法达到的优越性。
国外对微生物产低温乳糖酶已有研究[4~9],国内这方面的报道较少,使用亚硝基胍(NTG)诱变处理产低
温乳糖酶野生菌水生拉恩菌(Rahnelaaquatilis)14-1,经过筛选得到高产突变菌株。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
亚硝基胍诱变选育低温β-半乳糖苷酶高产菌
刘文玉 1,2 史应武 2 王杏芹 2,3 娄恺 2
(1石河子大学食品学院,石河子 832003;2新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐 830091;
3新疆农业大学食品科学学院,乌鲁木齐 830052)
摘 要: 以野生低温β-半乳糖苷酶产生菌水生拉恩菌(Rahnelaaquatilis)14-1为出发菌株,通过亚硝基胍(NTG)
诱变及低温驯化,采用选择性平板初筛和摇瓶复筛,筛选出一株产酶活力比原始菌株提高54%的突变株,该突变株经传5
代培养,产酶特性稳定。
关键词: 水生拉恩菌 低温β-半乳糖苷酶 诱变选育 亚硝基胍
ScreeningofHigh-producingCold-adaptedβ-D-Galactosidase
StrainbyNTGMutagenesis
LiuWenyu1,2 ShiYingwu2 WangXingqin2,3 LouKai2
(1ColgeofFood,ShiheziUniversity,Shihezi832003;2InstituteofMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,
Urumqi830091;3ColgeofFoodScience,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052)
Abstract: AwidestrainRahnelaaquatilis14-1whichcanbeabletoproducecold-adaptedβ-D-Galactosidase,is
mutatedwithnitrosoguanidineatlowtemperature,byusingselectivityplateinitialscreeningandfermentationexperiments
inshakeflask.Onestrainwasobtainedwithhigh-yieldofcold-adaptedβ-D-Galactosidase,adntheenzymeproductivity
ofwhichhasincreasedby54%.Characteristicsofenzymesproductioninmutatedstrainwaskeptstableby5times
subculture.
Keywords: Rahnelaaquatilis Cold-adaptedβ-D-Galactosidase MutagenesisNitrosoguanidine
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
以新疆农科院微生物应用研究所筛选并保藏的水生拉恩菌 14-1为出发菌株。
1.2 主要生化试剂及仪器
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal);亚硝基胍(NTG)邻硝基酚 β-D半乳糖苷(ONPG)为 Sigma公
司产品;胰蛋白胨;大豆蛋白胨,磷酸氢二钾;氯化钠;乳糖;酵母膏;UV-2550紫外可见分光光度计(日本,
SHIMADZU公司)。
1.3 初筛培养基和方法
1.3.1 平板初筛培养基 胰蛋白胨 15g,蛋白胨 5g,K2HPO42.5g,酵母浸膏 1g,NaCl5g,琼脂 15g,X-gal
0.1g,蒸馏水 1000ml,pH7.0～7.2。
1.3.2 初筛方法 将出发菌制成一定浓度的菌悬液,准确吸取 1ml菌悬液,加入已灭菌的装有玻璃珠和
9ml磷酸缓冲液的小三角瓶中,再加入 NTG,使 NTG的终浓度为 0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、
0.5mg/ml、0.6mg/ml,置于旋转式摇床,转速 100r/min,20℃处理 60min,将处理液 5500r/min离心 10min,弃
去上清,用 pH6.5,0.1M的无菌磷酸缓冲液洗涤菌体 2~3次,以终止反应。吸取 0.5m1菌悬液用无菌生理盐
水稀释至 10-3,10-4,10-5,取 100μl涂布均匀于初筛平板,15℃恒温培养。以不加 NTG为对照组。培养数天
后,平板计数法计算各浓度 NTG处理的存活率和致死率,致死率高于 98%的 NTG浓度作为以后诱变的剂
量。存活率(%)=诱变后的菌数/诱变前的菌数×100%,致死率(%)=1-存活率。挑选出平板上蓝色较深、较大
的菌落,每个菌落接两个平板,分别于 15℃和 37℃恒温培养。将在 15℃生长良好而 37℃不生长的菌落转接
到斜面培养基,作为复筛菌株进行复筛。
1.4 复筛培养基和方法
1.4.1 复筛培养基 乳糖 1%,胰蛋白胨 15g,豆蛋白胨 5g,K2HPO42.5g,酵母浸膏 3g,NaCl5g,蒸馏水
1000ml,pH7.0～7.2。
1.4.2 复筛方法 将初筛得到的菌株接种于摇瓶复筛培养基,200r/min转速,20℃旋转式摇床培养 48h。然
后进行酶活测定。以出发菌株作对照,挑出酶活力高于出发菌株的突变株。
1.5 酶活力测定方法
将 pH6.5的磷酸缓冲液 500μl和 0.25%的 ONPG200μl加入比色管,在 25℃的温度下温浴 5min,加入
适当稀释的粗酶液 0.5ml,反应 10min,加入 800μl5%Na2CO3终止反应,蒸馏水定容至 10ml,用分光光度计
420nm测定 OD值,通过标准曲线方程计算酶活。
在上述条件下 1ml粗酶液 1min催化水解 ONPG生成 1μmol邻硝基苯酚(ONP)的量,定义为 1U。
2 结果与讨论
2.1 NTG诱变的致死效应
NTG是烷化剂类诱变剂,在合适的条件下,死亡率低而诱变突变率高,它对每一细胞具有诱发一次至
多次突变的效力,有超级诱变剂之称。用
平板计数法得到经过不同浓度 NTG处理
和对照的平板菌落数。当 NTG浓度大于
0.3mg/ml时,致死率超过了 98%,当 NTG
浓度达到 0.6mg/ml时,致死率为 100%
(表 1),所以选择 0.3mg/ml,0.4mg/ml和 0.5mg/ml的 NTG浓度为本实验的诱变剂量。
2.2 诱变菌株的初筛及复筛
从初筛平板上共挑取 131株蓝色较深并且 37℃不生长的菌落进行摇瓶复筛,与出发菌株相比,有 16
株菌的酶活高于出发菌株(表 2),其中 14-11,14-12,14-14,14-15,14-19,14-110等 6株产酶活力较高,分
别比出发菌株产酶活力提高了 32%,24%,54%,27%,26%和 34%。
表 1 不同浓度 NTG的致死效应
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2.3 突变株产酶的稳定性实验
将得到产酶能力高的上述 6株菌连续斜面传代
5代,接种摇瓶发酵,每株 3瓶,酶活测定结果表明这
6株菌在传代中稳定(表 3)。
尽管获得了产酶稳定性较好的突变株,但酶活
较出发菌株提高还不是很高。由于菌种的诱变选育
随机性很强,诱变后正、负突变均同时存在,所以要
获得酶活提高很大的突变株,需要进行大量耐心、细
致的诱变筛选工作,同时还可以考虑采用多种诱变
方法相结合,比如离子注入和基因转化法等,可望获
得产酶性能更强的菌株。
3 结论
以野生低温乳糖酶产生菌水生拉恩菌(Rahnela
aquatilis)14-1为出发菌株,通过亚硝基胍 (NTG)诱
变,采用选择性平板共初筛到 131株突变株。对 131
株初筛菌进行摇瓶复筛,筛选出 16株酶活高于出发
菌株的突变株,其中 6株产酶活力较高。对 6株产酶
活力较高的菌株连续 5代传代,每代产酶都基本稳
定。
参考 文献
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9 CokerJACoker.Extremophiles,2006,10:515~524.
表 2 诱变株复筛发酵试验
表 3 突变株的传代发酵实验
刘文玉等:亚硝基胍诱变选育低温β-半乳糖苷酶高产菌 187