全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
稀有海洋放线菌 Salinispora arenicola非核糖体肽合成酶和
卤代酶生物合成基因簇核心区的克隆及序列分析
马艳玲 邓海 魏菁菁 郭秀红 刘中来 邓灵福
刘艳丽 郭建军 姚汉超 熊国梅 祁超
(华中师范大学生命科学学院 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室,武汉 430079 )
摘 要: 克隆稀有海洋放线菌 Salinisp ora arenico la的非核糖体肽合成酶 ( NRPS)和卤代酶生物合成基因簇核心区基因
片段。根据已发表的放线菌 NRPS和卤代酶生物合成基因簇核心区的核苷酸序列保守区设计两对简并性引物, 采用 PCR的
方法扩增 NRPS和卤代酶生物合成基因簇核心区基因片段, 使用分子生物学软件进行序列分析。获得两段大小分别为 662 bp
和 557 bp的基因片段,编码 220个和 185个氨基酸。这两段序列与海洋放线菌 Salinisp ora arenicola CNS205的 NRPS和卤代
酶生物合成基因簇核心区基因核苷酸序列的同源性分别为 99%和 98%。成功地获得了稀有海洋放线菌 Salinispora arenicola
的 NRPS和卤代酶生物合成基因簇核心区基因片段, 该基因片段的获取将为分离全长基因簇以及研究该基因簇在生物合成中
的功能奠定基础。
关键词: Salinisp ora aren icola 腺苷酰化结构域 色氨酸卤代酶 系统进化
Cloning and SequencesAnalysis of Core Regions ofNRPS andHalogenase
Gene Cluster from RareM arine Actinomycete Salinispora arenicola
M aYanling DengH a i W e i J ingjing Guo X iuhong L iu Zhong lai Deng L ingfu
L iu Yanli Guo J ianjun YaoH anchao X iongGuom ei Q iChao
(H ubeiK ey Laboratory of Genetic Regulation and Integrative B iology, Co llege of Lif e Sciences,H uazhong N ormal University, W uhan 430079)
Abstrac:t To obta in the fragm ents re lated to NRPS and H a logenase gene c luster, degene rate pr im ers we re designed based on the
conserved sequences of NRPS and halide gene c luste r from otherm icrobes. The NRPS and H alogenase gene fragm en tw as ob tained by
PCR, and m o lecular b io log ica l so ftwa res w ere used to ana ly ze hom o log ies. TheNRPS and H a logenase gene c luster fragm ent con tains 662
bp and 557 bp nucleo tide ac ids, encod ing 220 and 185 am ino acids, respective ly. H om o logy com par isons w ith NRPS and H a logenase
gene sequences from Salinisp ora arenicola CNS205 are 99% and 98% , respectively. The 662 bp and 557 bp fragm en ts related toNRPS
and H alogenase gene cluster are ob tained. Itw ill he lp to iso late fu ll leng ths re la ted toNRPS and H a logenase gene c luste r and study the ir
possible role dur ing b iosynthesis further.
Key words: Salinisp ora arenicola Adeny la tion dom a in T ryptophan ha logenase Phy logenetic
收稿日期: 20100906
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 20772040) ,湖北省自然基金资助项目 ( 2009CDB234) , 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室开放
项目 ( 200904)
作者简介:马艳玲,女,硕士研究生,研究方向:海洋放线菌; Em ai:l m ayanl ing100@ 163. com
通讯作者:祁超,男,教授,博士生导师,研究方向:蛋白组学与药物筛选; Em ai:l q ichao@ m ai.l ccnu. edu. cn
刘艳丽,女,讲师,主要从事细胞膜水通道、氯离子通道的结构与功能方面的研究; Em ai:l yan liliu@ m ai.l ccnu. edu. cn
放线菌是生物活性物质、尤其是天然药物的重
要来源 [ 1]。面对日益严重的病原微生物耐药性,以
及天然药物筛选过程中大量的重复发现, 如何采用
新技术、新资源、新模型筛选发现新的活性次生代谢
产物,已成为天然药物开发中亟待研究的重要课
题 [ 2]。而海洋放线菌因其在海洋特殊环境 (高盐、
高压、低温、低氧、低光照和寡营养 )的选择压力下
可能调整其次级代谢过程, 从而产生并积累具有特
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殊化学结构和生物活性的功能物质 [ 3 ]。
有学者曾认为海洋环境分离到的放线菌也存在
于陆地环境中或来源于陆地,因此海洋放线菌的次
生代谢产物的新颖性受到怀疑 [ 4]。 2006年发现的
盐孢菌属 ( Salinispora )是第一个海洋专一性的放线
菌属 [ 5] , 对海洋放线菌的研究具有里程碑式的意
义。近年来,从海洋放线菌中陆续发现的 Sa linospo
ram ide A等一系列新的活性化合物也证明海洋是一
个具有潜力的资源宝库 [ 6- 8]。
海洋放线菌能通过非核糖体途径合成一系列低
分子量的具有药用价值的多肽类次生代谢产物。这
些多肽类物质结构复杂、种类繁多,统称为非核糖体
肽 ( nonribosoma l peptides, NRPs)。放线菌的大部
分次生代谢产物是通过聚酮合酶 ( polyketide syn
thase, PKS )和非核糖体肽合成酶 ( nonr ibosomal
pept ide synthetase, NRPS )途径形成主要结构模块;
而活性产物更重要的一个特性 结构多样性,则
是由一类称为后修饰酶的蛋白决定的 [ 9] , 其中包括
卤代酶。
近年来,基于结构相似的次生代谢产物的合
成基因簇也有一定程度相似性的假设, 基因筛选
成为寻找新化合物的重要手段之一 [ 10]。通过将特
定基因作为筛选标记, 可以在基因水平上评估相
应菌株的活性物质产生能力, 从而筛选到在初始
条件下菌株低表达或不表达的活性物质; 另一方
面, 通过对基因筛选所获得的次生代谢产物合成
相关基因 (簇 )进行生物信息学分析, 可以初步预
测产物结构, 在一定程度上避免化合物的重复发
现。而这一切的基础都是次生代谢产物合成相关
基因 (簇 )的克隆。
鉴于此, 本研究以稀有海洋放线菌 Salinispora
arenicola为试验材料, 通过 PCR的方法克隆 NRPS
和卤代酶基因片段, 并以此为探针筛选本实验室已
构建好的 Salinispora arenico la基因组文库, 克隆该
菌株完整的 NRPS和卤代酶生物合成基因簇,从而
为该基因簇的功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试验材料 稀有海洋放线菌 Salinispora
arenicola、大肠杆菌 E. co li DH5系本实验室保存,
克隆载体 pMD18T购自 TaKaRa公司。通过对已发
表的放线菌 NRPS和卤代酶生物合成基因簇核心区
(腺苷酰化结构域和色氨酸卤代酶 )的保守区核苷
酸序列分别设计一对简并引物 P1、P2、P3、P4, 用于
扩增稀有海洋放线菌 Salin isp ora arenicola的腺苷酰
化结构域和色氨酸卤代酶基因片段, 推测目的片段
的长度分别为 700 bp和 550 bp。引物由上海生工
合成,序列如下:
P1: 5GCSTACSYSATSTACACSTCSGG3;
P2: 5SASGTCVCCSGTSCGGTAS3。
P3: 5TTCCCSCGSTACCASATTCGGSGAG3;
P4: 5GSGGGATSWMCCAGWACCASCC3。
1. 1. 2 主要试剂 DNA胶回收试剂盒、PCR产物
克隆试剂盒, DNA m arker均购自 TaK aRa公司,其他
生化试剂均为进口或国产分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 总 DNA的提取 取 200 mL菌液接种在
20mL的海洋放线菌普遍培养基中, 加入 10 g左右
的灭菌的玻璃珠, 30 , 220 r /m in摇床培养 5- 6 d;
12 000 r/m in离心 10m in收集菌丝体。取约 100 mL
菌丝体,加入 1 mL TE( pH8. 0)缓冲液洗涤菌丝体,
12 000 r/m in离心 1m in,去掉上清。加入 500 L溶
菌酶, 37 水浴 1 h。加入 10 mL蛋白酶 K, 55 水
浴 1 h。加入 500 L 2%的 SDS, 将溶液分装到 4
管, 各管添加 TE至 1mL。每管加入 200 L中性苯
酚氯仿异戊醇 ( 25241) ,充分混匀, 直至溶液变
为乳白色, 12 000 r /m in离心 5 m in,小心吸取上清,
加入 200 L氯仿, 充分混匀, 12 000 r/m in离心 5
m in,小心吸取上清加到灭菌的玻璃管中,加入 0. 1倍
体积的 N aC l( 5mo l/L )和等体积的异丙醇,颠倒混匀,
直至出现白色絮状物, 用枪头将挑出的絮状物在
70%乙醇中浸泡 5 m in, 空气中自然风干, 在 500 L
TE缓冲液中 4 过夜溶解, - 20 保存备用。
1. 2. 2 PCR扩增 腺苷酰化结构域基因 PCR扩增
反应体系: 10 PCR Buffer 2. 5 L, 2 mmo l /L dNTP
2 L, 10 mo l/L P1 1 L, 10 mo l/L P2 1 L, Taq
DNA聚合酶 ( 5 U /L) 1 L, 总 DNA 2 L, 加水至
25 L。反应程序: 94 预变性 10 m in; 94 变性 30
s, 55 退火 30 s, 72 延伸 1 m in, 30个循环; 最后
72 延伸 10 m in。
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2011年第 2期 马艳玲等:稀有海洋放线菌 Salinispora arenicola非核糖体肽合成酶和卤代酶生物合成基因簇核心区的克隆及序列分析
色氨酸卤代酶基因 PCR扩增反应体系: 10 PCR
Buffer 2. 5 L, 2mmo l/L dNTP 2 L, 10 mol/L P3 1
L, 10 mo l/L P4 1 L, Taq DNA聚合酶 ( 5 U /L) 2
L,总 DNA 2 L,加水至 25 L。反应程序: 94 预变
性 10 m in; 94 变性 30 s, 55 退火 30 s, 72 延伸
1m in, 30个循环;最后 72 延伸 10m in。
PCR扩增产物用 1%琼脂糖凝胶检测, 目的片
段的回收和纯化按照 TaK aRa凝胶回收试剂盒操作
说明进行。
1. 2. 3 阳性克隆的筛选与鉴定 回收的 PCR产
物连接到 pMD18T载体, 转化感受态大肠杆菌, 用
含有 50 g /mL氨苄青霉素的 LB固体培养基进行
蓝白斑筛选, 阳性克隆经H in d III和 E coR I双酶切
鉴定确认后, 选择正确重组质粒送至上海生工
测序。
1. 2. 4 序列的生物信息学分析 序列的比较、翻译
等在 DNAMAN生物软件上进行, BLAST搜索在 NC
B I网站上进行,系统树的构建在 MEGA4. 0生物软
件上进行。
2 结果与分析
2. 1 总 DNA的提取及检测
以稀有海洋放线菌 Salinispora arenicola为材料提
取总 DNA, DNA纯度分析结果显示, OD260 /OD280 =
198, A260 /A230 = 2. 16,表明提取的 DNA纯度较高,没有
被蛋白质和其他杂质污染。
2. 2 PCR扩增
以总 DNA为模板, 用腺苷酰化结构域和色氨
酸卤代酶基因的简并性引物 P1、P2、P3、P4(见材
料与方法 )进行 PCR扩增 (图 1)。扩增产物经凝
胶电泳检测发现分别在约 700 bp和 550 bp处有
一条亮带, 与目的片段的大小一致,推测可能是腺
苷酰化结构域和色氨酸卤代酶基因片段, 有待进
一步鉴定。
2. 3 阳性克隆的鉴定
将回收纯化的目的片段连接到 pMD18T克隆
载体上,转化 E. coli DH5。从转化的平板上随机挑
取 10个阳性克隆进行H in d III和 E coR I双酶切鉴
定 (图 2), 与 PCR结果一致, 表明这些克隆可能为
阳性克隆,通过测序进一步验证。
图 1 腺苷酸化结构域 (A)及色氨酸卤代酶 ( B)
基因片段 PCR产物凝胶电泳图
图 2 腺苷酰化结构域 (A)及色氨酸卤代酶 ( B)
基因阳性克隆的双酶切鉴定
2. 4 测序结果及序列分析
将重组 pMD 18T 质粒进行测序, 得到一段长
度为 662 bp的序列,编码 220个氨基酸和一段长度
为 558 bp的序列,编码 186个氨基酸 (图 3)。B last
比较结果显示,这两段序列与海洋放线菌 Salinisp o
ra arenicola CNS205的腺苷酰化结构域和色氨酸卤
代酶基因核苷酸序列的同源性分别为 99%和 98%,
表明所克隆到的这两个片段为腺苷酰化结构域和色
氨酸卤代酶基因片段。
2. 5 系统树构建
采用 MEGA 4生物信息学分析软件, 对其他已
报道的含有腺苷酰化结构域基因的细菌的相应氨基
酸序列进行分子系统进化分析 (图 4) ,结果可以分
为 3大簇:在进化水平上分支杆菌属 (Mycobacterium
sp. KM S )和放线菌属 ( S tackebrandtia nassauensis
DSM 44728)为一簇, 嗜酸杆菌属 (A cidovorax avenae
subsp. )和甲基杆菌属 (M ethylobacterium ex torquens
PA 1)为一簇, 以 Salinispora arenicola为代表的属于
第 3簇。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
图 3 腺苷酰化结构域 ( A)及色氨酸卤代酶 ( B )基因片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
采用 MEGA4生物信息学分析软件,对其他已报
道的含有色氨酸卤代酶基因的细菌的相应氨基酸序
列进行分子系统进化分析 (图 5), 结果可以分为两大
簇:在进化水平上以分支杆菌属 (Mycobacterium mari
num M )和茎菌属 (Caulobacter sp. K31)为代表的为第
一簇,以 Salinispora arenicola为代表的属于第 2簇。
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2011年第 2期 马艳玲等:稀有海洋放线菌 Salinispora arenicola非核糖体肽合成酶和卤代酶生物合成基因簇核心区的克隆及序列分析
图 4 腺苷酰化结构域基因的进化树
图 5 色氨酸卤代酶基因的进化树
3 讨论
3. 1 非核糖体肽合成酶的组织结构和功能
NRPS是目前所发现的最大的酶系,由多个模块
(module)按特定的空间顺序排列而成,一个典型的模
块由腺苷酰化 ( adenylat ion, A)结构域、肽酰载体蛋白
( peptidy l carrier protein, PCP)结构域和缩合 ( conden
sation, C )结构域 3个核心结构域组成 [ 11]。大多数
NRPS的模块数为 3- 15个, 最高可达 50个,模块的
数量、种类和排列顺序决定了其最终的产物。
NRPs具有多种对微生物生存、生长繁殖等所必
需的生理功能,概括起来主要有以下几方面: ( 1)抗
生素 ( antib io tics), 抑制他种竞争者生长,这是微生
物界普 遍存 在的现 象 [ 11 ] ; ( 2 ) 铁 载体 ( sid
erophores), 细菌、蓝细菌、真菌等在铁元素成为限制
性生长因子时,作为铁离子强敖合剂的铁载体被大
量诱导产生,而从环境或 (特别是 )宿主的铁结合蛋
白中获得充足的铁离子 [ 12] ; ( 3)毒素 ( tox ins), 作为
选择性侵染特异宿主的毒力因子; ( 4)含氮物质的
储存场所, 如某些蓝细菌肽 ( cyanophycin) [ 13 ] ; ( 5)
作为调节生长、繁殖和分化的信号分子等 [ 11]。
因其独特多样的生物活性,大量的 NRPs已经得
到广泛应用或正处于研发中。应用最多的是多肽类
抗生素, 如杆菌肽 ( bacitracin)、万古霉素 ( vancomy
cin)、短杆菌肽 S( gram icidin S )、Daptomycin等, 尤其
是 Daptomycin(商品名: Cubicin)在临床上具有高效的
抗多种已产生抗生素抗性的革兰氏阳性病原菌 (如
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S taphy lococcus aureus, S trep tococcus pneumoniae等 )的
能力 [ 14]。此外, NRPs可作为免疫抑制剂药物 ( immu
nosuppresants) ,如环孢霉素 ( cyclosporine) [ 15 ]; 抗真菌
药物, 如 fengycin[ 13] ; 生物表面活性剂 ( biosurfacta
nts), 如 surfactin A[ 14] ; 以 及抗癌 药物 ( antitu
mourals)、细胞生长抑制剂 ( cy tostatic agents)和抗病
毒 ( antiv iral compounds)药物等 [ 15]。
3. 2 卤代酶的组织结构和功能
目前,卤代酶主要分为两大类型:卤代过氧化物
酶 ( ha loperox idases)和黄素依赖型卤代酶 ( f lavinde
pendent halogenases),另外还有非血红素 FeII /酮戊
二酸盐依赖型卤代酶 ( nonheme FeII /aketog lutarate
( aKG ) dependent halogenases )、甲基卤代转移酶
(methy l halide transferases)和氟化酶 ( fluorinases)等。
黄素依赖型卤代酶包括两个相关基因 prnA和
prnC,它们分别编码两个对应的卤代酶, 其中 PrnA
为色氨酸 7卤代酶 ( T rp7ha logenase), 负责催化色
氨酸的碳 7位发生区域选择性的氯化作用; PrnC为
单去氯氨基硝吡咯菌素卤代酶 (monodechloroam in
opyrrolnitrin ha logenases)。另一种黄素还原酶 ( fla
vin ox idoreductase )蛋白也是必需的, 黄素作为
NADH和 O2的电子载体, 可以催化产生卤代反应实
际需要的 FADH2,因此该类酶也被称为 FADH 2依赖
性卤代酶 ( FADH 2dependent halogenases)。
目前,越来越多的研究表明,在许多抗生素的生
物合成基因簇中存在 FADH 2依赖型的卤代酶, 这些
抗生素包括 chloroeremomyc in、balhimyc in、7氯四环
素、藤黄绿脓菌素 ( pyo luteo rin )、pentachloropseud i
lin、rebeccamycin、th ienodolin等, 提示 FADH 2依赖型
卤代酶是生物卤化的主要机制 [ 16 ]。
本研究以稀有海洋放线菌 Salinispora arenicola
为试验材料, 通过 PCR的方法成功克隆了 NRPS和
卤代酶基因片段,并将以此为探针筛选本实验室已
构建好的 Salinispora arenico la基因组文库, 克隆该
菌株完整的 NRPS和卤代酶生物合成基因簇,将为
进一步研究该基因簇的功能奠定基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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