全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
稳定表达 HLA-A33 蛋白细胞系的建立
王健1，2 邹宁1 潘煦文2 刘思当1
(1山东农业大学，泰安 271018;2中国科学院微生物研究所，北京 100101)
摘 要: 旨在构建能稳定表达 HLA-A33 蛋白的细胞系，并观察其在细胞中的表达水平。首先克隆取得 HLA-A33 基因，
并将其插入慢病毒载体，经酶切和测序鉴定，确定载体构建正确。通过慢病毒系统感染正常 RD 细胞，将 HLA-A33 基因整合
进 RD细胞的基因组。提取构建细胞系的基因组做 PCR 鉴定，并通过免疫荧光和蛋白免疫印迹法检测，结果显示，HLA-A33
基因成功整合入 RD细胞基因组中，且在重组细胞系中成功表达。该细胞系可为 A33 等位基因与 HBV感染后的慢性化以及
EV71 感染的相关研究提供试验参考。
关键词: RD细胞 HLA-A33 细胞系 稳定表达
Establishment of a Cell Line with Stable Expression of HLA-A33 Protein
Wang Jian1，2 Zou Ning1 Pan Xuwen2 Liu Sidang1
(1Shandong Agricultural University，Tai’an 271018;2 Institute of Microbiology，Chinese Academy of Science，Beijing 100101)
Abstract: The research was to construct a cell line stably expressing the HLA-A33 protein in rhabdomyosarcoma cells (RD
cell)． We first obtain the HLA-A33 gene through common cloning methods and insert the gene into Lentiviral vector． The construct of
the vector was further conformed by restrictional enzyme digestion analysis and DNA sequencing． This vector was transfected into com-
mon RD cells through lentivirus with Lipofectamine 2000 in order to integrate the HLA-A33 gene to RD cell genome． The genomic DNA
was extracted and identified through PCR． The expression of the HLA-A33 protein was detected by Immunofluorescence assay and
Western blotting assay． Results showed that the target gene was integrated into the genome of RD cells and successfully expressed．
Key words: RD cell HLA-A33 Cell line Stable expression
收稿日期:2011-03-14
作者简介:王健，男，硕士研究生，研究方向:动物临床病理学;E-mail:ronaldoaaa@ 163． com
通讯作者:刘思当，E-mail:liusid@ sdau． edu． cn
主要组织相容性复合体(MHC)于 20 世纪发
现，在不同种属或同种不同系别的个体间进行组织
移植时，会出现排斥反应，其本质是细胞表面的同种
异型抗原诱导的一种免疫应答。人类主要组织相容
性复合体，又称人类白细胞抗原(HLA) ，是最早发
现的与疾病有明确关系的遗传系统，也是目前所知
人体最复杂的多态系统，具有多态性、多基因性和高
度特异性［1］。自 1958 年发现第一个 HLA 抗原，到
20 世纪 70 年代，HLA便成为免疫遗传学、免疫生物
学和生物化学等学科的一个重要新兴研究领域。编
码 HLA抗原的基因由多基因座组成，称为 HLA 基
因复合体，位于第 6 对染色体短臂(6p21． 3) ，按其
分布和功能分为Ⅰ类抗原和Ⅱ类抗原。HLA-I 类分
子主要是内源性抗原的递呈分子，其中 A 位点最为
常见，我国 HLA-A11，A2，A24 和 A33 阳性人群占绝
大多数，A33 表位占 A 位点表位的 21%，是临床中
较常见的表位。HLA 的主要功能是参与自我识别、
免疫调节和对异体移植物排斥反应［2］。HLA 抗原
及基因型别是重要的遗传标志，其具有地域、种族差
异［3］。文献显示，中国人中 A33 基因型占有较高比
例，属于常见的基因型［3 － 6］。研究证实，HLA-A33
基因型与多种疾病的发生有遗传相关性，该研究成
果，可以为相关的疾病的基础性研究提供一种方便
有效的工具。在我国南方［7］统计的结果，HLA-A33
与 HBV 感染后慢性化有较明显的相关性;Chang
等［8］的研究表明，HLA-A33 型为 EV71 易感基因型;
曹海霞等［9］的研究表明，HLA-A33 与小儿急性淋巴
细胞白血病有遗传相关性。
2011 年第 11 期 王健等:稳定表达 HLA-A33 蛋白细胞系的建立
本试验拟通过慢病毒系统，将 HLA-A33 基因
整合到 RD 细胞的基因组中，构造出可以稳定表
达 A33 蛋白的细胞系，为相关疾病与 HLA-A33
分子之间的关系的基础性研究提供一种可靠的
工具。
1 材料与方法
1. 1 材料
pGEM -T Easy Vector Systems、DNA Purifi-
cation Kit 购于 Promega 公司;293T 细胞、RD 细
胞、四质粒慢病毒系统由本实验室保存;Lipo-
fectamine 2000 购于 Invitrogen 公司;Plasmid Mini
Kit、Gel Extraction Kit 购于 Omega 公司;T4 DNA
Ligase、限制性内切酶 Nde I、Xho I 购于 NEB 公
司;TOP10 感受态细胞、RIPA 裂解液购于 Biomed
公司;Pyrobest DNA Polymerase 购于 TaKaRa 公
司;Taq DNA Polymerase (recombinant)、dNTP、
MgCl2、DNA Marker 购自 Fermentas 公司;胰酶购
自 Giboc;MEM、DMEM 培养基、胎牛血清购自
Hyclone;Puromycin 购自 Sigma;Anti-DYKDDDDK
Polyclonal Antibody 购自 Signalway Antibody;荧光
倒置显微镜由 Carl Zeiss Jena 公司生产;凝胶成
像系统由 Tanon 公司生产。
1. 2 方法
1. 2. 1 HLA-A33 基因合成和 PCR 扩增 分析从
GenBank查阅人 HLA-A33 基因的 DNA 序列，通过
优化密码子，设计易于在真核细胞内表达的序列，在
尾部加上 Flag和 Streptavidin标签，由上海旭冠基因
公司负责合成。同时用 Oligo 6 设计两条鉴定引物，
上游引物为 5-TCCGCTAGCGCCGCCACCAT-3，下
划线为 NheⅠ酶切位点;下游引物为 5-ATTCTC-
GAGTCAGCTGCCCTTGTCGTCGTCGTCCTTG-3，下
划线为 XhoⅠ酶切位点。以合成的序列为模板进行
PCR 反应，反应体系:模板 2 μL，上游引物(10
μmol /L)1 μL，下游引物(10 μmol /L)1 μL，2. 5
mmol /L的 dNTP混合液 2 μL，10 × Pyrobest Buffer II
2 μL，Pyrobest DNA Polymerase(5 U /μL)0. 5 μL，补
灭菌蒸馏水至 20 μL。PCR 扩增程序:94℃ 3min;
94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30 个循环;72℃ 5
min。反应完毕后 1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目
的片段，具体回收步骤参照 TaKaRa 胶回收试剂盒
说明书。将得到的回收片段末端加上碱基 A，反应
体系:DNA片段 30 μL，Taq DNA Polymerase (recom-
binant)1 μL，dNTP 2 μL，MgCl2 3 μL，buffer 4 μL，
74℃ 1 h，产物 1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收片段，
方法同上。
1. 2. 2 HLA-A33 片段与 T 载体的连接与转化 将
得到的加 A 后片段与 T 载体连接，连接方法参照
Promega pGEM -T Easy Vector Systems 产品说明
书。连接产物转化至 TOP10 感受态细胞，均匀涂布
于含 60 μg /mL氨苄青霉素的 LB 固体培养基上，静
置 1 h，再倒置培养 16 － 24 h。
1. 2. 3 重组质粒的提取与鉴定 菌落的提取。
将在含氨苄青霉素的 LB 固体培养基上长出的阳
性克隆菌落编号，再挑取阳性菌落进行菌落
PCR，反应体系、条件和循环次数与 HLA-A33 片
段扩增的条件相同，以合成的 HLA-A33 为阳性
对照，阴性对照加水，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检
测目的条带。
重组质粒的双酶切及测序鉴定。挑取和阳性
对照有一致条带出现的菌落，用质粒提取试剂盒
提取重组质粒。进行 NheⅠ和 XhoⅠ双酶切。酶
切体系:质粒 2 μg(10 μL) ，100 × BSA 0. 5 μL，
NdeⅠ和 XhoⅠ各 0. 5 μL，10 × NEB buffer 45 μL，
补灭菌的双蒸水至 50 μL，酶切条件为 37℃水浴 4
h。酶切产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。将同一
阳性克隆的菌液送至华大基因用 Vector T 质粒的
通用引物测序。
1. 2. 4 包装重组慢病毒系统
1. 2. 4. 1 HLA-A33 片段连接 pLentiLox 3. 7 载体及
鉴定 将测序正确的克隆的酶切产物回收，同时将
载体用 NdeⅠ和 XhoⅠ双酶切，用 1%琼脂糖凝胶电
泳回收载体，用 T4 DNA Liagase做连接反应，反应体
系:T4 DNA Ligase 0. 5 μL，T4 buffer 2 μL，pLentiLox
1 μL，HLA-A33 双切片段 3 μL，用灭菌的双蒸水补
齐至 20 μL。37℃反应 4 h。连接产物于 65℃灭活
10 min，转化至 TOP10 感受态细胞，均匀涂布于含
60 μg /mL 氨苄青霉素的 LB 固体培养基上，静置 1
h，再倒置培养 16 － 24 h。挑取阳性克隆再次送华大
基因测序。
1. 2. 4. 2 慢病毒的包装及在 293T 细胞中的扩
312
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
增 选取测序正确的菌落，与 VSVG、MDLG 和 REV
一起摇菌，在无菌条件下大提质粒，并测定质粒的浓
度。用 DMEM 培养基 37℃，5% CO2条件下培养
293T细胞，接种 6 孔板，每孔约(3 － 4)× 105个细
胞，使转染前细胞密度达到 90%。参照 Lipo-
fectamine 2000 说明书和 Simmons 等［10］的方法进行
转染，收取细胞上清，12 000 r /min 离心去沉淀，分
装在 1. 5 mL Eppendorf管中备用。
1. 2. 4. 3 慢病毒系统感染 RD 细胞及鉴定 RD
细胞抗 puromycin 浓度的测定。用 MEM 培养基
37℃，5% CO2条件下培养 RD细胞，接种十二孔板，
每孔 1 mL，浓度为 50% － 70%，混匀贴壁 4 h，第一
孔留作空白对照，其它各孔加依次加不同浓度的
puromycin，培养 3 d，换液继续培养 4 d，观察细胞的
生长状态和细胞全部死亡的临界浓度。
慢病毒感染 RD 细胞。将 RD 细胞提前一天接
种六孔板 2 个孔(80%，2 mL) ，其中一个孔为对照。
第 2 天吸掉培养基，每孔加 500 μL冻存的包装好的
慢病毒(对照孔加 MEM) ，0. 5 μL polygreen 和 1. 5
mL正常培养基。12 h 后更换培养基，继续培养 12
h，消化，铺板，每个 6 孔板铺到一个 10 cm培养皿，2
h后加 puromycin进行筛选。3 d 以后开始换液，观
察细胞生长状态，以后每次换培养基的同时要加新
的 puromycin。待细胞生长稳定后就可以冻存待用
(命名 RD-A33)。
HLA-A33 蛋白的表达及鉴定。(1)PCR鉴定:
收取一盘生长状态良好的 RD-A33 细胞(10 cm
dish) ，用 Promega DNA purification kit 提取细胞的
基因组 DNA，用设计的两条引物做 PCR(条件同
上) ，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。(2)蛋白免疫印迹
(Western blotting)鉴定:选取一盘生长状态良好的
RD-A33 细胞(10 cm dish) ，去上清，加 1 mL RIPA
裂解液，按说明书提取细胞的全蛋白，进行 12%
SDS-PAGE 电泳分离蛋白，用湿转法将蛋白质转移
至 PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜后，分别用
兔抗 Flag 多抗(1 ∶ 1 000 稀释)和小鼠抗大鼠 β-
Actin 单克隆抗体(1 ∶ 3 000 稀释)孵育 2 h，TBST
洗膜 10 min /次洗 3 次，再分别用山羊抗兔 IgG
(1 ∶ 3 000稀释)和羊抗小鼠 IgG(1 ∶ 5 000 稀释)
孵育 1 h，TBST 洗膜 3 次(10 min /次) ，采用增强
化学发光法检测结果。(3)免疫荧光(IF)鉴定:
RD-A33 提前一天接种于十二孔板盖玻片上。弃
掉培养基，于冰上用预冷的 PBS 洗涤细胞 3 次，
每孔加 300 μL 4%多聚甲醛固定 10 min，100%
甲醇穿透 10 min，3% BSA 封闭 1 h 或过夜，一抗
孵育 1 h，二抗孵育 45 min。用含 DAPI 的封片剂
封片，用指甲油封上片子周围，置于荧光倒置显
微镜下观察。
2 结果
2. 1 PCR检测 A33 细胞系基因组中的目的基因
提取构建的稳定表达 A33 分子的细胞系的基
因组，以此为模板，用设计的两条引物进行 PCR 扩
增，扩增出的条带和目标条带大小(加酶切位点和
保护碱基共 538 bp)一致(图 1)。说明 A33 的基因
已经成功的整合进 RD细胞的基因组中。
M． DNA Marker;1． A33 基因组 PCR产物
图 1 A33 基因组的 PCR鉴定
2. 2 目的蛋白在 RD细胞中的表达
用构建的细胞系做免疫荧光检测，anti-DYKD-
DDDK polyclonal antibody 为一抗，Goat anti-Mouse
IgG为二抗，结果(图 2)显示，A33 分子已经成功在
RD细胞内表达。
Ⅰ． 10倍物镜下用紫外光激发;Ⅱ． 64倍物镜下，紫外和绿光同时激发
图 2 荧光倒置显微镜下的 A33 细胞系
提取 RD 细胞膜蛋白，用 Western blotting 检测
目的蛋白的表达情况，结果(图 3)显示，A33 蛋白在
构建的稳定细胞系中成功表达，说明目的基因已经
成功的整合到 RD细胞的基因组中。
412
2011 年第 11 期 王健等:稳定表达 HLA-A33 蛋白细胞系的建立
1．正常的 RD细胞;2． A33 细胞系
图 3 Western blotting检测 A33 蛋白的表达
3 讨论
HLA分子是人类最复杂的多态系统，具有多态
性、多基因性和高度特异性，并对机体的免疫调节起
重要作用。临床上，HLA-A33 型是中国人中常见的
基因型［3 － 6］，在疾病的发展、转归和愈后方面有相关
性，尤其是与人类的重大传染性疾病 HBV感染后的
慢性化和 EV71 的易感率密切相关。本试验通过将
HLA-A33 分子的基因插入慢病毒载体系统，利用慢
病毒载体的特性，将 HLA-A33 基因顺利整合入 RD
细胞系的基因组中，构建出能成功表达有生物学活
性的 HLA-A33 分子。经鉴定，构建的细胞系能够正
常生长、传代、保种，且转入的 HLA-A33 分子可以成
功表达，不会丢失。构建的细胞系能够用来对 HLA-
A33 分子与疾病之间关系的基础性研究，作为一种
工具，为这些研究提供试验依据和试验工具。
4 结论
本研究利用四质粒慢病毒系统的特点，将 HLA-
A33 分子的基因整合入 RD 细胞系的基因组 DNA
中，PCR检测结果显示基因整合成功，免疫荧光检
测和 Western blotting检测结果显示目的蛋白可以成
功的在构建的细胞系中稳定的表达。
参 考 文 献
［1］康英丽． HLA基因与乙肝相关性肾炎相关性的研究综述． 中国
中西医结合肾病杂志，2010，11(10) :927-929．
［2］张海蓉，江华．人类白细胞抗原基因多态性研究及其在肝病中的
应用．国际检验医学杂志，2006，27(12) :1104-1106．
［3］肖露露． HLA多态性在广东汉族人群分布的特殊性． 中华微生
物学和免疫学杂志，1999，19(4) :302-305．
［4］冯喆，张工梁，杨颖．中华(上海)骨髓库的 HLA分布报告．中华
器官移植杂志，2001，22(3) :179-185．
［5］陆琼，冯明亮，季芸．江浙沪地区汉族人群 HLA 单体型研究． 遗
传学报，2003，30(6) :584-588．
［6］孙继丽． 20596 名汉族造血干细胞供者HLA多态性统计学分析．
中国输血杂志，2006，19(5) :379-384．
［7］涂正坤，吴雄文，刘敏，等．湖北汉族人群对乙肝疫苗免疫应答的
水平与 HLA-I 类分子多态性． 中国遗传免疫学杂志，1999，15
(1) :20-22．
［8］Chang LY，Chang IS，Chen WJ，et al． HLA-A33 is associated with
susceptibility to enterovirus 71 infection． Pediatrics，2008，122(6) :
1271-1276．
［9］曹海霞，洪军，沈红．人类白细胞抗原Ⅰ基因多态性与急性淋巴
细胞白血病的相关性． 实用儿科临床杂志，2007，22(15) :
1143-1144．
［10］Simmons A，Jantz K． Use of a lentivirus /VSV pseudotype virus for
highly efficient genetic redirection of human peripheral blood lym-
phocytes． Nat Protoc，2006，1(6) :2688-700．
(责任编辑 李楠)
512