全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第1期
收稿日期:2007-08-17
作者简介:姚滢秋(1978-),女,在读硕士研究生,研究方向:酶与发酵工程
通讯作者:陈星,女
从植物组织中提取 RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。要进行 Northern杂交分析,纯
化 mRNA以用于体外翻译或建立 cDNA文库,RT-PCR及差示分析等分子生物学研究,都需要高质量的
RNA。植物总 RNA的提取已有许多较为成熟的方法[1],如热酚法[2]、CTAB法[3,4]、异硫氰酸胍法[5]和 Trizol法
等。但对于不同的植物或同种植物的不同器官或组织,由于其组分差异较大,影响 RNA提取的因素也存在
较大差异,常规提取方法往往不能取得理想效果[6]。
豆科植物 RNA的提取相对难度较大,相关研究和报道也比较少。付畅等[7]和刘易科[8]等的改良方法对
大豆根、茎等器官 RNA的提取已获得理想结果,但对叶片的提取效果均不佳。本研究针对大豆叶片的特殊
性,对 Trizol法和热酚-氯化锂沉淀法进行了改良,取得了良好效果,获得的总 RNA完整性好,纯度高,有效
的去除了多糖等杂质,可满足 RT-PCR等实验要求。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
材料:新鲜的大豆叶片(实验前做避光处理 1d)。试剂:(1)Trizol试剂;(2)1%β-巯基乙醇;(3)高盐缓
冲液:柠檬酸钠 0.8mol/L,氯化钠 1.2mol/L;(4)RNA提取缓冲液:50mmol/LTris-HCl(pH9.0),100mmol/L
NaCl,2%SDS,高压灭菌;(5)8mol/LLiCl,溶于 ddH2O,高压灭菌;(6)4mol/LNaOH溶液;(7)蛋白酶 K
(20mg/ml);(8)4℃预冷的氯仿,异丙醇,75%乙醇。
高质量提取大豆叶片总RNA的改良方法
姚滢秋 1 陈星 2 王璞 1 梁燕 2 闫梅 2 肖白 2
(1首都师范大学生命科学学院,北京 100037;2首都医科大学附属北京朝阳医院基础医学研究中心,北京 100020)
摘 要: 豆科植物总RNA的提取相对比较困难,大豆叶片富含多糖、蛋白质,传统方法提取效果均不理想。在总
RNA 的提取方法Trizol法和热酚-氯化锂沉淀法的基础上,针对大豆叶片的特殊性,做了适当的改良,从而获得了完整
性好,高纯度的大豆叶片总RNA,并成功进行了基因片段的RT-PCR实验,结果证实所获得的RNA完全可以适应后续
实验要求。
关键词: 大豆 RNA 提取方法
ImprovedMethodsforIsolationofHighQualityTotalRNA
from GlycinemaxLeaves
YaoYingqiu1 ChenXing2 WangPu1 LiangYan2 YanMei2 XiaoBai2
(1ColegeofLifeScience,CapitalNormalUniversity,Beijing100037;2BeijingChaoyangHospitalAfiliateofCapitalof
MedicalSciences,Beijing100020)
Abstract: TisueofGlycinemaxleavescontainpolysaccharideandothersecondarymetabolitesingreatquantity
thatmakingRNAdificulttoextract.Wepresentimprovedprotocolsbasedonhotphenol-LiCldepositionandTrizol
methodforquickisolationoftotalRNAwithhighpurityandhighintegrality.Theresultshowsthattheextractedtotal
RNAcanmeetthedemandoftheRT-PCRexperiment.Therefore,thesemethodsdeservefurtherstudies.
Keywords: Glycinemax RNA Isolation
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
1.2 方法
1.2.1 预处理 器皿、试剂等处理方法参照文献[9]进行。
1.2.2 RNA提取
1.2.2.1 改良 Trizol法 (1)大豆幼嫩叶片约 0.1g,加液氮充分研磨成细粉末状;(2)液氮冷却的 1.5ml离
心管中,加入 1mlTrizol试剂,同时加入 β-巯基乙醇,使其终浓度为 1%(0.14mol/L),剧烈振荡摇匀,涡旋,
冰上放置 10min;(3)加入 100μl高盐缓冲液;(4)加入 350μl氯仿,剧烈振荡摇匀,涡旋;(5)4℃,12000r/min
离心 10min,取上层水相于新的预冷离心管中,加入等体积的异丙醇,-20℃沉淀过夜;(6)4℃,12000r/min
离心 20min,回收 RNA;(7)弃上清,75%乙醇洗 3~4次,4℃,12000r/min离心 5min;(8)小心弃上清,并稍离
心,用枪把残留乙醇吸净,冰上放置,超净台吹干,溶于 20μlDEPC水中。
1.2.2.2 改良热酚-氯化锂沉淀法[10] (1)大豆幼嫩叶片约 1g,加液氮充分研磨成细粉末状;(2)在一支
50ml离心管中加入 6mlRNA提取缓冲液和 3mlTris-饱和酚加热到 60℃;(3)将组织粉末倒入,拧紧盖子,剧
烈晃动 10~15min;(4)加入 3ml氯仿,剧烈摇动 10min;(5)室温 3800r/min离心,20~30min;(6)小心取上清
液清,加入 15μl/ml蛋白酶 K,55℃水浴 10min;(7)用等体积的氯仿抽提一次;(8)小心吸取上清液(切勿吸
取中间层),加入 1/3体积的 8mol/LLiCl,4℃放置过夜沉淀 RNA;(9)4℃,8500r/min,离心 30min,收集 RNA
沉淀;(10)75%乙醇洗去盐分,冰上放置,超净台吹干,溶于 DEPC水中。
1.2.3 总 RNA纯度测定 取 2μlRNA样品稀释至 500μl,用紫外分光光度计法[10]分析其纯度
1.2.4 RNA的完整性电泳分析 取 1μlRNA
进行 1%普通琼脂糖凝胶电泳
1.2.5 RT-PCR检测 验证基因选用大豆苯丙
氨酸解氨酶(PAL)基因中 1.9Kb片段
2 结果分析
2.1 两种改良方法提取大豆叶片总 RNA的分光光度计法检测结果
分光光度计法检测了两种改良方法所提取大豆叶片总 RNA的纯度。由表 2可知,两种改良方法提取
的大豆叶片总 RNAOD260/280值均大于
1.80,说明两种改良方法所提取的大豆
总 RNA样品中蛋白质污染基本被去除;
OD260/230值均大于 2.0,可见两种改良方法
对多糖的去除效果很好。由此可见,所得大豆叶片总 RNA质量较高。
2.2 两种改良方法提取大豆叶片总 RNA琼脂糖凝胶电泳分析
两种改良方法提取的大豆叶片总 RNA琼脂糖凝胶电泳分析结果,见图 1。由图 2可以看出,两种改良
方法提取的大豆叶片总 RNA没有蛋白污染,28S
和 18S条带均清晰完整,且 28S的亮度大约是
18S的 2倍,说明 RNA的完整性较好,且无蛋白
污染,多糖去除较彻底。
2.3 RT-PCR检测结果
两种改良方法所提取的大豆叶片总 RNA进
行 RT-PCR检测,结果见图 3。由图 3可见,目的
条带清晰,片段大小正确,说明两种改良方法所
提取 RNA的质量和较高,完全可以满足后续分
子生物学实验要求。
表 1 用于 RT-PCR反应的引物
表 2 两种改良方法提取棉花 RNA的纯度
图 1 改良 Trizol法提取
大豆叶片总 RNA电泳结果
图 2 改良热酚-氯化锂沉淀法
提取大豆叶片总 RNA电泳结果
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综合分析凝胶电泳和 RT-PCR检测结果可知,两种改良方法
都比较适合大豆叶片总 RNA的提取。
3 讨论
大豆富含多糖等次级代谢产物,RNase的活性较高。内源
RNase的活跃,极易造成 RNA提取过程中 RNA的降解;多糖的许
多理化性质与 RNA很相似,很难将它们分开[11],去除多糖的同时
会造成 RNA产量的减少;而在沉淀时,含有多糖的 RNA沉淀难
溶于水,或溶解后产生粘稠状的溶液[12]。多糖的残留会严重影响
后续试验的进行,干扰和抑制许多酶反应,如 RT-PCR反应等。本
试验的重点就在于解决降解和多糖残留的问题并对提取总 RNA时需要注意的问题进行了总结:1)试验前
1d,对植株叶片做避光处理,以减少多糖成分;2)取材要新鲜幼嫩;3)研磨材料一定要细致,这是 RNA提取
产率提高的关键步骤。研磨过程中要不断补加液氮,防止研磨过程中 RNA的降解,一定要在液氮完全挥发
完之前,将组织粉末转移到提取液中;4)低温对于 RNA提取是很关键的,低温可以有效的抑制 RNase的活
性。研钵、研棒、药匙、离心管等要在液氮中冷却;提取试剂(高盐缓冲液除外)及所有塑料制品都做 4℃预
冷处理。5)单管中的材料应尽量的少,使提取液充分的与材料反应,并有效的抑制内源 RNase释放;6)蛋
白酶 K的加入不仅对消除蛋白质污染有重要作用,而且通过酶解还可以在一定程度上去除 Rnase和酚类
氧化酶[13];7)高盐成份有利于去除多糖和蛋白质,减少 RNA损失,避免了多糖残留对后续试验造成的不良
影响。
参考 文献
1 卢圣栋.现代分子生物学实验技术(第 2版).北京:中国协和医科大学出版社,2001,136~149.
2 王友华,卢孟柱,段留生.西北植物学报,2005,5(4):723~726.
3 刘志,杨永华.生物技术通报,2004,(4):372~373.
4 BekesiovaI,NapJ,MlynarovaL.PlantMolBioRep,1999,17:269~277.
5 ChomczynskiP,SacchiN.AnalBiochem,1987,162(1):156~159.
6 王芳,张斌.花生学报,2002,31(4):24~26.
7 付畅,王豫颖,代红杰.大豆科学,2004,23(4):282~284.
8 刘易科,孙洪波,简波,等.西北农林科技大学学报,2006,34(12):83~86.
9 张七仙,刘俊起,李成霞,等.中国农业科学,2001,34(4):458~460.
10 SambroolJ,ManiatisT,FritschEF.Molecularclonging.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,343~361.
12 LewinsohnE,SteeleCL,CroteauR.PlantMolBiolReptr,1994,12:20~25
11 LogemannJ,SchelJWI,LmititzerI.AnalBrachem,1987,163:16~20.
13 史公军,侯喜林,易金鑫.西北农业学报,2004,13(3):97~99.
图 3 两种改良方法提取大豆叶片 RNA的
RT-PCR检测结果
姚滢秋等:高质量提取大豆叶片总RNA的改良方法 135