全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
现代分子生物学技术在冰川
微生物生态研究中的应用
赵龙　季秀玲　魏云林
(昆明理工大学生命科学与技术学院 ,昆明 650224)
　　摘 　要 : 　研究冰川中微生物的多样性对于揭示环境气候变迁 ,研究生物进化 ,开发微生物资源具有重要意义 ,现代分子
生物学的发展为研究冰川微生物的多样性提供了行之有效的方法。简要综述了 16S rDNA文库构建、变性梯度凝胶电泳、限
制性片段长度多态性和荧光原位杂交等技术的原理及在冰川微生物生态研究中的应用现状。
关键词 : 　冰川微生物 　16S rRNA基因文库 　变性梯度凝胶电泳 　荧光原位杂交
Application of M olecular Biolog ica l Techn iques in
Studying Glac ier M icrobia l Ecology
Zhao Long　J i Xiuling　W ei Yunlin
( College of L ife Sciences and Technolog, Kunm ing University of Science and Technology, Kunm ing 650224)
　　Abs trac t: 　M icrobes are an important composition of ecosystem1 It is important to study the m icrobial diversity and community
structure in glacier in revealing the climate changes, studying evolution and exp loiting of m icrobial resource1The modern molecular biol2
ogy techniques p rovide effective methods to study the m icrobial diversity in glacier1 In this article, several techniques, such as 16S rRNA
gene clone library, DGGE ( denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) , RFLP ( restriction fragment length polymorphism, RFLP) ,
and F ISH ( fluorescence in situ hybridization) were summarized1
Key wo rds: 　Glacier m icrobes　16S rRNA gene clone library　DGGE　F ISH
收稿日期 : 2009209202
作者简介 :赵龙 (19822) ,男 ,硕士研究生 ,主要研究方向 :微生物学 ; E2mail: zhlong361@1631com
通讯作者 :魏云林 ,教授 ; E2mail: weiyunlin@ yahoo1com1cn冰川是一种巨大的流动固体。在高寒地区雪结晶聚积成巨大的冰川冰 ,冰川冰在重力和压力作用下顺山坡或谷地向下运动 ,成为冰川。现代冰川在世界各地几乎所有纬度上均有分布。地球上的冰川大约有 2 900多万平方公里 ,覆盖大陆 11%的面积。随着大气环流和每年的降雪 ,微生物不断沉积在冰川表面 ,在冰冻和融雪过程中进入冰隙和深冰川 2冰芯的气泡中 ,并在冰川中形成明显的生物层 [ 1 ]。冰芯是按年代保存的、长时间尺度上微生物的储存库 ,记载了不同沉积时期大气向冰川输送的微生物数量和结构的变化情况 ,是研究生物进化以及地球上生物生存环境变迁信息的优良介质。此外 ,研究冰芯中微生物的多样性对预测气候变化可能导致的冰川微生物的危害也很有帮助。目前 ,冰 川微生物已成为世界极端环境微生物学领域的研究热点。1　冰川微生物的研究方法以往对于冰川微生物多样性和群落结构的研究一直沿用传统的分离培养技术 ,然而研究证明自然界中 85% ～9919%的微生物是不可培养的 [ 2 ] ,因此分离培养技术不能真实反映微生物的组成。20世纪 80年代末至 90年代初发展起来的一系列分子生物学技术使得我们可以摆脱对纯培养的依赖 ,因此被广泛应用于环境微生物多样性的研究。目前应用于冰川微生物研究的分子生物学方法主要有 16S rDNA文库构建 ,变性梯度凝胶电泳 ,限制性酶切片段长度多态性和荧光原位杂交等。
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
111　16S rRNA基因文库构建
构建 16S rDNA克隆文库是用来调查环境中原
核微生物组成的常用分子生物学方法之一。该技术
的主要原理是对细菌 16S rDNA 的保守区设计引
物 ,对样品总 DNA进行 16S rDNA扩增。将扩增产
物克隆到载体 ,通过构建克隆文库分离不同的序列 ,
通过测序比对分析每一个克隆中带有的 16S rDNA
分子属于哪一种微生物 ,整个文库测序比对得到的
结果就反映环境中微生物的组成。
文库构建方法广泛应用于冰川微生物多样性的
研究。Sheridan等 [ 3 ]通过 16S rDNA文库结合限制
性片段长度多态性 (RFLP)分析研究了格陵兰岛冰
芯厌氧微生物富集培养物 ,试验筛选的 60个阳性克
隆可分为 27个不同的限制性酶切长度多样性类型 ,
并对其中 24个代表序列进行了系统发育分析 ,不同
的序列代表了变形菌和栖热菌属、拟杆菌属、真杆菌
属和梭菌属的近缘群。L iu等 [ 4 ]用文库构建结合
RFLP方法研究绒布冰川微生物群落 ,筛选了 229个
克隆 ,得到的 35条 16S rDNA序列分别属于α、β、γ
变形菌 ,放线菌门 ,厚壁菌门 ,噬纤维菌 /黄杆菌 /拟
杆菌 ( Cytophaga2Flavobacterium 2B acteroides, CFB ) ,蓝
细菌和叶绿体。其中γ变形菌是该地区的优势种
群 ,而不动杆菌属和勒克菌属在属水平上占优势。
L iu等 [ 5 ]研究了珠穆朗玛峰北坡 6 000 m以上微生
物群落组成 ,表明主要生境中细菌群落组成是变化
的 , CFB在冰川融水中占绝对优势 ,而在冰塔冰中β
变形菌和 CFB是优势种群 ,变形菌和放线菌在表层
雪中为优势种群。J ill等 [ 6 ]用文库构建法研究泰勒
冰川下的 B lood Falls中的微生物多样性 ,发现 74%
的克隆和分离菌株与海水中的微生物 16S rRNA具
有很高的相似性 ,为 B lood Falls是由海水起源的提
供了论据。Stephanie等 [ 7 ]用文库构建结合 RFLP分
析了加拿大 John Evans冰川冰下水体的微生物多样
性 ,其中一份冰川下水样 25%的克隆为β变形菌 ,
23%的克隆为 B acteroidetes, 14%的克隆为放线菌 ,
另一份冰川下水样 51%的克隆为β变形菌。5%为
B acteroidetes,未发现放线菌。
尽管通过该方法获得了较多冰川中微生物群
落多样性的信息 ,但其对分析的克隆数目要求较
高 ,只有在克隆数目足够大的情况下才可以较为
完整的认识种群的组成 ,因此工作量较大。此外 ,
由于核酸提取、PCR扩增及克隆过程产生的偏差
可能导致样品的基因克隆库不太准确 ,因此有时
也不能完全正确反映冰川中微生物群落的真实
面貌。
112　变性梯度凝胶电泳 (DGGE)
DGGE的原理是用一对特异性引物扩增微生物
自然群体的 16S rRNA基因 ,产生长度相同序列不
同的 DNA片段的混合物 ,然后利用含变性剂梯度的
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离混合产物。
不同的双链 DNA片段因其序列组成不同 ,其解
链区域及各解链区域的解链温度也不同。电泳开始
时变性剂浓度较小 ,不能使双链 DNA 解链 ,此时
DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶
中一样。当达到最低解链浓度时 , DNA开始解链形
成分枝状结构 ,这种分子在电泳中的迁移速率急剧
下降。长度相同序列不同的 DNA片段会在胶中不
同位置处达到各自最低解链区域的解链浓度 ,因此
它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移
速率大大下降 ,从而在胶中被区分开来 ,染色后在凝
胶上呈现分开的条带 ,每个条带代表一个特定序列
的 DNA分子。为了使检测序列能够完全解链 ,可在
PCR扩增目的片段时在某一引物 5′端加上一段富
含 GC的序列 ,称为“GC发夹 ”。加了“GC发夹 ”,
DNA片段中几乎每一个碱基变化都可以检测
出来 [ 8 ]。
DGGE常常被用来比较分析不同时间或不同地
点的样品中微生物的多样性 ,主要用于研究环境变
化与微生物群落动态的关系。
张淑红等 [ 9 ]用 DGGE对青藏高原北部老虎沟
12号冰川、南部东绒布冰川和东南部海螺沟 2号冰
川雪坑的细菌密度和种类多样性做了差异性分析。
结果表明 ,老虎沟 12号冰川雪坑细菌种类多样性高
于东绒布冰川 ,这与高原南、北部不同大气环流引起
的大气微粒含量的差异性有关。海螺沟 2号冰川雪
坑细菌种类多样性最高 ,与该冰川所受的大气环流
多样性最高相一致。刘炜等 [ 10 ] 通过恢复培养和
DGGE分析了东天山地区庙儿沟不同深度积雪中的
可培养细菌数量、多样性及其群落结构。结果表明 ,
不同深度雪坑中微生物数量和群落结构都有明显
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2009年第 12期 赵龙等 :现代分子生物学技术在冰川微生物生态研究中的应用
的变化。马晓军等 [ 11 ]通过 DGGE比较了两个不同
类型冰川雪坑中真核微生物的多样性。结果表
明 ,东天山大陆性冰川和玉龙山海洋性冰川雪样
中的真核微生物多样性显著不同 ,大陆性冰川表
层雪和深层雪中优势真核微生物多样性差别较
大 ,但在海洋性冰川雪坑中 ,这种变化较小。 Si2
gler[ 12 ]用 DGGE对 Damma glacie和 Rotfirn glacier
的土壤总 DNA进行了分析 ,表明两地区微生物的
组成和演替存在显著差异。Graeme等 [ 13 ]用 DGGE
分析了澳大利亚 Rotmoosferner冰川地区古菌的组
成 ,研究发现古菌组成主要是非嗜热古菌和泉古
生菌的类群 Ⅰ。
113　限制性酶切长度多态性 (RFLP)
RFLP是利用限制性内切酶特性及电泳技术 ,
对特定的 DNA片段的限制性内切酶产物进行分析 ,
根据片段的大小不同及标记片段种类和数量的不
同 ,评价微生物的群落结构和多样性。RFLP主要
是与 16S rDNA文库构建结合使用 ,可减少测序数
量 ,对感兴趣的克隆进行深入分析。
114　末端标记限制性片段长度多态性 ( T2RFLP)
T2RFLP是在 RFLP基础上发展起来的一种技
术 ,原理是依据 16S rDNA序列保守区设计通用引
物 ,其中一个引物的 5′端用荧光物质标记。以样品
总 DNA为模板进行 PCR扩增 ,扩增产物的一端带
有荧光标记 ,再用合适的限制性内切酶消化 PCR产
物 ,产生不同长度的限制性片段。消化产物用 DNA
自动测序仪分离 ,通过激光扫描 ,得到带荧光标记端
的图谱 ,而其它没带荧光标记的片段则检测不到。
由于每种菌末端带荧光标记的片段 ( term inal restric2
tion fragment, TRF )长度是惟一的 ,所以峰值图中每
一个峰至少代表一种菌。根据末端限制性片段的长
度与现有数据库进行对比 ,有可能直接鉴定群落图
谱中的单个菌种 [ 14 ]。每个峰的面积占总面积的百
分比则代表这种菌的相对数量。
Maya等 [ 15 ] 通过 T2RFLP 分析了 John Evans
Glacier的微生物群落 ,结果显示基底冰层、冰下水
样和冰川沉淀物中的微生物与冰上融水和冰前沉淀
物的微生物组成明显不同。
115　荧光原位杂交 ( F ISH)
基于 PCR的方法无法提供微生物形态学、空间
分布和生物体的细胞环境等信息 ,并且可能会在扩
增反应中引入差错降低所得信息的精确度。荧光原
位杂交作为一种不依赖 PCR的技术是以上方法的
有益补充 ,它结合了分子生物学的精确性和显微镜
的可视性信息 ,可以监测和鉴定环境中不同的微生
物个体 ,同时对微生物群落进行评价。利用 F ISH
技术在环境样品上直接原位杂交 ,不仅可测定微生
物的形态特征及丰度 ,而且可原位分析它们的空间
及数量分布。
F ISH的原理是用带有荧光标记的探针与环境
样品中的细胞进行杂交 ,利用其与样品中同源微生
物细胞内核酸分子的碱基互补配对特性 ,直接在共
聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜下观察微生物的
分布与数量 ,无需单独分离 DNA或 RNA。
F ISH技术的目标分子通常也是 16S rDNA。根
据待测微生物体内 16S rRNA基因中某段特异性序
列 ,设计相应的寡核苷酸探针 ,可实现对目标微生物
的原位检测 ,而选取在分子遗传性质上保守性不同
的特异序列 ,可在不同水平 ,如属、种等上进行检测。
除 16S rRNA基因外 ,还可以 23S rRNA或 mRNA等
基因作为研究的目标分子。
Robin等 [ 16 ]对南北极浮冰微生物的群落组成通
过培养和荧光原位杂交进行了综合的分析。结果表
明 ,在两极 ,α和γ变形菌及 Cytophaga2F lavobacteri2
um 是优势种群 ,南极和北极的样品中分别大约有
36%和 50%属于γ变形菌。Tom等 [ 17 ]用荧光原位
杂交研究了沿冰川流的沉积物中的微生物多样性发
现古菌在沿冰川鼻的方向上逐渐减少 , Cy tophaga2
F lavobacterium 大约是古菌的 6～8倍。David等 [ 18 ]
用 DGGE和 F ISH技术研究了南极湖泊营养变化后
的细菌组成变化。结果表明 ,富营养化的 Heywood
湖中的细菌丰度较高 ,细菌组成与附近其他贫瘠湖
泊明显不同。在营养贫瘠的 Moss和 Sombre湖中β
变形菌最多 ,其次是 Cytophaga2F lavobacterium ;而在
富营养化的 Heywood湖中 , Cytophaga2F lavobacterium
与β变形菌相等或更多 ,在比例上γ和α变形菌也
较多。
2　小结
近年来 ,冰雪微生物作为极端低温环境中的主
要生命形式已成为生命现象多样性和气候环境变化
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
等基础研究领域所关注的热点之一。虽然当前的各
种分子生物学方法在研究冰川微生物中都是非常有
效的 ,但是各自有其局限性。针对各种方法的优缺
点 ,结合传统的分离培养方法 ,无疑会在冰川微生物
生态研究上开辟一个全新的研究领域 ,也会为更全
面、深入地认识冰川微生物在生态研究中发挥重要
作用。
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