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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
来源于大肠杆菌的 62磷酸己酮糖合成酶和 62磷酸
果糖异构酶的原核表达与活性测定
马莉　陈丽梅　年洪娟
(昆明理工大学生物工程技术研究中心 ,昆明 650224)
　　摘 　要 : 　同源性搜索显示大肠杆菌中存在核酮糖单磷酸途径关键酶 62磷酸己酮糖合成酶 (HPS)和 62磷酸果糖异构酶
( PH I)基因的同源序列 ,但没有其相关活性和功能方面的报道。本研究利用 PCR方法从大肠杆菌的基因组中扩增 hps和 ph i
的同源序列 (分别简称为 Ehps和 Ephi) ,构建了大肠杆菌 Ehps和 Ephi基因的原核表达载体 pDEST172Ehp s和 pDEST172Ephi,
表达和纯化了重组蛋白 EHPS和 EPH I,酶活性检测结果表明 EHPS和 EPH I具有活性。
关键词 : 　62磷酸己酮糖合成酶 　62磷酸果糖异构酶 　原核表达 　重组蛋白纯化
Prokaryotic Expression and Activ ity M easurement of 32hexulose262p
hosphate Synthase and 62phospho232hexuloisomerase from Escherich ia coli
Ma L i　Chen L imei　N ian Hongjuan
(B iotechnology Research Center, Kunm ing University of Science and Technology, Kunm ing 650224)
　　Abs trac t: 　Homology search shows that there are homologous sequences of 32hexulose262phosphate synthase (HPS) and 62phos2
pho232hexuloisomerase ( PH I) , both of which involve in R ibulose monophosphate pathway in Escherichia coli, but there is no report on
the activities and functions of the enzymes. The hps and ph i homologous sequences designated as Ehps and Ephi, were amp lified from
E. coli genome by PCR to construct the p rokaryotic exp ression vectors pDEST172Ehp s and pDEST172Ephi, respectively. The recombi2
nant p roteins encoded by the two genes were exp ressed and partially purified. Further analysis indicated that the recombinant p rotein
exhibited enzyme activities.
Key wo rds: 　32hexulose262phosphate synthase　62phospho232hexuloisomerase　Prokaryotic exp ression　Purification
收稿日期 : 2009203217
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30670163) ,云南省中青年学术与技术带头人培养费和昆明理工大学人才培养费 (2004PY0125)
作者简介 :马莉 (19822) ,女 ,研究方向 :代谢途径基因工程
通讯作者 :陈丽梅 , E2mail: chenlimeikm@ yahoo. com. cn　　甲醛是一种活泼的化合物 ,能与蛋白质 ,核酸和脂类产生非特异性的反应 [ 1 ] ,几乎对所有生物都有很高的毒性。自然界中存在能代谢甲醛的微生物称为甲基营养菌。核酮糖单磷酸途径 (RuMP)是甲基营养型细菌同化甲醛的途径之一 , RuMP途径作为高效捕捉游离甲醛的一个系统 ,在甲醛浓度极低的情况下仍能发挥作用 [ 2, 3 ] ,在该途径中固定甲醛的关键酶是 62磷酸己酮糖合成酶 ( 32hexulose262phos2phate synthase, HPS)和 62磷酸果糖异构酶 ( 62phos2pho232hexuloisomerase, PH I) [ 4 ] ,目前已从多种甲基营养型细菌中克隆到 hps和 ph i基因 [ 5～9 ]。最近的 研究表明甲醛同化作用途径在细菌中广泛存在 ,在许多非甲基营养型细菌中也发现了 hps和 ph i的同源基因 [ 10～13 ] 。大肠杆菌中也存在编码这两个酶基因的同源序列分别简称为 Ehps和 Eph i,但是还没有关于大肠杆菌 EHPS和 EPH I的活性和功能的报道。本研究用 PCR方法从大肠杆菌的基因组中扩增 Ehps和 Ephi序列 ,构建了大肠杆菌 Ehps和 Eph i基因的原核表达载体 pDEST172Ehp s和 pDEST172Ephi,表达和纯化了 EHPS和 EPH I重组蛋白 ,酶活性检测结果表明重组蛋白 EHPS和 EPH I具有酶
2009年第 8期　　马莉等 :来源于大肠杆菌的 62磷酸己酮糖合成酶和 62磷酸果糖异构酶的原核表达与活性测定
活性。
1　材料与方法
111　材料
11111　菌株和质粒 　质粒扩增采用大肠杆菌菌株
E. coli DH5α。重组蛋白的表达采用大肠杆菌菌株
E. coli BL21。T载体 pUCm2T购自申能博采公司。
pENTRTM2B和 pDEST17购自 Invitrogen公司。
11112　酶及主要试剂 　限制性内切酶、Ex Taq
DNA聚合酶、DNA L igation Kit Ver. 2. 0购自 TaKa2
Ra (大连 )公司。PCR引物委托三博远志公司合成。
Gatewayµ LR反应试剂盒购自 Invitrogen公司。62磷
酸葡萄糖异构酶及 62磷酸葡萄糖脱氢酶购自 Sigma
公司。 IPTG购自上海生工公司。蛋白定量测定试
剂购自 B io2Rad公司。其它试剂均为国产分析纯。
从甲基营养型细菌 M ycobacterium gastri MB19 中纯
化的 HPS、PH I酶蛋白及 52磷酸核糖异构酶由日本
京都大学加藤实验室惠赠。
112　方法
11211　大肠杆菌基因组的抽提 　参照《分子克隆
实验指南 》(第 3版 )。
11212　Ehps和 Ephi基因的 TA克隆 　以大肠杆菌
E. coli DH5α基因组为模板 ,用 Ehps基因特异引物 :
上游引物 Ehp s5: 5′2GCATGCGTCGACCACTTC2TG2
CAA C23′(含有 SphⅠ位点 ) , 下游引物 Ehp s3: 5′2
GAATTCTTACGCACGCTTGCCTCCCCA G23′(含有
EcoRⅠ位点 ) )和 Ephi基因特异引物 : 上游引物
Ephi5: 5′2GCATGCGCAAATCGACTCCATCTG23′(含
有 S phⅠ位点 ) ,下游引物 Ephi3: 5′2GAATTCCTAA2
CATATAAATCCGGCCTC23′(含有 EcoR I位点 ) ) ,通
过 PCR扩增得到 Ehps基因和 Ephi基因的 DNA片
段。PCR扩增使用 Ex Taq DNA聚合酶 , 94℃变性
2 m in后进入循环 : 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 m in,
共 30个循环 ,最后 72℃延伸 10 m in。将 PCR产物
进行凝胶电泳 ,切下含有目的基因条带 ,回收 PCR
产物。将回收的 PCR产物与 T载体 pUCm 2T连接 ,
16℃连接过夜 ,连接反应混合液用热刺激法转化 E.
coli DH5α感受态细胞 (天根 ) ,涂布于 Amp平板上
筛选。挑取单克隆菌落 ,扩增 ,提取重组质粒 pUCm2
T2Ehp s和 pUCm2T2Ephi,用 Ehps和 Ephi的特异引物
进行 PCR检测 ,选出的阳性克隆再进行酶切鉴定。
由于 Ehps基因内部 (480 bp处 )带有 EcoRV的酶切
位点 , pUCm2T的多克隆位点上游也有 EcoRV 的酶
切位点。所以使用 EcoRV酶对 pUCm 2T2Ehp s质粒
样品进行酶切检测 ,连接正确的质粒酶切后应产生
两个片段 ,大小分别为 3. 0 kb和 0. 5 kb左右。在
pUCm2T2Ephi质粒中 , Ephi基因的上游和下游的多
克隆位点都有一个 EcoR I,所以选择部分 pUCm2T2
Ephi质粒样品进行 EcoR I酶切检测。连接正确的
质粒酶切后应产生两个片段 ,一个为目的基因片段
(0. 9 kb) , 另一个为载体片段 (2. 7 kb)。如果酶切
产物和预期一致 ,说明目的片段 Ephi已插入 pUCm2
T载体。
11213　Ehps和 Ephi入门克隆质粒的构建 　用 Kpn
Ⅰ和 EcoR I双酶消化 pUCm2T2Ehp s和 pUCm2T2Ephi
质粒及 Gateway入门质粒 pENTRTM 2B ,回收 Ehps和
Ephi基因的 DNA片段及 pENTRTM载体片段。分别
用 Ehps和 Ephi基因 DNA片段与 pENTRTM载体片
段进行连接反应 ,用连接反应混合物转化 E. coli
DH5α。挑取单菌落提取重组质粒 pENTR2Ehp s和
pENTR2Ephi,以 Ehps和 Eph i基因的特异引物进行
PCR筛选出阳性克隆 ,然后用 EcoRV 进行酶切鉴
定。Ehps基因内部 (480 bp处 )有 EcoRV位点。连
接正确的质粒酶切后电泳应产生 3个条带 ,最小的
一条小于 200 bp、其次为一条 480 bp的带和 2. 3 kb
的载体带。酶切产物和理论预测值一致。在 pEN2
TR2Ephi质粒中 , Ephi基因上下游均有 EcoRV位点。
连接正确的质粒酶切后电泳应产生 2个条带 ,一条
小于 0. 9 kb,另一条为 2. 3 kb (载体 ) ,酶切结果和
预期的一致。
11214　Gateway的 LR反应 　分别把入门克隆 pEN2
TR2Ehp s和 pENTR2Ephi质粒 300 ng与目的载体
pDEST17质粒 100 ng混匀后加入 1μl LR Clonase II
Enzyme M ix,反应体系在 25℃过夜后转化 E. coli
DH5α感受态细胞 ,涂氨苄青霉素平板。挑取单克
隆菌落 ,扩增 ,提取重组质粒 ,以 attB1 (ACAAGTTT2
GTACAAAAAAGCA)和 Ehps及 Ephi基因的下游引
物进行 PCR检测 ,筛选出的阳性克隆送三博远志公
司测序 ( T7 p rimer,正向单测 )。
11215　重组蛋白表达的诱导 　用测序分析正确的
表达质粒转化 E. coli BL21,挑取单菌落加入 2 m l
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LB (含有 Amp 50 mg/L )中 , 37℃过夜培养至 OD600
值约为 1. 5后加入 IPTG,使其终浓度依次为 0. 1、
0. 3、0. 5、1. 0和 2. 0 mM /L, 28℃连续诱导 6 h,取 1
m l菌液做 SDS2PAGE电泳确定 IPTG的最佳浓度。
另外 ,在重组菌生长到 OD600值约为 1. 5,加入最适
浓度的 IPTG, 28℃连续诱导 14 h,每隔 2 h取 1 m l
菌液做 SDS2PAGE电泳确定最佳表达时间。
11216　SDS2PAGE　根据文献资料和软件分析预测
目的蛋白大小均为 20 kD左右 ,采用 15%分离胶做
SDS2PAGE。方法参照《分子克隆实验指南 (第 3
版 ) 》。菌液离心后去上清收集菌体 ,加入蛋白抽提
液 ( Tris2HCl pH7. 4, 100 mM /L,甘油 10% , PMSF 1
mM /L,MgCl2 5 mM /L,β2巯基乙醇 10 mM /L )悬浮
菌体 ,在冰浴上进行超声波破碎 ,工作时间 2 s,间歇
15 s,功率 50 W ,全程 10 m in。破碎菌体离心 12 000
r/m in, 4℃, 25 m in,转移上清 ,用 B radford法测定蛋
白浓度后作 SDS2PAGE分析。
11217　W estern B lotting分析 　W estern B lotting参
照《分子克隆实验指南 》(第 3版 )。一抗使用组氨
酸标签 (H is2Tag)抗体 (晶美 )。蛋白样品为重组菌
生长到 OD600值约为 1. 5,在 1 mM /L IPTG于 28℃下
诱导 4、6和 8 h的蛋白样品。
11218　重组蛋白的纯化 　参照《分子克隆实验指
南 》(第 3版 )。按照重组蛋白表达的最佳诱导条件
进行扩大培养 ,培养规模为 1 L,诱导结束后进行离
心收集菌体 ,超声波破碎后离心转移蛋白上清液 ,加
入 30% ～70%硫酸铵进行分级分离。70%硫酸铵
沉淀用 5 m l缓冲液 A ( Tris2HCl(pH7. 4) 50 mM /L,
NaCl 0. 1 mM /L,乙二醇 10% , MgCl2 5 mM /L )溶
解。然后通过脱盐柱 ( SEPHADEX G225)脱盐。首
先用 1柱体积纯水洗柱 ,再上蛋白样品 ,用 1柱体积
结合缓冲液 B (磷酸钾盐缓冲液 20 mM /L pH 7. 4,
NaCl 0. 1 mM /L,乙二醇 10% )洗脱蛋白 ,收集蛋白
洗脱液。用 0. 45μm滤器过滤蛋白洗脱液 ,利用 1
m l H is2Trap HP (Amersham )柱纯化重组蛋白 ,操作
按说明书进行 ,首先用 5柱体积纯水洗柱 ,上过滤蛋
白洗脱液样品 ,用 5柱体积结合缓冲液 B洗出非特
异性结合的蛋白质 ,再用 5柱体积咪唑溶液 (磷酸
钾缓冲液 20 mM /L, NaCl 0. 1 mM /L,乙二醇 10% ,
50、100、200和 500 mM /L咪唑 )进行梯度洗脱 ,收
集每个梯度洗脱液 ,加 70%硫酸铵沉淀蛋白质。最
后用 5柱体积纯水和 20%乙醇洗柱。
11219　酶活检测　EHPS和 EPH I酶活性的测定参
照 Kato等 [ 14 ] 的方法进行。反应体系 ( 1 m l) : 50
mM /L磷酸缓冲液 (pH7. 5) , 2. 5 mM /L MgCl2 , 2. 5
mM /L R ibose 52P, 2. 5 mM /L NADP, 10 U PR I, 10 U
PGI, 10 U GDH, 10 U HPS或 10 U PH I及 100μg经
H is2Trap HP柱纯化的蛋白样品。反应体系在 30℃
预热 2～3 m in后 ,加入 50μl甲醛 (50 mM /L )启动
反应。一个活力单位对应 30℃时每分钟生成 1
μmol NADPH的酶量。活性 (U /mg) = (A /6. 22) ×
( l /B ) ×( l/C )。其中 A 是 ΔA340 nm , B 反应液中加
入的待测蛋白样品的量 , C是反应时间 , 6. 22是每
μM NADPH在 340 nm处吸光系数。
2　结果
211 　原核表达载体 pDEST172Ehp s和 pDEST172
Ephi的构建
pDEST172Ehp s和 pDEST172Ephi原核表达载体
的结构如图 1所示。在 Ehps的原核表达载体 (图 12
A)中和 Ephi的原核表达载体 (图 12B)中 ,目的基因
Ehps (0. 7 kb)和 Ephi (0. 9kb)的上游有 6个组氨酸
标签序列 , Ehps和 Ephi基因的表达受 T7启动子
控制。
T7. T7启动子 ; RBS. 核糖体结合位点 ; ATG. 起始密码子 ; 6′H is. 6
个组氨酸标签序列 ; attB1 and attB2. 入门 BP反应的两个特异附着位
点 ; T7 term. T7终止子 ; Amp. 氨苄青霉素抗性基因
图 1　Ehps( A)和 Eph i( B)原核表达载体结构示意图
利用 Gateway技术构建 Ehps和 Ephi的原核表
达载体 ,在 Gateway的 LR反应体系中使入门克隆质
粒 pENTR2Ehp s和 pENTR2Ephi 与目的载体 pD2
EST17发生重组 ,通过整合酶的作用把 Ehps和 Eph i
分别整合到 pDEST17中替换 ccdB 基因 ,获得重组
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质粒 pDEST172Ehp s和 pDEST172Ephi。从转化子菌
落中提取重组质粒 ,通过电泳检测重组质粒的分子
量 ,找出重组成功的质粒 pDEST172Ehp s (图 22A )和
pDEST172Ephi(图 22B ) ,利用 PCR 作进一步的检
测。以 pDEST172Ehp s质粒为模版用 attB1和 Ehp s3
引物进行 PCR扩增 , PCR产物经电泳检测有一条
0. 9 kb的目的条带 (图 22C) ,这说明目的基因 Ehps
已被整合到目的载体 pDEST17 中。以 pDEST172
Ephi质粒为模版用用 attB1和 Ephi3引物进行 PCR
扩增 , PCR产物经电泳检测有一条 1. 1 kb的目的条
带 (图 22D) ,这说明目的基因 Ephi已被整合到目的
载体 pDEST17中。 PCR和酶切检测正确的质粒被
送去作测序分析 ,测序结果显示 pDEST172Ehp s和
pDEST172Ephi的构建已成功。
(A ) pDEST172Ehp s质粒的电泳检测. 1～2. pDEST172Ehp s质粒 ;
3. pDEST17; (B) pDEST172Ephi质粒的电泳检测. 1～3. pDEST172
Ephi质粒 ; 4. pDEST17; ( C) pDEST172Ehp s质粒的 PCR检测. M.
DNA分子量 marker ( kb) ; 1～3: pDEST172Ehp s的 PCR扩增产物 ;
(D) pDEST172Ephi质粒的 PCR检测. 1～4. pDEST172Ephi的 PCR
产物 ; M. DNA分子量 marker ( kb)
图 2　Ehps( A)和 Eph i( B)原核表达载体的检测
212　重组蛋白表达的检测与表达条件的优化
用表达质粒 pDEST172Ehp s和 pDEST172Ephi转
化蛋白表达用宿主菌 E. coli BL21。用序列分析软
件预测重组蛋白 EHPS和 EPH I的分子量约为 19
kD,为了确定在 E. coli BL21中表达的重组蛋白的
真实分子量 ,利用识别组氨酸标签的抗体进行
W estern blot分析。挑选单菌落进行小规模 ( 2 m l)
培养便于优化重组蛋白表达的最佳条件 ,当重组菌
生长到 OD600值约为 1. 5时 ,加入 1. 0 mM /L IPTG诱
导重组蛋白的表达 ,诱导时间分别为 4、6和 8 h。然
后收集菌体 ,破碎细胞提取总蛋白进行 W estern blot
分析 ,结果说明 EHPS (图 32A )和 EPH I(图 32B )所
有的样品都有一条重组蛋白的信号带 ,重组蛋白
EHPS和 EPH I的分子量与预测的相似 , 大约为
19 kD。
1 - 3: 分别诱导 4, 6, 8小时的 EHPS样品 ; 4: 未经 IPTG诱导的
EHPS样品 ; 5: 未经 IPTG诱导的 EPH I样品 ; 6 - 8: 别诱导 4, 6, 8
小时的 EPH I样品.
图 3　EHPS( A)和 EPH I( B)重组
蛋白表达的 W estern分析
重组蛋白的表达量随诱导物浓度的不同而不
同 ,因此需要确定 IPTG的最适浓度 ,研究结果表明
用 0. 5、1. 0和 2. 0 mM /L IPTG诱导时 ,重组蛋白
EHPS (图 42A)和 EPH I(图 42B )表达量相同 ,故在后
面的试验中用 0. 5 mM /L的 IPTG来诱导重组蛋白
的表达。
M. 蛋白分子量 marker; 1～5. 分别用 2. 0, 1. 0, 0. 5, 0. 3 和 0. 1
mM IPTG诱导 6 h的 EHPS样品 ; 6. 未经 IPTG诱导的 EHPS样品 ;
7. 未经 IPTG诱导的 EPH I样品 ; 8～12. 分别用 0. 1, 0. 3, 0. 5, 1. 0
和 2. 0 mM IPTG诱导 6 h的 EPH I样品
图 4　EHPS( A)和 EPH I( B)重组蛋白
表达的诱导物 IPTG最适浓度的确定
重组蛋白的表达量也会随诱导时间的不同而不
同 ,因此当重组菌生长到 OD600值约为 1. 5,加入 0. 5
mM /L IPTG于 28℃在不同的时间段内诱导重组蛋
白的表达 ,确定重组蛋白表达的最佳时间。结果表
明重组蛋白 EHPS诱导表达量 6 h到达顶峰 ,重组
蛋白 EPH I诱导表达量 8 h到达顶峰 (图 5)。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
1. 从 Mycobacterium gastri MB19中纯化的 PH I蛋白样品 (阳性对
照 ) ; 2～5. 用 0. 5 mM IPTG分别诱导 10、8、6和 4 h的 EPH I样品 ;
6. 未经 IPTG诱导的 EPH I样品 ; 7. 蛋白 marker (分子量大小见图
4) ; 8～11. 用 0. 5 mM IPTG分别诱导 4、6、8和 10 h的 EHPS样品 ;
12. 从 Mycobacterium gastriMB19中纯化的 HPS蛋白 (阳性对照 )
图 5　EHPS和 EPH I重组蛋白表达最佳时间的确定
213　重组蛋白的纯化
按照优化条件进行扩大培养 ,将菌体培养体积
扩大到 1 L。诱导表达结束后 ,收集菌体 ,破碎离心
后得到可溶性蛋白。测定蛋白质的浓度 ,过 SEPH2
ADEX G225柱脱盐后利用亲和层析柱纯化重组蛋
白。由于重组蛋白带有组氨酸标签 ,所以我们用
H is2Trap HP镍柱纯化 EHPS和 EPH I的重组蛋白 ,
用不同浓度的咪唑溶液通过梯度洗脱洗出结合能力
不同的蛋白质 ,收集各个洗脱液 ,用 70%的硫酸铵
沉淀洗脱液中的蛋白质后作 SDS2PAGE分析 ,结果
说明大部分 EHPS(图 62A)和 EPH I(图 62B )的重组
蛋白均被 200 mM /L的咪唑溶液洗脱下来 ,样品中
同时还含有较多的其他杂质蛋白。由图 6可知用镍
柱只能初步纯化 EHPS和 EPH I的重组蛋白 , EHPS
的纯化程度大约为 40% , EPH I的纯化程度大约
为 20%。
1. 用 100 mM 咪唑洗脱的 EHPS样品 ; 2. 用 200 mM 咪唑洗脱的
EHPS样品 ; M. 蛋白 marker; 3. 用 100 mM咪唑洗脱的 EPH I样品 ;
4. 用 200 mM咪唑洗脱的 EPH I样品
图 6　EHSP( A)和 EPH I( B)重组蛋白的纯化
214　重组蛋白的酶活性检测
通过镍柱初步纯化了 EHPS和 EPH I的重组蛋
白 ,同时利用硫酸铵沉淀浓缩蛋白质 ,提高了 EHPS
和 EPH I的重组蛋白在纯化样品液中的浓度 ,这样
就可以进行 EHPS/EPH I酶活性测定。酶活性测定
的原理如图 72A所示。由于没有商业化供应 EHPS
的底物 52磷酸核酮糖 ,因此在该反应体系中起始底
物用 52磷酸核糖 ,通过 52磷酸核糖异构酶 , HPS,
PH I, 62磷酸葡萄糖异构酶及 62磷酸葡萄糖脱氢酶等
5个酶的偶联反应产生 NADPH,检测 NADPH的产
生量来测定 EHPS/EPH I的活性。测定结果如图 72
B所示 ,野生型大肠杆菌总蛋白、重组蛋白 EHPS/
EPH I、来源于 M ycobacterium gastri MB19 的 HPS/
PH I(甲基营养菌 )酶活性分别为 0. 016 U /mg, 0.
025 U /mg, 0. 09 U /mg。EHPS/EPH I重组蛋白酶活
性稍高于野生型大肠杆菌总蛋白酶活性 ,远低于源
于 M ycobacterium gastriMB19 HPS/PH I酶活性。
A. 酶活性测定原理 ; B. EHPS/EPH I蛋白活性
CK. 从 E. coli细胞提取的粗蛋白 ; 1. 通过组氨酸标签
纯化到的 EHPS/EPH I蛋白样品 ; 2. 从 M ycobacterium
gastri MB19中纯化到的 HPS/PH I蛋白 (阳性对照 )
图 7　重组蛋白 EHPS /EPH I的酶活测定
3　讨论
本研究用 PCR方法从大肠杆菌的基因组中扩
增 HPS和 PH I的同源序列 ( Ehps和 Ephi基因 ) ,成
功地构建了大肠杆菌 Ehps和 Ephi基因的原核表达
载体 pDEST172Ehp s 和 pDEST172Ephi, 确定了用
IPTG诱导重组蛋白 EHPS和 EPH I表达所需最适浓
度为 0. 5 mM /L,最适温度为 28℃,最佳时间分别为
8 h和 6 h。
用镍柱做的亲和层析只能初步纯化 EHPS/
EPH I重组蛋白 ,可能是由于 EHPS/EPH I蛋白与镍
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柱的结合能力不强 ,因而和很多非特异结合蛋白一
起被洗脱出来。试验结果说明来源于大肠杆菌的
EHPS/EPH I蛋白具有酶活性 ,但酶活性比从 M yco2
bacterium gastri MB19中纯化出来的 HPS/PH I低 2
倍。分析可能是以下原因造成 :第一 ,来源于大肠杆
菌的 EHPS/EPH I酶的比活力比 M ycobacterium gastri
MB19 HPS/PH I低 ;第二 ,用于测定酶活性的 EHPS/
EPH I蛋白样品的纯化程度低 ,样品中含有很多杂蛋
白 ,使 EHPS/EPH I蛋白的含量很低 ,所以测出来的
酶活性数值不高 ,因此得到高纯度的蛋白样品对酶
活性的测定很重要。
因为 Ru5P和 F6P分别是 HPS/PH I催化反应
的底物和产物 ,同时它们也是开尔文循环的中间产
物。研究结果表明把来自甲基营养菌 M ycobacterium
gastri MB19的 HPS和 PH I基因导入拟南芥和烟草
中 ,然后在叶片细胞的叶绿体中表达 ,就可以把微生
物的甲醛同化途径整合到植物的二氧化碳同化途径
中 ,通过光合作用直接同化甲醛。这两个基因在植
物中的过量表达增强了转基因植物对甲醛的抗性和
吸收气体和液体甲醛的能力 ,同位素追踪试验证明
(14C) HCHO可通过同化作用进入植物非挥发性的
成分中 [ 15, 16 ]。来源于大肠杆菌的 EHPS/EPH I重组
蛋白具有酶活性 ,因此我们将构建 EHPS和 EPH I基
因的植物表达载体 ,用于在转基因植物中构建光合
作用同化甲醛途径的遗传操作 ,探讨 EHPS/EPH I是
否能提高植物代谢甲醛的能力。
参 考 文 献
1　 Feldman MY. Prog Nucleic Acid ResMol B iol, 1973, 13: 1～49.
2　 D ijkhuizen L, Levering PR, V ries D. In: B iotechnology Hand2
books, Eds. New York: Plenum Publishing Co, 1992.
3　 Ferenci T, Strome T, Quayle JR. B iochem J, 1974, 144 (3) : 477
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5　 Ferenci T, Strome T, Quayle JR. B iochem J, 1974, 144 (3) : 477
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