全 文 ：收稿日期：2008-05-09
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目（2006BAD01A03），山东省优秀中青年科学家科研奖励基金（02BS025）
作者简介：孙翠霞，硕士生，研究方向：玉米遗传育种与分子生物技术
通讯作者：王泽立，男，博士，教授；Tel：0538-8221652，E-mail：wangzeli@sdau.edu.con
选育雄性不育材料是广泛应用杂种优势的重要前提之一。用雄性不育系作母本实施制种，不仅可以免
去人工去雄的操作环节，节省成本，而且可大大提高杂交种子的纯度，最大限度地释放杂种优势潜能。玉米
S 型 CMS 是 3 种不育类型中最大的一组，但具有育性不稳定的特点。为了最大限度地发掘和使用这一遗传
资源，围绕 CMS-S 已开展了许多分子生物学研究。 涉及范畴主要集中在育性恢复基因 Rf* 的定位、克隆、相
关线粒体 DNA 多样性、组织特异性和 R 区转录等基因组学方面 [1~4 ]；而与其相关的蛋白质学研究国内尚未
见报道。 鉴于蛋白质是基因表达的产物，更是生物体内许多生理功能的执行者。 分离和鉴定不同基因型的
材料、不同发育阶段、不同组织细胞内的特异蛋白质是直接认识基因功能的重要途径。而且，利用功能基因
产物——蛋白质进行基因分离的方法， 也将在蛋白微量测序的成功与寡核苷酸化学合成的高度自动化下
成为分离相关基因的有效方法，并一直是国内外学者普遍关注的热点之一 [5~10]。
优化玉米 CMS-S双向电泳体系与差异蛋白比较
孙翠霞 1 扬会 2 李萌 1 祝静静 1 郭晓红 李新征 1 王泽立 1
（1山东农业大学生命科学院，泰安 271018；2中国农业大学国家玉米改良中心，北京 100094）
摘 要： 利用自主创建的Rf3近等基因系不育群体（Ps）和可育恢复系群体（Pf）为试材，采用改进的双向（二维）聚
丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）技术，对苗期、成株期叶片细胞总蛋白进行分析，分离到在Pf遗传背景下一特异蛋白质
RRPⅥ，分子量为30.8kD，等电点为5.0，该特异蛋白质点的出现与消失可能与玉米CMS-S的育性恢复有一定关系，对其
纯化分离将为Rf3基因的克隆奠定基础和进一步了解玉米质核互作不育表达模式的分子机制。讨论了采用2D-PAGE技
术在玉米分子生物学研究中的优化以及基因组学与蛋白组学研究的衔接。
关键词： 玉米S型雄性不育系 Rf3近等基因系 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 30.8kD特异蛋白质RRPⅥ
Optimization of 2D-PAGE System and Comparison of Differential
Proteins Pattern in Rf3 NILs CMS-S Maize
Sun Cuixia1 Yang Hui2 L Meng1 Zhu jingjing1 Guo Xiaohong Li Xinzheng1 Wang Zeli1
（1College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Taian 271018；2National Maize Improvement Center of China，
China Agricultural University，Beijing 100094）
Abstract： The near isogenic lines Psand Pf，were developed by anther，which serves as materials for isolating and
cloningRf3 gene by using of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis（2D-PAGE) that was improved in this
study.This study was therefore undertaken to optimize 2D-PAGE system to determ ne normal 2D pattern of protein in
Rf3 near isogenic line（NILs) in CMS-S maize.The results showed that there was a special protein RRPⅥ（MW 30.8kD，
pI 5.0) in leaves of Pfduring the period of the meiosis of pollen mother cell. The existence and disappearance of this
protein spot may relate to the fertility restoration in CMS-S maize. The furthe is lation and purification of this protein
could be beneficial to cloneRf3 gene and discover the molecular mechanism of fertility expressional model.Using the 2D-
PAGE system trends and directions of the joint studies，both genomics and proteomics were discussed.
Key words： Male-sterile S-cytoplasm（CMS-S) male maize Near isogenic lines Two-dim sional polyacrylamide
gel electrophoresis（2D-PAGE) 30.8kD special protein RRPⅥ subunit
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
Von Wiren 等（1997）用 2D-PAGE 评价了玉米突变型和野生型的蛋白质差别 ，初步确定了两者在铁离
子跨膜蛋白中的 4 个差异蛋白质点；Damerval 和 Guilloux（1998)则利用 2D- PAGE 图谱，从酶学角度证明了
Opaque 2（O2）玉米是由于转录因子点突变引起的蛋白质效应，并初步解析了调蛋白与蛋白质的差别，对玉
米品质的影响；Cheng 等（2000）通过双向凝胶电泳分析了 35S-Met 的摄入量对玉米缺氧和低氧下根内蛋白
质的合成，结果表明了蛋白质表达的选择性对玉米发育的影响；Okamoto 等（2004）采用双向凝胶电泳和质
谱技术鉴别玉米卵母细胞中的蛋白质组分，在鉴定了 6 个已知功能蛋白后，结果表明，玉米代谢中的几种
蛋白酶的表达水平在卵母细胞中高于早期培育 。 同样指出了特意蛋白表达的生理意义 ；Hohholdinger 等
（2004）应用 2D-PAGE 方法对玉米侧根生长缺陷突变体与野生型根蛋白质进行比较分析，在检测到的表达
差异蛋白点中，经质谱和数据库检索比较认为，4 个蛋白质为木质素代谢相关的蛋白。
因此，旨在从蛋白质学的角度优化双向电泳图谱 2D-PAGE，比较近等基因系的不育系 （Ps）和恢复系
（Pf）叶片组织的蛋白质的差异，以期找到与细胞质雄性不育相关的蛋白质，为阐明细胞质雄性不育机制提
供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
将近等基因系的恢复系 Pf（原代号 FA12）和近等基因系的主育系 Ps（原代号 SA12），分别田间种植不少
于 100 株的群体，于抽雄前一周 30 株为一样本组，取雄穗下第 1 叶片，剔除叶脉后混合冲洗，液氮冷冻，
-80℃保存，供提取蛋白质用。此时镜检花粉粒发育值单核靠边期者为 60%。另一组为培养箱中沙培上述材
料至两叶一心的黄化苗用于蛋白质提取。
1.2 试验方法与步骤
1.2.1 叶片全蛋白丙酮干粉的制备 参照《分子克隆手册》 [11]方法进行并做改进：取雄穗下第 1 片全展功
能叶，剔除叶脉，准确称取 6g 新鲜叶片，剪碎后在液氮中充分研磨至细粉状，样品研磨时加入不溶性聚乙
烯吡咯烷酮 PVP；待液氮稍挥发后，将粉末转入 50ml 离心管中，按 1/4（g/ml）的比例加入 10%丙酮-TCA 溶
液，充分振荡混匀后，置于-20℃放置 2h 以上；4℃，15 000r/min，离心 20min 后弃上清；沉淀用冷丙酮振荡洗
涤，脱去脂肪和色素杂质，-20℃放置 1h 后离心（同步聚 3）；沉淀洗涤、离心，重复 2~3 次，尽量去除叶片色
素及酯类等杂质，至样品呈黄白色；沉淀于-20℃放置 3h 以上，以挥发除去丙酮。 冷冻真空干燥，制成叶片
全蛋白丙酮干粉，置于-20℃保存备用。
1.2.2 蛋白质提取 称取蛋白丙酮干粉 25mg，以 1/25（mg/μl）的比例加入样品提取液 lysis Buffer，涡旋振
荡，使样品充分分散于样品提取液中，37℃水浴保温 2h；16 000r/min，室温离心 20min，取上清；按照样品：丙
酮 1：4 的体积比，加入丙酮后充分混匀，室温放置 30~60min，沉淀蛋白质；16 000r/min，室温离心 20min，弃
上清，尽可能去除丙酮 ；待丙酮挥发后 ，加入适量样品提取缓冲液 ，对蛋白质沉淀进行复溶 ，充分混匀后
37℃水浴保温 30min；16 000r/min，室温离心 20min，取上清用于测定蛋白质浓度并进行等电聚焦（IEF）电泳
分析。
1.2.3 蛋白质样品的浓度测定 用考马斯亮兰（CBBR G-250）染色法测定蛋白质样品浓度，步骤如为配制
5x 考马斯亮兰染色液 ； 原液用 ddH2O 分别稀释不同倍后取样释稀样品各 10μl， 再加 ddH2O 和 200μl5x
CBBR G-250 染色液，在 2min～1h 内测定 OD595，对照使用 10μlddH2O；根据所测数值绘制标准曲线 ；蛋白质
浓度测定为，取蛋白样品进行适当稀释，同上测定 OD595 值，根据标准曲线计算蛋白浓度。
1.2.4 蛋白质聚丙烯酰胺双向凝胶电泳（IEF-SDS-PAGE）分析 第 1 向为等电聚焦电泳（IEF-PAGE）制备
IEF 胶。 10ml 聚丙烯酰胺凝胶溶液中含 5.0g 尿素，2ml ddH2O，2ml10% NP-40，1.33ml30% Acr-Bis 母液，3 种
pH 梯度的两性载体电解质，加入 10μl10%过硫酸铵后充分混匀，抽气 5~10min 后加入 5μlTEMED；稍混匀
后立即灌胶 ，胶长 11.5cm，直径 1.5mm，灌灌好后用 8mol 尿素 15μl 或 ddH2O 封于胶面 （约 30min 完成聚
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2008年第 6期
胶），放置一段时间后可用于电泳检测；待胶凝好后，除去封于胶面的溶液，安装好电泳装置，每管取 100μl
蛋白样品上样；上样后覆以样品保护液（或用样品提取缓冲液）约 15μl；分别预电泳和正式电泳后，取出胶
条，用 12.5%TCA 固定约 10min 后，ddH2O 洗涤 2 次至胶条透明，吸干 ddH2O（此时可观察到蛋白质条带），
-20℃保存备用。
第 2 向为 SDS-PAGE 胶电泳。 提前一夜灌灌制分离胶，胶灌制好后，用 ddH2O 封于胶面，老化备用，次
日配制浓缩胶。 凝胶溶液混匀后抽气 10min，然后加入 20μl TEMED，灌制浓缩胶，用 ddH2O 封于胶面；胶凝
好后放置 30min 1h 方可使用；取第 1 向 IEF 胶条，待解冻后于平衡液中平衡，更换平衡液，每次约 5min。 固
定胶条，灌入电极缓冲液后，电泳至溴酚蓝泳动到胶板尽端，然后置摇床上缓摇。
1.2.5 硝酸银法蛋白质染色 胶板在固定液中固定足够长时间 （30min~1h）后，用双蒸水稍微漂洗 1min，
再于浸泡中浸泡 30min 以上，必要时更换浸泡液；用双蒸水漂洗胶板 3 次，每次 5min；弃去双蒸水，加入银
染液，缓慢摇动染色 30min；弃去银染液，用双蒸水漂洗 2min，加入显色液，轻微摇动直至出现蛋白后，弃去
银染液，加入终止液，将胶板置于保存液中保存。
1.2.6 干胶的制备与保存 染色后的胶板于浸泡液中浸泡 24~48h，在摇床上轻轻摇动并更换 2~3 次浸泡
液，以除去胶中的 SDS。 将胶板转入保存液中于摇床上摇动 3~4h 后，取适当大小的玻璃纸用保存液浸润
后，在玻璃板上将胶板用润好的上下 2 层玻璃纸包被，赶去气泡，封好置于室温下自然晾干。
1.2.7 第 2 向电泳后的考马斯亮兰 R-250 染色 先将电泳胶板于固定液中固定 30min， 再于染色液中摇
动染色 4h 以上，转移至脱色液中摇动脱色，中间更换脱色液，至胶板背景无色。在回收特异蛋白质时，电泳
只进行考马斯亮兰染色，不进行银染。
1.2.8 特异蛋白质分子量的测定 取特异蛋白点及其周围的凝胶，放入透析袋中，在 SDS-PAGE 电泳缓冲
液中，用水平式电泳槽进行电泳洗脱；收集洗脱液，再次进行透析，透析结束后，将透析液在低温冰箱中放
置一段时间后，于冷冻干燥仪中进行真空冷冻干燥至适当体积进行平板状 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量，
上样前沸水浴 3~5min 以变性蛋白质。电泳结束后，用标尺测量溴酚兰和各种标准蛋白质的迁移距离。将溴
酚兰迁移的距离定为 dl，蛋白质迁移的距离定为 d2，根据如下公式计算各种蛋白质的相对迁移率 Rf=d2/d1；
以标准蛋白质的相对迁移率 Rf 为横坐标，以标准蛋白质分子量对数 LogMW 为纵坐标，计算线性回归方程
和蛋白质的分子量，绘制实验标准曲线用以测定特异蛋白质的分子量（分子量标准为 Promega 公司产品）。
1.2.9 特异蛋白质等电点的测定 在对叶片蛋白质丙酮干粉进行第 1 向等电聚焦分析的同时， 用等电点
标准蛋白单独上样。电泳结束后取下胶条，银染或考马斯亮兰染色。以蛋白质迁移距离为横坐标，等电点为
纵坐标，绘制等电点标准曲线，计算回归方程和特异蛋白的等电点（等电点标准蛋白为 Pharmacia 公司产
品）。
2 结果与分析
2.1 玉米 CMS-S NILS 的 SDS-PAGE 分析
对玉米 CMS-S 的近等基因系 Pf 和 Ps 进行了黄化苗和成株期叶片的 2 次采样，并对同一批次的材料进
行了多次重复实验表明，银染后的整个电泳图谱上可以观察到 100 个左右的蛋白质斑点，分离效果较好，
具有很高的分辨率和较好的重复性。经分析，这些蛋白质斑点可分为 2 类：一类是显示深浅的不同，这一现
象在黄花苗期取样中较多；二类是斑点的有无，这一现象在成株期居多。
经分析，这些蛋白斑点的差别可源于 2 种：一是遗传背景的差异，即近等基因系（NILs）Pf 和 Ps 在基因
组层面上的结构、序列及位点等的遗传差异在转录翻译过程中造成的；二是与育性表达密切相关的蛋白质
在翻译过程中形成特异大分子的差异。 利用目前的设备和条件，依照研究目的，在尝试建立玉米叶片全蛋
白相对稳定的双向电泳体系后，将上述 2 类蛋白质反复筛选和重复验证，取得了良好的效果。
如图 1A、B 所示，玉米 Ps 和 Pf 的蛋白质等电聚焦（IEF）和平板 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
孙翠霞等：优化玉米 CMS-S双向电泳体系与差异蛋白比较 93
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
后，通过 MElAN IE 3 胶分析软件，将 Ps 和 Pf 的电泳图谱迭合发
现，抽雄后散粉前的成株叶片蛋白质动态存在明显差异 ，Ps（近
等基因系 NILs 之一的不育系 ，不育株）在二维蛋白质电泳图像
中的相对位置没有蛋白点的表达，与之相反，在 Pf（近等基因系
NILs 之一的恢复系， 可育） 则检测到表达量明显的一蛋白质斑
点 ，暂命名为 RRPⅥ。 显然 ，此蛋白点与玉米 CMS-S 的育性相
关，即在不育条件下，核基因为 rf3 时这一蛋白质存在；而在可育
条件下，这一蛋白质消失。 从遗传发育学的角度看，有理由认为
RRPⅥ可能是导致 CMS-S 中 Rf3 育性恢复转换的 “初始 ”因子 ，
而且很可能是核不育基因转录表达后， 引起其它基因转录模式
发生改变的产物。在一定程度上也说明，玉米生殖生长期这一特
异蛋白对幼雄穗或者后期哺乳组织绒毡层的发育可能有重要影
响。
2.2 特异蛋白质分子量（MW）及等电点（pI）测定
为了进一步定性在不育条件下表达可育条件下消失的特异
蛋白质 RRPⅥ，为分离纯化测序奠定基础，对 RRPⅥ进行了 MW 和 pI 测定。 首先，依据蛋白质分子量对数
及其在 SDS-PAGE 胶中电泳的相对迁移率的对应关系， 运用 Microsoft Excel 软件绘制蛋白质分子量标准
曲线 （图 2）并计算得到线性回归方程为 ：y=-0.875x+5.0021，测定某蛋白质点的迁移率后计算该蛋白质的
分子量；根据标准蛋白等电点与 IEF 电泳后标准蛋白质距阴极的迁移率之间的对应关系 ，绘制等电点
标准曲线 （图 3 ） ，得到线性回归方程为 ：y= -0.7794x+11.676，根据某蛋白质条带的迁移率计算核蛋白质
的等电点后，依次带入回归方程得：RRPⅡ特异蛋白质的分子量为 25.2kD，等电点为 5.0，计算后的蛋白质
分子量与实验室先前同类分子量标样吻合（图 1 左示）。

图 1 抽雄前 Ps（图 A 版）及 Pf（图 B 版）倒
第 1 叶全叶片的双向电泳图谱
箭头所示为特异蛋白质点 RRPⅥ， 第一向分离
胶 pH 变化范围从左至右为 11 至 6，SDS-PAGE
胶浓度为 12.5%，左为分子量
5
4.9
4.8，
4.7 ·
4.6
4.5
4.4
4.3
4.2
4.1
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Rf

 
 


10
9· ·
8
7
6
5
4
3
2 4 6 8 10
D(cm)

 
 PI

图 2 蛋白质分子量标准曲线图 图 3 蛋白质等电点标准曲线图
由于封闭现象限制，本试验未能给出 N-端测序。
2.3 双向电泳体系改进
以 2001 年版《分子克隆手册》中的方法为基础，同时综合了其它作物的分离技巧，建立了一套适合玉
米叶片蛋白质提取及电泳分析技术，效果良好。这些改良技术主要包括：（1）液氮研磨叶片前加入起保护作
用的不溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；（2）用较高浓度的 NaOH 和 SDS 以溶解膜蛋白和降低酶活性；（3）离心
后的上清多次用冷丙酮抽提以纯净蛋白样品并避免 IEF 胶条孔径不被阻而影响分离；（4）适当提高电泳时
的伏特——小时数以增加聚焦效果，消除第 2 向蛋白质的横向拖尾；（5）严格限时 IEF 胶条转移至第 2 向
胶之前的平衡次数（2 次），每次 20min，克服了蛋白质点的扩散；（6）银染显色前胶板的洗涤时间应控制在
30s 内以避免蛋白质点丢失等。
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2008年第 6期
3 讨论
在以前的研究中，曾构建了 CMS-S 型 Rf3/rf3 的近等基因系 [3，4]，并用 AFLP，RFLP 技术筛选到与标准恢复
基因 Rf3 紧密连锁（＜2.0cM）的分子标记 RR6 定位于玉米第 2 染色体的长臂上。 同时实现了 RAPD 标记向
SCAR 标记的转换，对 Rf3 基因实施了分子标记辅助选择（MAS）。 此后的研究中，也曾采用 mRNA 差别显示
技术和以 SSR 标记为主的图位克隆，试图分离 Rf3 及其相关基因（未发表资料），但效果不尽人意。 其原因
可能首先是玉米基因组庞大，80%以上为重复序列，基因富集区、间隔区、结构区及转座、逆转座、重排、易
位等现象严重，目前的技术水平尚不能有效地剖析这些现象；其次，CMS-S 不仅受核基因系统的制约，亦受
控于胞质系统线粒体和叶绿体等细胞器的影响， 这无疑增加了克隆 Rf3 等恢复基因的难度。 同时， 有关
CMS-S 型玉米线粒体 DNA R 区开放阅读框架（ORF）的多样性、多型性和组织特异性等研究取得了一定进
展，但要达到最终克隆 Rf3 基因尚有距离。 该试验采用上述近等基因系，用 2D-PAGE 技术获取了差异蛋白
质点 RRPⅡ。在总遗传背景相似性极高的近等基因系中，少量特异蛋白的作用，无论在质核互作、线粒体基
因重组及信号传导等网络中，极有可能引起基因转录与翻译模式的改变，最终导致可育与不育态的出现，
这一研究结果与他人在其它作物的实验相类似 [8，15~18，]。
迄今为止，电泳是分析蛋白质及多肽组分理化性质最灵敏的方法之一。 双向电泳将 IEF 和 SDS-PAGE
相结合，依据 MW 和 PI 分离蛋白具有很高的分辨率，但对高等植物绿色组织的蛋白质质电泳具有相当大
的困难。 因为成熟叶片中存在大量的酚、醌类及色素类物质，可通过氢键与蛋白质结合而干扰蛋白质的电
泳行为。 特别是由于玉米是喜温 C4 植物，植株发育快，个体高大，纤维类等高分子化合物及次生代谢物的
合成、降解、速度快、强度大，因此蛋白质分析难度大。所以，实验条件必须严格控制，精细分析，才能获得重
复性好的效果。
随着植物基因组计划的不断推进，亦显现出它的某些局限性。 其中，许多植物基因组 ORF 还很难全部
确定，如大量存在的与任何已知蛋白质缺乏同源性的 ORF；已确定的 ORF 基因表达与否及其。 机制如何，
正是局限性的客观表现 [12，15~17]。 近年来，基因芯片类技术的出现为定性、定量、高通量检测基因的表达产物
mRNA 提供了契机，但由于 mRNA 在储存、转运、降解等方面的自身特点，其翻译过程还受到精细调控以及
产物的翻译后加工等影响，难以准确反映基因终产物蛋白质的质和量。 因此，蛋白组学（proteomics）的出现
应该是期待中的事，本试验试图将玉米 CMS-S 的研究从基因（组）方面推进到蛋白质（组）领域，亦是为了
寻求对此研究有所助益。 限于的试验条件，在定性了 RRPⅡ蛋白后，对其进行了分离纯化，以图从 RRPⅡ
入手分离克隆 Rf3/rf3 与其发育的基因，此外，由于纯化的 RRPⅡ蛋白质量少，不足以进行测序分析 ，加之
N-端封闭现象严重而无法完整测序。因此，如何从大批量纯化特异蛋白、制备抗体、微测序和质谱手段等方
面入手加以克服，目前尚在确认和深入研究之中。
蛋白组学的核心技术仍是双向电泳和生物质谱。 结合本研究，优化了适合玉米的 2D-PAGE 技术，并认
为蛋白质测序技术改进应是促进蛋白组学发展的重要环节。如能有对等电点 1～10 的蛋白样品量连续测定
几十个残基的气相自动化测序仪，对低分子量蛋白图谱识别的蛋白质系统开发，电喷雾质谱（ESI-MS）和固
相化梯度等技术的发明与完善等，必将对玉米基因组学和蛋白组学研究产生积极影响。但对低丰度蛋白质
点的检测、极酸和极碱性蛋白质的提取、高分子质量区蛋白的分离、膜蛋白的提取和有效分离等仍是二维
电泳技术需解决的难题
筛选和寻找玉米 CMS-S 型不育系与恢复系表现型引起的 2 个样本 （一对近等基因系） 之间的差异蛋
白质谱，得到在可育样本下存在的蛋白质点，可初步认为该蛋白的存在与消失可能与 CMS-S 玉米的育性
恢复有关。 但是，差异蛋白质与细胞质雄性不育关系的深入研究，尚有待于相关技术的不断改进和玉米蛋
白质组学基础研究的进一部拓展。
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