全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
高温放线菌莱斯氏属 RHA1 菌株产低分子量
α-淀粉酶的初步研究
朱国东 陈波 张兰兰 季秀玲 魏云林 林连兵
(昆明理工大学生物工程技术研究中心，昆明 650224)
摘 要: 嗜热放线菌莱斯氏属 RHA1 菌株发酵液经过(NH4)2 SO4(饱和度为 60%)沉淀后，经过分子筛层析纯化获得一
种低分子量 α-淀粉酶，分子量为 11. 2 kD。对此酶研究表明，其 pH值范围为 4. 5 － 11. 5，在 pH 值为 5. 5 － 6. 5 之间酶活性较
高，最大酶活性的 pH值为 6. 0;此酶在缺乏 Ca2 +时，最适温度为 55 － 60℃，当加入 Ca2 +后，相对最适温度上升至 65℃;然而
EDTA(10 mmol /L)可使此酶的酶活性降低 98%，同样在 Ni2 +、Ag2 +和 Fe2 +条件下酶活性也受到干扰;此 α-淀粉酶具有淀粉内
切酶活性，水解直链淀粉和支链淀粉的主要产物为小分子低聚糖(D2 － D3)。
关键词: 嗜热放线菌 莱斯氏属 小分子量 α-淀粉酶 酶学特征
Purification and Characterization of a Novel Low Molecular Weight
α-amylase from Thermophilic actinomycete Strain Laceyella sp． RHA1
Zhu Guodong Chen Bo Zhang Lanlan Ji Xiuling Wei Yunlin Lin Lianbing
(Biotechnology Research Center，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650224)
Abstract: An α-amylase with low molecular weight was purified from a thermophilic actinomycete strain Laceyella sp． RHA1． The
α-amylase could be purified in one step using size-exclusion chromatography after concentrating of crude enzyme by salting out with
(NH4)2 SO4(60% saturation)． The purified alpha-amylase had a molecular weight of 11. 2 kD，which is the lowest one among alpha-
amylases． This enzyme had high activity in a pH range from 5. 5 to 6. 5，with optimum at 6. 0． It was stable in a wide pH range between
4. 5 and 11. 5． The optimum temperature of enzyme activity was 55 － 60℃ in the absence of Ca2 + ． In the presence of Ca2 +，the optimum
temperature shifted to 65℃ ． Ca2 + could enhance the activity and stability of the enzyme，however，98% of the activity lost in the pres-
ence of EDTA(10 mmol /L)． Ni2 +，Ag2 + and Fe2 + severely inhibited the enzymes activity indicating the role of sulfydryl group in catal-
ysis． This alpha-amylase displayed an endolytic activity and small maltooligosaccharides(D2 － D3)were formed predominantly when sol-
uble starch and amylopectin were used as substrates．
Key words: Thermophilic actinomycete Laceyella sp． Low molecular weight α-amylase Enzymatic properties
．
收稿日期:2011-03-29
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30660009，30960022)
作者简介:朱国东，男，硕士研究生，研究方向:嗜极微生物;E-mail:zhuguodong7893298@ yeah． net
通讯作者:林连兵，男，副教授，研究方向:嗜极微生物;E-mail:linlb@ sohu． com
α-淀粉酶主要催化断开淀粉中 α-1，4 糖苷键，
并具有淀粉的液化和糖化作用，至此广泛应用于纺
织品的脱浆工艺和烘培工业等［1］。淀粉酶常见于
真细菌、古细菌和真核生物中［2］，而处于真菌及细
菌间的放线菌中，大多数淀粉酶来自常温放线菌，仅
有少数淀粉酶是通过嗜热放线菌分泌得来［3 － 5］。另
外放线菌分布广泛，能形成不同的菌丝体［2］，由其
产生的淀粉酶可作为商业应用酶与抗生素等资源。
至目前研究发现产生淀粉酶的嗜热放线菌包括热紫
链霉菌、弯曲高温单胞菌、普通高温放线菌和嗜热单
孢菌［6 － 9］。来自热紫链霉菌 CUB74 编码耐热性的
胞外 α-淀粉酶基因已被克隆到大肠杆菌 JM107 中
进行表达，此重组酶在 CaCl2存在的条件下 70℃仍
具有活性，表现出高度耐热性［10］。通过对高温放线
菌属 R-47 菌株［5，7，11 － 15］的研究表明，此放线菌能产
生两种 α-淀粉酶:TVAI(637 个氨基酸，MW = 71
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
kD)和 TVAII(585个氨基酸，MW =67. 5 kD)［9，13 －19］，通
过 TVAI 和 TVAII 酶的突变，探索这两种酶的催化
机制［20 － 22］。
本研究从分离自中国云南省腾冲热泉(55℃)嗜热
放线菌莱斯氏属 RHA1菌株发酵液中纯化获得一种低
分子量 α-淀粉酶，并对其酶活性特征进行初步研究。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 培养基 液体培养基(mg):NaCl 8，Na2HPO4
111，MgSO4·7H2O 100，KNO3 103，NaNO3 689，Na2MoO4
·2H2O 0. 025，FeCl3 0. 28，CuSO4 0. 016，MnSO4·H2O
2. 2，H3BO3 0. 5，ZnSO4·7H2O 0. 5，CoCl2·6H2O 0. 046，
CaSO4·H2O 60，ddH2O 1 000 mL，氮三乙酸 100，胰蛋
白胨 1 000，酵母膏1 000，pH 为 7. 8。配制固体培养
基时，在每升液体培养基中加入 40 g琼脂，培养基在
121℃灭菌 20 min。
1. 1. 2 菌株 RHA1 菌株由本实验室保存，其分离
自腾冲热海热泉(55℃，pH6. 5) ，菌落呈白色，菌体
革兰氏阳性，孢子的表面有脊，菌株生长温度为30 －
65℃，最适生长温度为 50℃，最适 pH 值为 7. 0。其
16S rRNA 基因序列(FJ422144)与莱斯氏属 16S
rRNA相似性达到 99%，鉴定为莱斯氏属菌株，该菌
株具有产淀粉酶能力。
1. 2 方法
1. 2. 1 淀粉酶活性及蛋白质含量测定 淀粉酶活
性测定方法如下:用 0. 1 mol /L Na2 HPO4-NaH2 PO4
缓冲液(pH6. 0)配制 1%可溶淀粉溶液，取 0. 5 mL
此溶液和 0. 1 mL的淀粉酶溶液在 50℃反应 30 min
后，煮沸 5 min以终止反应，后采用 3，5-二硝基水杨
酸试剂检测淀粉水解产物量(DNS法)。1 U酶活力
定义为在此试验条件下每分钟释放 1 μmol /L 还原
糖(如葡萄糖)所需的酶量。淀粉酶比活性指在每
毫克蛋白质中所含的酶活单位。
蛋白质含量的测定方法参考 Lowry测定法。
1. 2. 2 淀粉酶的纯化 菌株接种到液体培养基中，于
50℃、140 r /min振荡培养 48 h 后，在 4℃，7 500 r /min
离心 15 min 去除菌体，取上清液作为粗酶液。5 L
初酶液通过 10 000 MW(Millipore Vivoflow，USA)超
滤浓缩成 200 mL后，在此浓缩液中加入固体硫酸铵
至饱和度为 60%，4℃搅拌过夜，通过 9 300 r /min，
4℃离心 20 min 收集沉淀，沉淀溶解于 0. 1 mol /L
Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中(pH6. 0)获得酶液，再
用同样的缓冲液在 4℃对酶液进行透析。透析后的
酶液用 KTATM纯化系统通过 SuperdexTM G-75(Tri-
corn，Sweden)分子筛进行分离纯化，以下试验均采
用纯化获得的淀粉酶为样品进行。
1. 2. 3 变性及非变性凝胶电泳 采用不连续 SDS-
PAGE电泳(浓缩胶 5%，分离胶 13%，恒压 120 V)
对酶的分离纯化效果及分子量进行分析。酶活性通
过 Native-PAGE 进行分析，非变性电泳的凝胶用
Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH6. 0)冲洗后，放到含
1. 0%可溶性淀粉琼脂凝胶表面上，于 50℃温育3 h，
再在琼脂凝胶表面倾倒 I2-KI 溶液，被淀粉酶水解
的部分染色时将有透明水解区域。
1. 2. 4 淀粉酶的最适温度和热稳定性 参照以上
酶活测定方法及酶反应体系组成，反应物包括
0. 5 mL用 0. 1 mol /L Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液
(pH6. 0)配制的 1%的可溶淀粉溶液(添加或不添
加 10 mmol /L Ca2 +)以及 0. 05 mL 淀粉酶溶液。将
反应物在不同的温度下温育 30 min 后，通过 3，5-二
硝基水杨酸法进行淀粉水解产物量测定，评价淀粉
酶的最适催化温度。
酶的热稳定性是通过将淀粉酶溶液(添加或不
添加 10 mmol /L Ca2 +)在 10 － 60℃不同温度下温育
1 h后，按淀粉酶酶活测定方法测定其剩余的淀粉
酶活性，评价其热稳定性。
1. 2. 5 pH 值对淀粉酶活性及稳定性的影响 将
0. 05 mL 淀粉酶溶液加入 0. 5 mL pH 值在 3. 0 －
10. 0 之间、含 1%的可溶淀粉的缓冲液中，其缓冲液
包括 0. 1 mol /L citrate-Na2HPO4 缓冲液(pH3. 0 －
5. 5) ，0. 1 mol /L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH5. 5
－ 7. 5) ，Tris-HCl(pH7. 5 － 9. 0)glycine-NaOH 缓冲
液(pH9. 0 － 10. 0) ，于 50℃反应 30 min，通过 3，5-
二硝基水杨酸法进行淀粉水解产物量测定，评价淀
粉酶的最适催化 pH值。
淀粉酶在不同 pH值的活性通过将 0. 05 mL 酶
液分别加入 pH 值从 3. 0 － 10. 0 的缓冲液中，在
20℃温育 1 h后，通过 DNS法测定酶的活力。
1. 2. 6 钙离子浓度对淀粉酶活性及稳定性的影响
Ca2 +对淀粉酶活性的影响测定方法:通过向淀粉
002
2011 年第 10 期 朱国东等:高温放线菌莱斯氏属 RHA1 菌株产低分子量 α-淀粉酶的初步研究
酶溶液中添加 0 － 50 mmol /L 不同浓度的 Ca2 +后，
测定淀粉酶活力的变化。
Ca2 +对酶稳定性的影响的测定方法:将淀粉酶溶
液加入到含有不同浓度的 CaCl2 的 0. 1 mol /L
Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液中(pH6. 0，0 － 30 mmol /L
CaCl2) ，于 70℃温育 10 min后，将反应液立即放置冰
上，然后通过 DNS法测定酶的活力测定酶的活力。
1. 2. 7 金属离子和蛋白抑制剂对淀粉酶活性的影
响 在酶液中分别加入不同金属离子(Co2 +、Ba2 +、
Ag +、Mg2 +、K +、Ca2 +、Cd2 +、Ni2 +、Zn2 +、Mn2 +、Fe2 +
和 Fe3 +) ，使金属离子的浓度达到 1 mmol /L，经
30℃温育 1 h 后，分别测定各酶液的酶活性。蛋白
抑制剂(EDTA、PMSF、SDS、Urea、DNSO、乙醇和甲
醇)对淀粉酶活性的影响通过把抑制剂分别加入酶
液中，在 30℃温育 30 min 后，分别测定各酶液的酶
活性(对照不加金属离子及蛋白抑制剂)。
1. 2. 8 底物的降解 将可溶性淀粉、直链淀粉和支
链淀粉分别溶解在 0. 1 mol /L Na2HPO4-NaH2PO4缓
冲液(pH6. 0)中，加入酶液后在 55℃培养 1 h 后，产
物通过薄层色谱分离(Silica gel 60，MERCK，Germa-
ny) ，展层体系为 n-丁醇-吡啶-水(6∶ 4∶ 3) ，然后通过
含 2. 0%(W/V)二苯胺的丙酮、2. 0%(W/V)的苯
胺的丙酮和 85%(W/V)的磷酸(5∶ 5∶ 1，V /V /V)的
溶液进行显色检测。
2 结果
2. 1 淀粉酶的纯化
RHA1 菌株的淀粉酶为诱导酶，当底物没有可
溶性淀粉时上清中不能检测到淀粉酶活性。淀粉酶
纯化步骤如表 1 所示。在 SuperdexTM G-75 层析柱
中用 0. 1 mol /L Na2HPO4-NaH2 PO4缓冲液(pH6. 0)
进行洗脱。获得的淀粉酶比活力为 76. 8 U /mg，纯
化倍数为 17. 1 倍。
表 1 淀粉酶纯化步骤概要
纯化步骤
总蛋白
(mg)
总酶活
(U)
回收率
(%)
比活力
(U /mg)
纯化
倍数
Culture supernatant 335. 8 1506. 2 100 4. 4 1
Ultrafiltration 105. 4 803. 5 53. 5 7. 6 1. 7
60%(NH4)2 SO4
precipitation
32. 9 350. 7 23. 3 10. 6 2. 4
SuperdexTM G-75 0. 89 61. 5 4. 1 76. 8 17. 1
2. 2 凝胶电泳
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，纯化获得的淀
粉酶为单条带(图 1-B) ，纯化的淀粉酶活性也能通
过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测(图 1-A)。
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量大小为
12 kD，分子排阻色谱 SuperdexTM G-75(Tricorn，Swe-
den)测得分子量大小为 11. 2 kD。
1．纯化的淀粉酶;2． 60%(NH4)2 SO4盐析获得的沉淀;
M．蛋白质标准分子量
图 1 纯化淀粉酶 Native-PAGE(A)和 SDS-PAGE(B)分析
2. 3 pH及温度对淀粉酶活性的影响
在 0. 1 mol /L Na2HPO4-NaH2 PO4(pH6. 0)缓冲
液中淀粉酶最适催化活性温度是 55℃。当缓冲液
中加入 10 mmol /L Ca2 +，最适温度提高到 60℃(图
2-A)。不加入 Ca2 +的情况下，此酶在 45℃温育 1 h
酶失去大部分活性(剩余酶活 2. 8%)。当存在
10 mmol /L Ca2 +时，在 45℃和 55℃分别温育 1 h，其
酶活分别剩余 61%和 44%(图 2-B)。表明 Ca2 +不
仅仅对淀粉酶活力具有影响，而且对高温下维持淀
粉酶活力的稳定性也有作用。
此酶最适 pH 值为 6. 0(图 3-A) ，在 pH 值为
5. 5 － 8. 5 时有较高的活性，在 pH 值为 6. 0 － 10. 0
的范围内酶的活力保持稳定(图 3-B)。
2. 4 钙离子浓度对淀粉酶活性的影响
Ca2 +浓度对淀粉酶活性的影响如图 4-A所示，
102
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
A．添加 10 mmol /L Ca2 +(▲)和不添加 Ca2 +(■)对酶活性的影响;
B．添加 10 mmol /L Ca2 +(▲)和不添加 Ca2 +(■)对酶热稳定性的影响
图 2 温度对淀粉酶活性(A)及热稳定性(B)的影响
图 3 pH对淀粉酶活性(A)及稳定性(B)的影响
Ca2 +对此淀粉酶具有较大的影响。当 Ca2 +浓度
为 20 mmol /L 时，其酶活性最大(达 191%) ，当
Ca2 +浓度为 40 － 50 mmol /L 时，此酶仍然具有很
高的活性(几乎 100%)。图 4-B 表明，Ca2 +对淀
粉酶活性的稳定性有重要的作用，在没有 Ca2 +存
在时，70℃培养 10 min 此淀粉酶几乎失去所有活
性，当加入 5 － 30 mmol /L Ca2 +时可保存 70%的
活性。
A． Ca2 +对淀粉酶酶活的影响:已纯化的淀粉酶中添加 0 － 50 mmol /L Ca2 +，混合物在 30℃培养 1 h后测定剩余
的淀粉酶活性。B． Ca2 +对淀粉酶稳定性的影响:纯化的酶制剂加入到含有不同浓度的 CaCl2 反应物缓冲液中
(1. 0 mmol /L Ca2 +;2． 5 mmol /L Ca2 +;3． 10 mmol /L Ca2 +;4． 20 mmol /L Ca2 +;5． 30 mmol /L Ca2 +;6． 40 mmol /L
Ca2 +;7． 50 mmol /L Ca2 +) ，在 70℃温育 10 min，将反应液立即放到冰上，测定剩余的酶活力
图 4 Ca2 +浓度对淀粉酶活性(A)及稳定性(B)的影响
202
2011 年第 10 期 朱国东等:高温放线菌莱斯氏属 RHA1 菌株产低分子量 α-淀粉酶的初步研究
2. 5 金属离子及抑制剂对蛋白酶活性的影响
表 2 所示 Ca2 + 能提高淀粉酶活性(达到
126%) ，其他金属离子和抑制剂也能影响其酶活
性，Mg2 +使淀粉酶活性维持在 89%。不同抑制剂对
纯化的淀粉酶活性的影响见表 3。淀粉酶活性被金
属离子抑制剂强烈的抑制，当加入 10 mmol /L EDTA
后淀粉酶活性几乎完全消失，表明此淀粉酶为金属
酶。淀粉酶被 10 mmol /L 苯甲基磺酰氟化物
(PMSF) ，1 mol /L 尿素(Urea)和 1%十二烷基硫酸
钠(SDS)在 37℃温育 30 min 后活性发生变化，而
20%乙醇和 20%甲醇对淀粉酶活性几乎不受影响
(分别保存 97%和 93%的活性)。
表 2 金属离子对淀粉酶活性的影响
金属离子(1 mmol /L) 相对酶活(%)
Mg2 + 89
K + 25
Ca2 + 126
Cd2 + 6
Zn2 + 13
Fe2 + 7
Fe3 + 16
Cu2 + 11
Mn2 + 67
Ni2 + 0
Ag + 0
表 3 蛋白抑制剂对淀粉酶活性的影响
抑制剂 剩余酶活(%)
1% SDS 44
EDTA(10 mmol /L) 0
PMSF(10 mmol /L) 43
DMSO(10 mmol /L) 45
Urea(1 mol /L) 73
20%乙醇 97
20%甲醇 93
2. 6 底物的降解
酶液对可溶性淀粉、直链淀粉和支链淀粉的水
解效果如表 4 所示。此酶对支链淀粉和可溶性淀粉
的水解能力比对直链淀粉强，对支链淀粉具有较高
的催化活性。薄层层析分析酶对直链淀粉、可溶性
淀粉和支链淀粉的水解产物表明，麦芽糖和麦芽三
糖为其主要水解产物(图 5) ，说明淀粉酶对以上底
物的水解是随机的，淀粉酶的这种特性与细菌的 α-
淀粉酶作用的机制是一致的。
表 4 纯化的 α-淀粉酶底层特性
底物 相对酶活(%)
Soluble starch 70. 1
Amylose 50. 3
Amylopectin 100
M．条带从上至下依次为:葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖;1．直链淀
粉;2．可溶性淀粉;3．支链淀粉
图 5 直链淀粉、可溶性淀粉、支链淀粉的
水解产物薄层色谱层析
3 讨论
高温放线菌在自然界中广泛存在，土壤、蘑菇堆
肥、河水、乳制品、海洋沉积物、临床材料和空调系统
中都存在高温放线菌。高温放线菌包括 Thermoacti-
nomyces、Laceyella、Seinonella、Thermoflavimicrobium、
Planifilum、Mechercharimyces和 Desmospora［24］。
高温放线菌大多数是嗜热菌，生长在 30 － 60℃
的环境下，嗜热放线莱斯氏属 RHA1 菌株是从中国
云南省腾冲热泉中分离而来，最高生长温度达
65℃，此菌在高温放线菌科中生长温度比较高。
从莱斯氏属 RHA1 中分离的新型低分子量 α-
淀粉酶(11. 2 kD)具有其他嗜热放线菌分离出的 α-
302
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
淀粉酶的特性。其最适温度是 60℃，最适 pH 值为
6. 0，Ca2 +能够提高这种淀粉酶的活性及稳定性，而
EDTA使该酶损失 98%的活性。Ni2 +、Ag2 +和 Fe2 +
存在通过破坏催化反应的二硫键降低淀粉酶活性，
加入 Ca2 +时酶的最适温度提高到 65℃。来自 Ther-
moactinomycete T．的普通型菌株 94-2A 的 α-淀粉酶
最适 pH值为 4. 8 － 6. 0，最适温度是 62. 5℃，但是这
种 α-淀粉酶的分子量为 53 kD［20］。来自 Thermoacti-
nomycete T． 42 的 α-淀粉酶对于直链淀粉和支链淀
粉的水解最适 pH值是 5. 0 － 6. 0，最适温度是 65℃。
这种 α-淀粉酶的分子量为 22. 5 kD。来自 R-47 嗜
热放线菌的 TVAI 和 TVAII 是研究最多的 α-淀粉
酶，具有的分子量高于 50 kD。与已报道的 α-淀粉
酶(http:/ /www． uniprot． org)相比较，本研究发现来
自嗜热放线菌 Laceyella sp． RHA1 的新的低分子量
α-淀粉酶，其特征值得进一步研究。
参 考 文 献
［1］林影．极端酶及其工业应用．工业微生物，2000，30(2) :51-53．
［2］钱海丰，赵晓娟，赵心爱． α-淀粉酶基因表达的调控．西北农业学
报，2003，12(4) :87-90．
［3］Suihko ML，Kroppenstedt RM，Stackebrandt E． Occurrence and char-
acterization of actinobacteria and thermoactinomycetes isolated from
pulp and board samples containing recycled fibres． J Ind Microbiol
Biotechnol，2006，33(3) :183-91．
［4］ Heese O，Hansen G，Hohne WE，Korner D． A thermostable alpha-
amylase from Thermoactinomyces vulgaris:purification and character-
ization． Biomed Biochim Acta，1991，50(3) :225-32．
［5］ Ibuka A，Tonozuka T，Matsuzawa H，et al． Conversion of neopullu-
lanase-α-amylase from Thermoactinomyces vulgaris R-47 into an
amylopullulanse-type enzyme． J Biochem，1998，123(2) :275-82．
［6］Kondo S，Ohtaki A，Tonozuka T，et al． Studies on the hydrolyzing
mechanism for cyclodextrins of Thermoactinomyces vulgaris R-47 al-
pha-amylase 2(TVAII)． X-ray structure of the mutant E354A com-
plexed with beta-cyclodextrin，and kinetic analyses on cyclodextrins．
J Biochem，2001，129:423-8．
［7］Tonozuka T，Ohtsuka M，Mogi S，et al． A neopullulanase-type α-am-
ylase gene from Thermoactinomyces vulgaris R-47． Biosci Biotechnol
Biochem，1993，57(3) :395-401．
［8］Zhou BY，Zheng YX． Studies on properties of thermostable beta-am-
ylase from Thermoactinomyces sp． V4． Chin J Biotechnol，1991，7
(2) :145-52．
［9］Kamitori S，Kondo S，Okuyama K，et al． Crystal structure of Ther-
moactinomyces vulgaris R-47 alpha-amylase II(TVAII)hydrolyzing
cyclodextrins and pullulan at 2. 6 A resolution． J Mol Biol，1999，
287(5) :907-21．
［10］Bahri SM，Ward JM． Cloning and expression of an α-amylase gene
from Streptomyces thermoviolaceus CUB74 in Escherichia coli JM107
and S． lividans TK24． J Gen Microbiol，1990，136(5) :811-8．
［11］Abe A，Tonozuka T，Sakano Y，Kamitori S． Complex structures of
Thermoactinomyces vulgaris R-47 alpha-amylase 1 with malto-oligo-
saccharides demonstrate the role of domain N acting as a starch-
binding domain． J Mol Biol，2004，335(3) :811-22．
［12］Abe A，Yoshida H，Tonozuka T，et al． Complexes of Thermoactino-
myces vulgaris R-47 alpha-amylase 1 and pullulan model oligossa-
charides provide new insight into the mechanism for recognizing
substrates with alpha-(1，6)glycosidic linkages． FEBS J，2005，272
(23) :6145-53．
［13］Ohtaki A，Mizuno M，Tonozuka T，et al． Complex structures of Ther-
moactinomyces vulgaris R-47 α-amylase 2 with acarbose and cyclo-
dextrins demonstrate the multiple substrate recognition mechanism．
J Biol Chem，2004，279:31033-40．
［14］Ohtaki A，Mizuno M，Yoshida H，et al． Structure of a complex of
Thermoactinomyces vulgaris R-47 alpha-amylase 2 with malto-
hexaose demonstrates the important role of aromatic residues at the
reducing end of the substrate binding cleft． Carbohydr Res，2006，
341(8) :1041-6．
［15］Yokota T，Tonozuka T，Shimura Y，et al． Structures of Thermoactino-
myces vulgaris R-47 alpha-amylase II complexed with substrate an-
alogues． Biosci Biotechnol Biochem，2001，65(3) :619-26．
［16］Tonozuka T，Sakai H，Ohta T，Sakano Y． A convenient enzymatic
synthesis of 4(2)-alpha-isomaltosylisomaltose using Thermoactino-
myces vulgaris R-47 alpha-amylase II(TVA II)． Carbohydr Res，
1994，261(1) :157-62．
［17］ Ichikawa K，Tonozuka T，Yokota T，et al． Analysis of catalytic resi-
dues of Thermoactinomyces vulgaris R-47 α-amylase II(TVA II)by
site-directed mutagenesis． Biosci Biotechnol Biochem，2000，64
(12) :2692-5．
［18］Kamitori S，Abe A，Ohtaki A，et al． Crystal structures and structural
comparison of Thermoactinomyces vulgaris R-47 α-amylase 1
(TVAI)at 1. 6 A resolution and alpha-amylase 2(TVAII)at 2. 3 A
resolution． J Mol Biol，2002，318(2) :443-53．
［19］ Mizuno M，Tonozuka T，Uechi A，et al． The crystal structure of
Thermoactinomyces vulgaris R-47 α-amylase II(TVA II)complexed
with transglycosylated product． Eur J Biochem，2004，271(12) :
2530-8．
［20］Hofemeister B，Konig S，Hoang V，et al． The gene amyE(TV1)
codes for a nonglucogenic alpha-amylase from Thermoactinomyces
vulgaris 94-2A in Bacillus subtilis． Appl Environ Microbiol，1994，
60(9) :3381-9．
［21］ Ito K，Ito S，Ishino K，et al． Val326 of Thermoactinomyces vulgaris
402
2011 年第 10 期 朱国东等:高温放线菌莱斯氏属 RHA1 菌株产低分子量 α-淀粉酶的初步研究
R-47 amylase II modulates the preference for alpha-(1，4)-and al-
pha-(1，6)-glycosidic linkages． Biochim Biophys Acta，2007，1774
(4) :443-9．
［22］Ohtaki A，Kondo S，Shimura Y，et al． Role of Phe286 in the recog-
nition mechanism of cyclomaltooligosaccharides(cyclodextrins)by
Thermoactinomyces vulgaris R-47 alpha-amylase 2(TVAII)． X-ray
structures of the mutant TVAIIs，F286A and F286Y，and kinetic
analyses of the Phe286-replaced mutant TVAIIs． Carbohydr Res，
2001，334:309-13．
［23］ Brock TD． Methods for isolation study of thermophiles． Thermo-
philes general，molecular and applied microbiology［M］． New
York:John Wiley ＆ Sons，1986．
［24］Yassin AF，Hupfer H，Klenk HP，Siering C． Desmospora activa gen．
nov．，sp． nov．，a thermoactinomycete isolated from sputum of a pa-
tient with suspected pulmonary tuberculosis，and emended descrip-
tion of the family Thermoactinomycetaceae Matsuo et al． 2006． Int J
Syst Evol Microbiol，2009，59(3) :454-9．
(责任编辑 马鑫)
502