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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
三种快速制备含重复序列质粒 PCR模板的方法
赵宏宇 1, 2 蔡禄 1, 2 赵秀娟 1, 2 王晶妍1, 2 李晶 1
( 1内蒙古科技大学数理与生物工程学院,包头 014010; 2内蒙古科技大学生物工程与技术研究所,包头 014010)
  摘  要:  为了探索含重复序列质粒 PCR模板的快速简易制备方法, 分别利用高速离心法、TE煮沸法和 TE /SDS煮沸法
处理过夜培养的含重组质粒大肠杆菌菌体,制备模板后进行 PCR扩增发现, 均能得到比较清晰的目的条带,可以用于含重复
序列质粒的初步鉴定。相比较而言,高速离心 5 m in、TE煮沸 3 m in、TE /SDS煮沸 2
5 m in制备的样品 PCR扩增后效果较好。
这 3种方法快速、简便、费用低、无污染,简化了 PCR模板制备的过程, 为重组质粒大量筛选鉴定的研究奠定了基础。
关键词:  高速离心法 TE煮沸法 TE /SDS煮沸法 PCR模板 重复序列
ThreeM ethods of Rapid Preparation of Plasm id DNA
Template with Repeat Sequence for PCR
ZhaoH ongyu
1, 2
CaiLu
1, 2  Zhao X iujuan1, 2 W ang Jingyan1, 2 L i Jing1
(
1
School of M athematics Phy sics and B iological Engineering, IMUST, Baotou 014010;
2
Institute of B ioengineering& T echnology, IMUST, Bao tou 014010)
  Abstrac:t  H igh, TE bo iling m ethod and TE /SDS bo ilingm ethod w ere used to treatE. coli in o rder to explo re the rapid prepara tion
m ethod of PCR tem plate using p lasm id w ith DNA repeat sequence. Itw as found that c lear ob jec tive bands cou ld be got using these three
m ethods wh ich could be app lied to pre lim inary iden tification o f p lasm id w ith repeat sequence. The resu lts of centrifuga ting 5 m in, bo iling
3 m in by TE and bo iling 2. 5 m in by TE /SDS w ere better than tha t of others. The three m ethods w ere rapid, sim ple, low cost, no po llu
tion and simp lification of preparation o f PCR tem plate, that cou ld lay a bas is for further study of rap id screen ing and identifica tion o f re
comb inant p lasm id.
Key words:  H igh speed centrifuga tion TE bo iling m ethod TE /SDS bo iling m ethod PCR tem plate Repea t sequence
收稿日期: 20091102
基金项目:国家自然科学基金 ( 30460038 ),内蒙古自然科学基金重点项目 ( 200508010102)
作者简介:赵宏宇,男,讲师,硕士研究生,研究方向:分子生物学; Em ai:l zhaohongyu2000@ 163. com
通讯作者:蔡禄,男,教授,博士生导师,研究方向:生物信息学及分子生物学; Em ai:l nm cailu@ 163. com
近年来,人们已经发现 40多种人类神经系统疾
病与 DNA重复序列扩增或删除有关 [ 1- 3] ,这些疾病
所涉及的重复序列的一个共同特点是以非孟德尔遗
传方式在世代间发生动态突变 [ 4] , 且往往伴随着遗
传早现现象 [ 5, 6 ]。在研究该类疾病的致病机理时,
需要应用 PCR的方法对构建含重复序列的质粒重
组子进行大量的筛选鉴定, 并且探索治疗药物及方
案时也需制备成百上千的 PCR样品进行定性检测
重复序列的长度变化情况。传统的 PCR模板制备
一般需要进行碱法小提质粒, 即 SDS /NaOH 消化、
酚 /氯仿等有机溶剂抽提及乙醇沉淀等多步操
作 [ 7] ,虽然得到的质粒 DNA样品纯度较高,但费时、
费力, 因此如何简化 DNA模板的制备便成为 PCR
试验中的重要问题。本试验探索了高速离心法、TE
煮沸法和 TE /SDS煮沸法制备 PCR模板,整个提取
过程在较短时间内即可完成, 建立了快速、简易、低
成本的 PCR模板制备方法, 为分子克隆及药物处理
菌体后大量检测 DNA重复序列及相关遗传疾病分
子机制研究奠定了基础。
1 材料与方法
1
1 菌株
大肠杆菌 DH5
, 本实验室保存。重组质粒
pLC ( GAA ) 42、pLC ( GCCT ) 18由本实验室构建, 分别
含有一段三核苷酸重复序列 ( GAA ) 42和四核甘酸重
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 2期
复序列 ( GCCT) [ 8, 9 ]18 。
1
2 试剂与仪器
1
2
1 试剂 Taq DNA聚合酶、dNTP、100 bp mak
er购自 TaK aRa公司, T risbase、SDS购自 OXO ID公
司,其余为国产分析纯。
1
2
2 引物 引物为 pLC质粒系列插入的重复序
列两端接头 [ 8, 9] , 由上海生工合成, 其序列为引物
EP1: 5 GGA ATT CGA GTC GCG C3 ,引物 PB2: 5 
CGG GAT CCG AGT CGC GC3 。
1
2
3 仪器 基因扩增仪 ( B iometra); 凝胶成像仪
( GeneGen ius); 高速冷冻离心机 ( Eppendorf) ; 紫外
可见分光光度计 ( NanoD rop)等。
1
3 模板的制备
1
3
1 对照质粒的提取 利用 T iangen质粒小提
试剂盒提取。
1
3
2 高速离心法制备模板 取过夜培养的菌体
1
5mL, 4 000 r/m in、4! 离心 3 m in,去上清, 加 20
L TE清洗, 14 000 r /m in、4! 分别离心 1、2、3、4和
5 m in,去上清, 20 L TE回溶, 12 000 r/m in、4! 离
心 2 m in,取上清用于 PCR扩增。
1
3
3 TE煮沸法制备模板 取过夜培养的菌体
1
5mL, 4 000 r/m in、4! 离心 3 m in,去上清, 加 20
L TE清洗, 4 000 r /m in、4! 离心 3 m in, 去上清,加
20 L TE回溶, 分别煮沸 1、1
5、2、2
5和 3 m in,
12 000 r /m in、4! 离心 2 m in, 取上清用于 PCR
扩增。
1
3
4 TE /SDS煮沸法制备模板 取过夜培养的
菌体 1
5 mL, 4 000 r /m in、4! 离心 3 m in, 去上清;
加 20 L TE清洗, 4 000 r/m in、4! 离心 3m in,去上
清,加 20 L TE /0
1% SDS回溶,分别煮沸 1、1
5、
2、2
5和 3 m in, 12 000 r/m in、4! 离心 2 m in, ,取上
清用于 PCR扩增。
1
4 PCR扩增 [ 10]
反应体系为 25 L, 其中包括 1 ∀ PCR Buffer(内
含 1
5 mmo l/L M g2+ )、模板 DNA 2 L、Taq DNA聚
合酶 0
75U、引物终浓度 0
3 mo l/L、dNTP终浓度
0
25 mmo l/L, 其余用 ddH2O补足。
反应程序: 94! 预变性 2 m in; 94! 变性 30 s、
65! 退火延伸 2 m in, 29个循环; 72! 延伸 5 m in;
4! 保存。反应结束后, 取反应产物 20 L,于 5%聚
丙烯酰胺凝胶电泳, EB染色, 凝胶成像仪下观察
结果。
2 结果与分析
2
1 PCR模板的制备
高速离心法分别离心 1、2、3、4和 5 m in得到
PCR模板样品记为 A1A5; TE煮沸法分别煮沸 1、
1
5、2、2
5和 3 m in得到 PCR模板样品记为 B1 -
B5; TE /SDS煮沸法分别煮沸 1、1
5、2、2
5和 3 m in
得到 PCR模板样品记为 C1- C5。紫外分光光度计
测量制备样品的浓度与纯度, 含 ( GAA ) 42质粒的模
板测量结果见表 1。从表 1中数据可看出, 高速离
心法制备的样品浓度普遍较低, TE /SDS煮沸法制
备的样品浓度较高, OD260 /280值均大于 2。经过
0
8%琼脂糖凝胶电泳检测, A组样品 DNA含量较
低, 没有明显的条带 (图略 ), B组、C组检测结果如图 1
所示。图 1中 C为对照,是用试剂盒提取的质粒 pLC
( GAA) 42, B组与 C组样品的相应位置均具有明显的条
带,说明含有该质粒,由于制备样品过程中 E. coli基
因组断裂片段或 RNA的存在造成拖尾现象。
表 1 三种方法制备的含 DNA重复序列质粒样品的浓度与纯度
样品编号 浓度
( ng /L) OD 260/280 样品编号
浓度
( ng /L) OD 260/280 样品编号
浓度
( ng /L) OD260 /280
A 1
A 2
A 3
A 4
A 5
781
4
543
0
531
2
610
8
503
0
2
19
2
15
2
08
2
17
2
11
B1
B2
B3
B4
B5
1 443
9
1 287
9
1 147
1
1 670
0
2 007
9
2
01
2
12
2
12
2
11
2
10
C1
C2
C3
C4
C5
2 428
9
2 085
5
1 979
1
2 320
3
2 280
0
2
07
2
09
2
08
2
07
2
09
120
2010年第 2期 赵宏宇等:三种快速制备含重复序列质粒 PCR模板的方法
图 1 样品的琼脂糖电泳检测结果
2
2 PCR扩增检测
对 3种方法制备的含 ( GAA) 42重复序列的质粒
的直接进行进行 PCR扩增后, 其结果见图 2。从图
2中可见, 3种方法得到目的条带都在 159 bp左右,
位置正确,条带清晰, 与试剂盒提取质粒作为对照扩
增的结果基本一致, 均可以用于重复序列长度的初
步鉴定。
C.试剂盒提取含 ( GAA ) 42质粒的对照; M. 100 bp DNA分
子标准; A 1A 5.由高速离心法得到的 PCR模板样品; B1
B5. TE煮沸法得到的 PCR模板样品; C1 C5. TE /S DS煮沸
法得到的 PCR模板样品
图 2 三种方法制备的模板经 PCR扩增结果
2
3 三种模板制备方法的比较
为了对 3种模板制备方法的试验结果进行比
较,必须将试验结果进行量化处理。本试验采用凝
胶成像仪分析软件 G eneTools进行自动分析, 选取
每一种方法的第 1个样品条带 (即泳道 A1、B1、C1
的目的条带 )分别定义为 1000, 去除背景噪声干扰
后, 其余的条带则选定目的区域后由软件自动处理,
试验结果如表 2。从表 2中数据可看出, 同种方法
不同处理时间制备的模板扩增后的量化值相差不
大, 说明处理时间对试验结果的影响较小,与文献中
报道的有所差异 [ 11]。
表 2 PCR扩增的目的条带量化值
编号 量化值 编号 量化值 编号 量化值
A 1
A 2
A 3
A 4
A 5
1 000
1 044
3
988
33
1 087
78
1 238
8
B1
B2
B3
B4
B5
1 000
1 052
45
1 028
93
1 156
62
1 189
52
C1
C2
C3
C4
C5
1 000
957
32
986
19
1 054
59
980
67
进一步比较 3种制备模板的方法, 选取每种方
法中量化值相对较大试验结果,即高速离心 5 m in、
TE煮沸 3 m in、TE /SDS煮沸 2
5 m in分别制备含
( GAA) 42、( GCCT ) 18质粒的模板进行 PCR扩增, 其
结果见图 3。从图 3中可看出,利用高速离心法制
备的含 ( GAA ) 42质粒的模板与试剂盒提取质粒扩增
的结果亮度基本一致,应用 TE煮沸法和 TE /SDS煮
沸法制备的含 ( GAA ) 42质粒的模板扩增后亮度较
强; 利用高速离心法制备的含 ( GCCT) 18质粒的模板
扩增后目的条带很暗,而用 TE煮沸法和 TE /SDS煮
沸法制备的含 ( GCCT ) 18质粒的模板扩增后目的条
带清晰,位置正确, 效果较好。
M. 100 bp DNA分子标准; 1.试剂盒提取的含 ( GAA ) 42质粒
的对照; 2.高速离心 5 m in制备的含 (GAA ) 42质粒模板; 3.
TE煮沸 3m in制备的含 (GAA ) 42质粒模板; 4. TE /SDS煮沸
2. 5m in制备的含 ( GAA ) 42质粒模板; 5.试剂盒提取的含
(GCCT) 18质粒的对照; 6. 高速离心 5 m in制备的含 ( GC
CT ) 18质粒模板; 7. TE煮沸 3 m in制备的含 (GCCT) 18质粒模
板; 8. TE /SDS煮沸 2. 5m in制备的含 ( GCCT ) 18质粒模板
图 3 三种方法制备的模板 PCR扩增结果比较
121
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 2期
3 讨论
检测 E. coli质粒中特定 DNA片段最常规的方
法是用碱法小提质粒进行 PCR扩增, 一般要经过细
胞裂解、有机溶剂反复抽提、乙醇沉淀等多步复杂的
操作才能得到质粒 [ 7] , 虽然质粒 DNA样品纯度较
高,但作为 PCR模板定性检测使用, 既费时、费力、
价格又非常昂贵。此外,在抽提过程中酚 /氯仿的使
用会对试验人员及环境造成污染,所残留的酚 /氯仿
还可能影响 Taq酶的扩增效率 [ 12 ]。
PCR反应首先应考虑的是 DNA模板的完整性,
对纯度的要求并不高。本试验分别使用高速离心
法、TE煮沸法、TE /SDS煮沸法破坏了 E. coli的细胞
壁与细胞膜结构,使质粒 DNA释放出来。从图 1可
看出样品中含有较高浓度的质粒 DNA。虽然样品
中混有大量断裂的基因组、RNA以及细菌裂解碎片
可能影响 PCR扩增的效果, 但 Taq DNA聚合酶适应
能力较强,可以通过调整 PCR反应条件来减少或消
除模板纯度对扩增反应的影响 [ 13 ]。
高速离心法对细胞的破坏程度相对较小, 制备
样品的浓度较低, 但可以满足 PCR反应所需, 且操
作简单方便,目前国内还没有见到相关报道。利用
TE直接煮沸制得模板浓度较高,不存在其它药品的
污染,对 PCR反应及后续试验影响较小。 SDS可以
促使细胞壁破裂,但同时也对 PCR过程及后续试验
造成一定的影响, 因此应尽可能降低 SDS的使用
量。本研究组同时利用 3种方法直接处理固体培养
基上的单克隆菌体制备模板, 进行 PCR扩增后也可
以得到类似的结果。使用这 3种方法制备 PCR模
板在对重组质粒大量筛选鉴定方面具有重要的意
义,特别适合于仅需定性鉴定的 PCR试验,从而使
PCR技术的应用更加简便。
参 考 文 献
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