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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
报春 PF sHSP 17-1 基因转化拟南芥及耐热鉴定
张路 胡伟娟 张启翔 高亦珂 石少川 王叶
(北京林业大学园林学院，北京 100086)
摘 要: 根据灰岩皱叶报春 PF sHSP 17-1 热激蛋白基因序列，采用 PCR 法从差减文库中克隆得到该基因，并构建
pCAMBIA1301-PF sHSP 17-1 植物表达载体，通过根癌农杆菌介导的花器浸染法转化拟南芥，经潮霉素筛选、PCR 和 RT-PCR
法鉴定后，对转基因植株和野生型对照进行高温胁迫，分析其耐热性差异。结果显示，在 40℃、42℃、44℃处理下，转基因拟南
芥的相对电导率和丙二醛含量升高的幅度均显著低于野生型对照，而脯氨酸含量的积累明显高于对照，可溶性蛋白的含量在
热胁迫下也比对照稳定，仅有轻微下降。试验证明，PF sHSP 17-1 基因对植物的耐热性有重要作用。
关键词: PF sHSP 17-1 基因 拟南芥 转基因 耐热 热激蛋白
Transformation of Primula PF sHSP 17-1 Gene and Heat Stress Tolerance
Identification of Transgenic Arabidopsis thaliana
Zhang Lu Hu Weijuan Zhang Qixiang Gao Yike Shi Shaochuan Wang Ye
(College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University，Beijing 100086)
Abstract: According to the sequence of PF sHSP 17-1 gene from P． forrestii，PF sHSP 17-1 gene was cloned from a subtractive li-
brary by PCR，and the plant expression vector pCAMBIA1301 which harbored PF sHSP 17-1 gene was established，wild type Arabidopsis
plants were transformed by Agrobacterium tumefaciens-mediated Floral Dip method，after hygromycin screening，PCR and RT-PCR detec-
tion indicated PF sHSP 17-1 gene had been integrated into the genome． The performance of the transformed plants and the wild type un-
der heat stress was analyzed． The results showed that，after 2 hours’stress of 40℃，42℃，44℃，the increase of relative conductance rate
and malondianldehyde(MDA)in transgenic plants was much smaller than that in the wild-type，while the proline contents inclined more
dramatically，and the content of soluble protein in the transformed plants demonstrated greater stability and resistance compared with
that in the wild control． Consequently，the experimental results displayed that the PFsHSP17-1 gene has a great value in improving the
heat stress resistance in plants．
Key words: PF sHSP 17-1 gene Arabidopsis thaliana Transgenic Heat stress resistance HSP
收稿日期:2011-08-30
基金项目:国家林业局重点项目(2003-008-L0) ，“十一五”科技支撑计划课题(2006BAD01A18)
作者简介:张路，女，硕士，研究方向:园林植物遗传育种;E-mail:gogopink@ yahoo． cn
通讯作者:张启翔，男，博士，教授，研究方向:花卉种质资源;E-mail:zqx@ bjfu． edu． cn
报春属植物(Primula)是著名的高山花卉，其花
色绚丽、花型各具特色，被誉为“世界三大花园植
物”之一［1］。由于其大部分种类分布在高海拔冷凉
地区，温度成为影响报春花引种利用的主要限制
因素。
在资源调查、收集的基础上，胡伟娟等［2］对灰
岩皱叶报春(Primula forrestii)、滇北球花报春(P．
denticulate ssp． sinodenticulata)、鄂报春(P． obconi-
ca)、黄花九轮草(P． veris )、小报春(P． forbesii
Franch)及岩生报春(P． saxatilis)进行了生理指标变
化、叶片组织结构和叶肉细胞结构变化 3 方面的耐
热性评价，得出灰岩皱叶报春为最耐热的种，并构建
耐热相关基因的差减文库。通过实时荧光定量
PCR技术进一步分析相关基因在不同高温胁迫下
表达情况，利用 RACE 技术得到基因全长，命名为
PF sHSP 17-1。BLAST 分析表明，该基因为编码
17 kD 左右的热激蛋白基因。
热激蛋白(heat shock protein，HSP)是细胞应激
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
刺激下产生的一组蛋白质。研究发现热激蛋白普遍
存在于从细菌到真核生物的整个生物界，并且可以
被氨基酸类似物、生长因子、重金属离子及病毒感染
等因素诱导。目前，热激蛋白的研究已经取得重大
进展，成为植物生物工程中较为活跃且发展较快的
领域之一［3］。大量研究表明，将热激蛋白相关基因
转入植物体后，能显著提高植物的耐热性。Yeh
等［4］将水稻 HSP16. 9 转入大肠杆菌后提高了大肠
杆菌的耐热性，Sanmiya 等［5］将番茄线粒体中的
sHSPs基因转移到烟草中，也同样增强了烟草对高
温的耐受性，Shravan等［6］把编码 Hsp16. 1 的转录因
子 HsfA1 基因转入蕃茄中，在热胁迫条件下，转基因
株系获得了一定耐热能力，而且 HsfA1 的表达量为
对照的 10 倍。可见，热激蛋白基因对提高植物的耐
热性有明显作用。
本试验从 SSH 文库中克隆灰岩皱叶报春 PF
sHSP 17-1 基因，并构建植物表达载体 pCAM-
BIA1301-PF sHSP 17-1，通过根癌农杆菌介导法转入
野生型拟南芥，经潮霉素筛选、PCR和 RT-PCR鉴定
后，以野生型拟南芥为对照，进行热胁迫处理、测定
生理指标，分析转基因植株的耐热能力，旨在为通过
植物基因工程提高花卉耐热性奠定试验基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana e-
cotype Columbia)、报春耐热基因差减文库(SSH)、
大肠杆菌(E. coli)TOP10 和农杆菌 GV3103，以及表
达载体 pCAMBIA1301 由国家花卉工程技术中心重
点实验室保存。植物基因组提取试剂盒(DNA se-
cure Plant kit)、pGM-T克隆试剂盒购自北京天根生
物公司，Easy Spin 植物 RNA 提取试剂盒购自北京
盖宁金诺生物技术公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 植物表达载体的构建 根据报春 PF sHSP
17-1 cDNA全长序列利用 Primer Premier 5. 0 设计引
物。上游:5-CAAGAAGTGTGCACAAAAACATCTC-
3，下游:5-CAAACCAAAACACCAAACCG-3，根据
克隆需要在引物的 5端分别引入 BglⅡ和 BstEⅡ。
通过 PCR 扩增得到含酶切位点的 PF sHSP 17-1 基
因。反应体系:SSH 文库质粒 DNA 1 μL，上下游引
物各 1 μL，10 × PCR Buffer 2. 5 μL，dNTP 2 μL，
MgCl2 2 μL，Taq DNA Ligase 0. 25 μL，ddH2O 15. 5
μL，总体积 25 μL。反应程序:94℃预变性4 min;
94℃变性 45 s，59℃退火，72℃延伸 4 min，30 次循
环;最后 72℃延伸 6 min。扩增完毕，用 1%琼脂糖
凝胶电泳检测。扩增片段用 DNA 凝胶回收试剂盒
纯化后连接于载体 pGM-T 中，连接产物转化用
CaCl2法制备的大肠杆菌 TOP10 感受态细胞，得到重
组质粒 pGM-PF sHSP 17-1，送至擎科生物公司
测序。
用 BglⅡ和 BstEⅡ双酶切质粒 pGM-PF sHSP
17-1 和质粒 pCAMBIA1301，回收目的基因和载体
大片段。T4 DNA连接酶连接过夜，得重组质粒，将
重组质粒转化，卡那霉素(Kan)平板培养过夜，挑
取单菌落培养，进行 PCR 检测，提取质粒进行酶切
鉴定，即构建植物表达载体 pCAMBIA1301-PF
sHSP 17-1。
1. 2. 2 拟南芥的转化 将 pCAMBIA1301-PF sHSP
17-1 表达载体用液氮冻融法转入根癌农杆菌
GV3101，参照 Clough 等［7］的方法，以含表达载体的
农杆菌转化野生型拟南芥。
1. 2. 3 转基因拟南芥的获得 收取转化后的拟南
芥种子(T0代) ，消毒并在 0. 1%的琼脂糖中重悬种
子，均匀分散到潮霉素筛选培养基(MS + 25 μg /mL
潮霉素，pH5. 8)上，4℃处理 2 d 后，置于光照∶黑暗
= 16 h∶ 8 h，温度 22℃的培养室中培养。10 d 后挑
选 T1代阳性植株转移到培养土中，PCR 鉴定并收获
种子。为获得纯合的转基因株系，将鉴定的阳性克
隆 T1代所得种子播于含 25 μg /mL潮霉素的琼脂培
养基上，将 T2代抗性株系转移到培养土中并收获种
子。继续将 T3代种子播于含 25 μg /mL潮霉素的琼
脂培养基上，所得全为绿苗，得单基因插入纯合
株系。
1. 2. 4 转基因拟南芥植株 PCR 和 RT-PCR 检测
采用植物基因组提取试剂盒(DNA secure Plant kit)
提取生长 1 月左右筛选出的转基因拟南芥的总
DNA，以 pCAMBIA1301-PF sHSP 17-1 质粒为阳性对
照，野生型拟南芥为阴性对照，PCR 检测目的基因。
用 Easy Spin植物 RNA提取试剂盒提取阳性植株的
总 RNA，以 pCAMBIA1301-PF sHSP 17-1 质粒为阳
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2011 年第 11 期 张路等:报春 PF sHSP 17-1 基因转化拟南芥及耐热鉴定
性对照，相应的以野生型拟南芥为阴性对照，RT-
PCR检测。
1. 2. 5 转基因拟南芥的热胁迫处理以及生理指标
测定
1. 2. 5. 1 热胁迫处理 分别将转基因拟南芥种子
和野生型对照种子消毒后播种于含 25 μg /mL 潮霉
素的琼脂培养基上和 MS琼脂培养基上，于 22℃、光
照 3 000 LX、空气湿度 70%、光照∶ 黑暗 = 16 h∶ 8 h
的条件下培养 10 d，将长势良好的幼苗移栽到培养
土中，8 周后，选择生长一致的转基因和野生型拟南
芥进行热胁迫处理。将其分别置于 40℃、42℃、
44℃下处理 2 h，每个处理转基因和野生型株系各
10 株，取同一叶位的叶片进行相关生理指标的测
定，试验重复 3 次。
1. 2. 5. 2 生理指标的测定 细胞质膜透性采用相
对电导率测定;丙二醛含量采用硫代巴比妥酸比色
法测定;游离脯氨酸含量采用磺基水杨酸碾磨提取
比色法测定;可溶性蛋白采用考马斯亮蓝 G-250 法
测定，具体参照植物生理生化试验原理和技术［7］的
方法操作，每个指标 3 次重复。
1. 2. 6 数据处理 数据采用 SPSS17. 0 统计软件对
数据进行差异显著分析与 Duncan(P ＜ 0. 05)多重比
较分析，Excel绘制图表。
2 结果
2. 1 表达载体 pCAMBIA1301-PF sHSP 17-1 的构建
对构建的 pCAMBIA1301-PF sHSP 17-1载体进行
PCR和双酶切检测，结果以 PF sHSP 17-1-F 和 PF
sHSP17-1-R为引物可特异地扩增出517 bp的PF sHSP
17-1基因片段，BglⅡ和 BstEⅡ双酶 pCAMBIA1301-PF
sHSP 17-1载体，可切下相应大小的 DNA片段，说明成
功构建 PF sHSP 17-1基因的表达载体(图 1)。
2. 2 转基因植株的筛选及 PCR检测
将用花器浸泡法转化拟南芥得到的 T0代种子，
消毒后播种于含 25 μg /mL 潮霉素的 MS 固体培养
基上，获得阳性株系 56 株，提取其 DNA，以 PF sHSP
17-1 的特异引物(PF sHSP 17-1-F 和 PF sHSP 17-1-
R)进行 PCR扩增，得阳性植株 51 株，均扩增出 517
bp的目的片段，而野生型植株则无 PCR扩增产物，
说明灰岩皱叶报春 PF sHSP 17-1 基因已经整合到
拟南芥基因组中。对 56 株经潮霉素筛选的株系进
行 PCR检测，得阳性植株 51 株，阴性植株 4 株，可
见阳性植株占筛选苗的 91%(图 2)。
M． DNA marker DL15000;1． pCAMBIA1301-PFsHSP17-1
质粒;2． BglⅡ和 BstEⅡ双酶检测;3． PCR 检测;4． SSH
的 PCR阳性对照
图 1 表达载体的 PCR及酶切检测
M． DNA marker DL2000;1．以 pCAMBIA1301-PF sHSP 17-
1 质粒为模板;2．以野生型拟南芥基因组 DNA 为模板;
3 － 5．以转基因拟南芥基因组 DNA为模板
图 2 转基因植株的 DNA PCR检测
2. 3 转基因拟南芥的 RT-PCR检测
随机选择 20 株经 DNA-PCR鉴定的阳性植株进
行 RT-PCR检测。提取 DNA-PCR 鉴定的阳性植株
以及同期培养的野生型拟南芥 RNA，将其转录成
cDNA后进行 PCR 扩增。20 株均为阳性克隆，RT-
PCR产物在 517 bp左右有明显条带，而野生型在此
处则无条带。说明 PF sHSP 17-1 基因在转基因植
物中可以正常转录(图 3)。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
M． DNA marker DL2000;1．以 pCAMBIA1301-PF sHSP 17-
1质粒为模板;2．以野生型拟南芥基因组 cDNA为模板;
3，4．以转基因拟南芥基因组 cDNA为模板
图 3 转基因植株的 RT-PCR检测
2. 4 热胁迫对转 PF sHSP 17-1 基因拟南芥生理指
标的影响
2. 4. 1 高温胁迫下细胞膜相对透性的变化 由图
4 可见，随着胁迫程度的加剧，转基因拟南芥和野生
型对照的相对电导率较 22℃均有明显的升高。转
基因植株在 40℃、42℃和 44℃胁迫下相对电导率比
较稳定，变化幅度较小，维持在 30%左右，较 22℃处
理上升了 58%，而野生型对照随着胁迫的加剧，相
对电导率分别上升了 92%、119%和 157%。可见，
高温胁迫下转基因拟南芥膜系统受到的伤害轻于未
转基因植株，表现出较强的抗性。
同一温度处理不同小写字母表示种间在 0. 05 水平差异
显著，下同
图 4 高温胁迫下转基因和野生型植株相对电导率变化
2. 4. 2 高温胁迫下丙二醛(MDA)含量的变化 由
图 5可见，转基因植株和对照叶片 MDA含量在热胁
迫处理下表现出明显差异(P ＜ 0. 05) ，前者在 40℃、
42℃、44℃的处理下，较 22℃而言，上升幅度较小，分
别上升了 81. 5%、103. 7%和 148. 1%;而野生型拟南
芥随着处理的加剧，在 3 种程度处理下，MDA含量变
化差异明显，分别较 22℃处理上升了 204%、272%和
340%。可见，转基因拟南芥较对照表现出较高的抗
膜脂过氧化能力，因而有更强的高温适应能力。
图 5 高温胁迫下转基因和野生型植株丙二醛含量变化
2. 4. 3 高温胁迫下可溶性蛋白含量的变化 由图
6 可见，在热胁迫下，转基因拟南芥叶片中可溶性蛋
白的含量变化较小，较 22℃对照仅有小幅度下降，
总体维持在 2. 5 mg /g 左右。而未转基因植株在
40℃、42℃和 44℃热处理下，蛋白含量明显下降，分
别下降了 19. 5%、22. 1%和 27. 9%。可见，高温下
转基因拟南芥体内蛋白含量受到的影响较小，仍能
维持正常的合成与代谢，而野生型对照则表现出明
显的变化，其对高温胁迫更为敏感。
图 6 高温胁迫下转基因和野生型植株可溶性蛋白含量变化
2. 4. 4 高温胁迫下游离脯氨酸含量的变化 由图
7 可见，转基因拟南芥和野生型对照在高温胁迫下，
脯氨酸的含量均有明显上升，且与胁迫程度成正比。
22℃下，二者叶片脯氨酸含量无明显差异，而在高温
处理下，二者含量差异明显(P ＜ 0. 05) ，前者的脯氨
酸含量积累较多。可见，转基因拟南芥对高温胁迫
有更积极的响应和应对，表现出较强的耐热性。
图 7 高温胁迫下转基因和野生型植株脯氨酸含量的积累
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3 讨论
高温胁迫下，植物体会发生一系列生理生化反
应，主要表现为细胞膜透性增大、电解质外渗、膜脂
过氧化程度加强和 MDA 积累等［9］。生物膜是细胞
与环境之间的屏障，承担着细胞与外界环境的信息、
物质和能量的交换。各种不良的环境因素对细胞的
影响首先作用于细胞膜，造成细胞膜受损，从而影响
到细胞膜的结构与功能。因此，细胞膜在热胁迫下
的稳定性能反映出植物的耐热能力。在高温处理
下，转基因拟南芥的相对电导率上升幅度明显小于
对照，说明 PF sHSP 17-1 基因的表达减轻了细胞膜
系统的受损，对细胞膜有热保护功能。这与 Hsp70
和小分子 Hsps 的研究，以及 Wu 和晁旭等［10，11］将
AtHsfA6a基因转入拟南芥有类似结果。
植物抗氧化系统的能力是耐旱性指标之一。在
逆境下，植物细胞内氧自由基平衡遭到破坏，发生膜
脂过氧化作用，而丙二醛是其典型产物。因此，
MDA含量可显示膜脂质过氧化程度，是植物重要的
干旱胁迫参数［12］。在高温胁迫下，转基因拟南芥的
丙二醛含量明显低于野生型对照，且在 3 个程度的
处理下变幅较小，比较稳定。分析认为，热激条件下
PF sHSP 17-1 基因诱导的热激蛋白表达有效的保护
了膜系统不受损伤。
渗透调节是阐明植物抵抗高温胁迫的重要生理
机制［13］。植物在逆境条件下通过代谢活动增加细
胞内溶质浓度，降低其渗透势，从而降低水势，从外
界吸水保持膨压，维持细胞的正常代谢［14］。在干旱
和高温胁迫条件下，植物体内积累的游离脯氨酸
(Pro)含量，与其耐热性呈正相关［15］。高温胁迫下，
转基因拟南芥的脯氨酸含量迅速增加，积累量明显
高于对照未转基因植株，推测 PF sHSP 17-1 基因的
表达促进了植物体中脯氨酸的合成基因的表达，从
而使得转基因植株中脯氨酸的大量积累。
植物体内蛋白质含量与耐热性有着密切关系。
在高温逆境下，氮素代谢失调导致植物体正常生长
变的紊乱，而耐热性强的种或品种在高温下能够保
持较高的蛋白合成速率与较低的蛋白降解速
率［16，17］。研究高温胁迫条件下大豆(Glycine max)
花荚离层细胞的 HSP70 基因表达水平、线粒体和其
蛋白含量以及细胞色素氧化酶表达量表明，热胁迫
能够提高大豆的这些蛋白含量［18］。在高温处理下，
蛋白含量在转基因拟南芥较常温下变化较小，仅有
轻微下降，而在野生型对照中下降明显。可见 PF
sHSP 17-1 热激蛋白有助于维持细胞蛋白质的正常
合成和代谢的速率，减少热胁迫对植物体的损伤。
小分子量热激蛋白(sHSPs)在植物耐热性中起
主要作用，广泛分布于细胞质、线粒体、叶绿体等组
织中，在高等植物中至少有 6 种多基因家族编码此
类蛋白，其多肽链从 15 － 30 kD大小不等［19］。Jabok
等［20］在体外热变性试验中证明，低分子量的 HSPs
可阻止葡萄糖氧化酶和柠檬酸将合成酶的热变性，
而且还可加速这些变性的蛋白质复性。刘箭等［21］
利用转基因的方法，将线粒体小分子热激蛋白基因
导入烟草，转基因烟草植株的线粒体小分子热激蛋
白基因可在烟草细胞中组成型地表达，转基因烟草
线粒体的氧化磷酸化效率高于对照，说明线粒体小
分子热激蛋白对线粒体具有保护作用。本研究表
明，PF sHSP 17-1 基因为编码 17 kD 左右的小分子
热激蛋白基因，并可在拟南芥中成功表达，其导入可
提高转基因植株细胞膜的抗氧化能力，减少电解质
的外渗，维持正常的蛋白质代谢水平，从而提高了植
株的耐热性。
4 结论
本研究成功构建了植物表达载体 pCAMBIA1301-
PF sHSP 17-1，用花器浸染法转化拟南芥，获得 PF
sHSP 17-1 转基因植株。通过热激处理以及生理指
标的测定，转基因拟南芥的耐热能力明显高于野生
型对照。可见，通过转化灰岩皱叶报春的 PF sHSP
17-1 基因改良植物的耐热性是一条可行的途径。
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