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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
拟南芥氮代谢相关基因 T2DNA插入
突变体低氮响应的初步研究
刘菲 1 　林熊 2 　尹辉 1 　张富春 1
(1 新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室 ,乌鲁木齐 830046; 2 四川农业大学 ,雅安 625014)
　　摘 　要 : 　氮代谢相关基因家族的拟南芥 T2DNA插入突变体幼苗期对低氮环境有不同的响应。叶绿素含量 ,干物重 ,全
氮含量测定结果表明 :有 2个氨转运蛋白基因 ( ammonium transport gene mutant, AMTm)和 8个硝酸还原酶基因 ( nitrate reduc2
tases gene mutant, NRm)的 T2DNA突变体与野生型对照相比对外界低氮环境的适应能力存在显著差异。
关键词 : 　拟南芥 　氨转运蛋白基因 　硝酸还原酶基因 　T2DNA突变体 　低氮响应
Primary Reaerch on Response of A rabidopsis tha liaba Nitrogen
M etabolism Assoiated Gene T2DNA M utants in Low Nitrogen Condition
L iu Fei1 　L in Xiong2 　Yin Hui1 　Zhang Fuchun1
(1 X injiang Key Laboratory of B iological Resources and Genetic Engineering, College of L ife Science and Technology, X injiang University,
U rum qi 830046; 2 S ichuan Agriculture University, Ya’an 625014)
　　Abs trac t: 　 In the seedling stage, A rabidopsis tha liana T2DNA mutants that associated with nitrogen metabolism gene have some
different responses under low nitrogen stress1 A ssessment of chlorophyl content, total biomass and total nitrogen content indicated that
there were remarkable differences existing in two ammonium transport gene T2DNA mutants(AMTm s) and eight nitrate reductases gene
T2DNA mutants(NRm s) compared with wild type under low nitrogen conditions1
Key wo rds: 　A rabidopsis tha liana　Ammonium transporters gene　N itrate reductases gene　T2DNA mutant　Low nitrogen re2
sponse
收稿日期 : 2008212210
基金项目 :新疆维吾尔自治区科技重大专项 (20073113823) ,教育部科学技术基础条件平台建设项目 (505016)
作者简介 :刘菲 (19802) ,男 ,在读硕士研究生 ,主要从事生物化学与分子生物学方面研究 ; E2mail: liufei229@ gmail1com
通讯作者 :张富春 , E2mail: zfc@xju1edu1cn　　氮是植物体内蛋白质、氨基酸、核酸、叶绿素、酶等的重要组成成分 ,氨转运蛋白 (AMT)与硝酸还原酶 (NR)在植物吸收利用氮的过程中起关键作用 ,特别是当环境中氮含量低于 1 mmol/L ,高亲和转运系统 ( high2affinity transport system, HATS)起主要作用时尤为重要 [ 1, 2 ]。拟南芥植株小、生活史短、基因组小且遗传背景清晰的特点使它成为研究高等植物氮吸收利用机制的优良材料 ,同时拟南芥基因的突变体库也已建立 ,容易筛选获得氮敏感型植株 [ 3, 4 ]。传统正向遗传学方法筛选氮营养突变体周期长 ,成本高 ,效率低。T2DNA突变体的研究方法提供了一条大通量 ,速度快 ,效率高的途径 [ 5 ]。 本试验以拟南芥氮代谢相关基因 T2DNA突变体为对象 ,通过对叶绿素含量、干物重及全氮含量等生理指标的检测与方差分析 ,初步研究了突变体对低氮环境的响应 ,分析了其中可能存在的机制 ,为深入了解植物对氮的吸收利用及其调节机制奠定了基础。1　材料与方法野生型拟南芥 (A rabidopsis tha liana Columbia)为本实验室保存。 T2DNA 插入突变体购自 ABRC(www1arabidop sis1org) ,共有涉及 7个基因的 13个T2DNA插入突变体株系 [ 6 ] , Salk序号及引物序列见表 1。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
拟南芥种子用 011%琼脂糖悬浮播种于 MS培养
基上萌发 , 4℃避光春化 3 d, 22℃光照培养 5 d,光照
周期 16 h /8 h。移苗至低氮培养基上 ,继续光照培养
5 d后测定叶绿素含量及干物重。低氮培养基的组分
(mg/L) : KCl 1 400、MgSO4·7H2O 370、KH2 PO4 170、
CaCl2 332、MnSO4 ·H2O 1619、ZnSO4 ·7H2O 8165、 H3BO3 6125、KI 0183、NaMoO4·2H2O 0125、CuSO4·5H2O 01025、CoCl2·6H2O 01025、FeSO4·7H2O 2718、EDTA·Na 3713。叶绿素含量采用比色法测定 ,吸收峰分别为 665、649、470 nm。全氮含量使用 FOSS kjel2tecTM 2300自动定氮仪测定 [ 7 ]。
表 1　拟南芥 T2D NA突变体株系及引物序列
基因功能 基因名称 Salk编号 引物序列 (5′→3′)
编码氨转运蛋白 (AMT) A t4g13510 Salk_063887 caaacccggttaagaaagagg tgttcaggttcttcctctttgg
Salk_069594 同上
A t3g24300 CS852622 gtttcaatgtcaattggatcg agtagaagagtcctccggctg
编码硝酸还原酶 (NR) A t1g77760 Salk_004164 cagtagttccaactttgtaggacg ggaaaggtattccgttaagcg
Salk_071547 同上
A t1g37130 Salk_075996 aagctgacatcatccaccaac gcgtggttcgttcttacaaac
A t2g15620 Salk_046068 tgtgttttgcaactgatctgc ttgtaccggtagccagttctg
CS857421 tttccaaacacgcactaaacc cttctcctgaggattgatccc
A t1g21290 Salk_106237 gtacgagagacgttccgaatg tcaaaggttcgattttggatg
Salk_113111 同上
Salk_108320 tcagtcttcacagttgcaagc atcaaatggggaaaggagatg
A t2g31955 Salk_015029 caacatagttaaagtgggccg ttcgaaaaagcaaccaacttg
Salk_020279 atttccaaatttttccatggc gaggagttgcaagcgagtatg
2　结果与分析
211　纯合 T2DNA突变体的鉴定
采用特异引物扩增目的基因片段和 T2DNA插
入片段 ,通过比对扩增结果鉴定突变体。以基因组
DNA为模板 ,用特异引物 LP和 RP扩增基因组片
段 ,用 T2DNA片段的特异引物 LBb1和 RP扩增 T2
DNA插入片段 ,以确证所获突变体为纯合 T2DNA
插入突变体 [ 8 ] (图 1)。
a1T2DNA突变体插入片段 PCR鉴定模式图 ; b1特异引物 LP /RP扩
增突变体 Salk_063887在 1 000 bp没有出现条带 ; M1DL2000 DNA
Lander; c1特异引物 LBb1 /RP扩增突变体 Salk_063887出现大小 500
bp的特异条带
图 1　对纯合 T2D NA突变体的鉴定
212　野生型拟南芥对低氮的响应
野生型拟南芥幼苗在正常 MS培养基上春化 3
d,光照培养 5 d后移苗至浓度分别为 20 , 1 , 015 , 012 mmol/L和 0 mmol/L的低氮培养基上生长 5 d后 ,叶绿素含量、100株干物重及全氮含量都呈现出下降的趋势 (图 2) 。当培养基中 N 浓度由正常MS降至 1 mmol/L时 ,拟南芥叶绿素含量与对照相比显著降低 (图 2a) ;随着培养基中氮浓度的降低 ,干物质积累也呈现出下降的趋势 (图 2b) ;植株全氮含量的下降趋势 (图 2c)。通过对 6 000株在不同浓度的低氮培养基上的野生型拟南芥检测表明 :与正常 MS培养基上生长的拟南芥相比 ,当氮浓度为 0 mmol/L时 ,植株叶绿素合成 ,干物质积累及氮的吸收利用效率显著降低 ,因此选择氮浓度为 0 mmol/L 的低氮培养基为 T2DNA突变体的低氮选择压力。213　低氮环境下的 T2DNA突变体氨是还原态氮的主要形式 ,是植物代谢过程中首先被利用转化的无机养分 ,氨转运蛋白 (AMT)在氨的吸收过程中起着重要作用 [ 9 ] ;而硝酸盐同化途径中不同阶段的缺陷型突变体是理解和研究硝酸盐代谢途径中不同阶段的功能及调控特点的有力工
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2009年第 6期 　　　　刘菲等 :拟南芥氮代谢相关基因 T2DNA插入突变体低氮响应的初步研究
图 2　野生型拟南芥在不同浓度低氮培养基上的叶绿素含量 ,百株干物重 ,全氮含量测定结果
表 2　低氮培养基上 T2D NA突变体叶绿素含量的方差分析结果
Salk编号 μ SS df M S F P
S887 11762963 01392963 1 01392963 6817891 0100115433
S594 11399116 0103285 1 0103285 11460382 01293423
C622 01833323 01261842 1 01261842 29133267 0100563233
S164 2146906 21225038 1 21225038 62108587 0100140333
S547 0154329 01751552 1 01751552 23418762 0100010633
S996 01978417 01111557 1 01111557 38135587 0100345633
S068 11861643 01559092 1 01559092 11173679 010266363
CS421 11538441 01123823 1 01123823 15180313 010164653
S237 11765376 01396676 1 01396676 74152181 0100099033
S111 11200184 01003893 1 01003893 01823993 01415358
S320 2196104 41385697 1 41385697 24719871 0100009533
S029 21801106 31603645 1 31603645 41418903 0100003433
S0279 01350126 11217708 1 11217708 4011654 0100003733
注 : 3 P < 0105, 33 P < 0101; Salk编号采用简写 ;下表同
具 ,如 NRm s突变体 [ 10 ]。
AM T或 N R基因的沉默对植物吸收利用氮产生
了影响。低氮培养基上的拟南芥 T2DNA突变体在
吸收利用氮合成叶绿素、酶 ,积累生物质等方面与野
生型拟南芥相比存在差异。将这些生理性状量化 ,
找出有显著差异的 T2DNA突变体 ,能够为进一步深
入研究植物氮代谢机制及信号通路提供基础。
每一个突变体株系随机挑选 1 000株 ,分别移苗
至正常 MS培养基和氮浓度为 0 mmol/L时的低氮培
养基上 , 6 d后统计叶绿素含量 ,百株干物重及全氮含
量 (图 3)。结果发现培养基中的氮浓度正常时 , T2
DNA突变体普遍较野生型对照生长状况差 ,说明在
正常培养基中 , T2DNA突变体利用氮的效率降低。当
培养基中的氮浓度为 0 mmol/L时 ,与野生型对照相
比 , AMTm s中的 S887和 C622; NRm s中的 S164、
S547、S996、S068、CS421、S237、S320和 S0279方差分
析结果达到显著水平 ,其中 S887、C622、S164、S237、
S320、S0279达到了极显著水平 (表 2,表 3,表 4)。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
3　结论与讨论
植物吸收氮按动力学特征主要分为高亲和转运
系统 ( HATS)和低亲和转运系统 (LATS) [ 11 ] , LATS
在植物中表现为组成型表达 ,对氮调节不敏感 ,
HATS在植物中缺氮时被诱导 ,细胞内高铵或者铵
的代谢物如谷氨酰胺则抑制其活性 [ 12 ]。研究中发
现在氮浓度低于 1 mmol/L的情况下 ,野生型拟南芥
叶绿素等生理指标表明虽然植物的生长受到严重干
扰 ,但植物并没有停止吸收利用周围环境中的氮营
养 , HATS在这个过程中起了主要作用 ,帮助植物应
对缺乏营养的不利环境。在低氮环境下与对照相
比 , AMTm s和 NRm s吸收利用氮的能力与效率存在
差异 ,这种差异为揭示植物氮吸收利用的途径及调
控机制提供了可加利用的信息。
a～c1正常 MS培养基和低氮培养基中 AMTm s的叶绿素含量、百株干物重、全氮含量 ; d～f1正常 MS
培养基和低 N培养基中 NRm s的叶绿素含量、百株干物重、全氮含量
图 3　T2D NA突变体在低氮培养基上的生理检测结果
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2009年第 6期 　　　　刘菲等 :拟南芥氮代谢相关基因 T2DNA插入突变体低氮响应的初步研究
表 3　低氮培养基上 T2D NA突变体百株干物重的方差分析结果
Salk编号 μ SS df M S F P
S887 01032833 01001558 1 01001558 20117887 0100014333
S594 01037277 01001158 1 01001158 13918899 0100029333
C622 01032033 01001637 1 01001637 22119894 0100011833
S164 01084467 01000565 1 01000565 78180968 0100088933
S547 01035333 01001326 1 01001326 13019951 0100033333
S996 010451 01000598 1 01000598 87121463 0100073233
S068 010563 01000115 1 01000115 11183995 010262723
CS421 010764 01000193 1 01000193 18163915 010124743
S237 01035 01001356 1 01001356 19512025 0100015233
S111 01079 01000291 1 01000291 41150214 0100298733
S320 01052233 01000247 1 01000247 38140026 0100344833
S029 01043833 01000676 1 01000676 81144701 0100083533
S0279 01037867 0100111 1 0100111 1791331 0100018033
表 4　低氮培养基上 T2D NA突变体全 N含量的方差分析结果
Salk编号 μ SS df M S F P
S887 11755667 01033421 1 01033421 10891987 0100000533
S594 11513067 01013067 1 01013067 12012067 0100039333
C622 11486 01021744 1 01021744 16116913 0100022033
S164 11866667 01101608 1 01101608 54110495 0100182033
S547 11826467 01072644 1 01072644 15167016 010166983
S996 115696 01002031 1 01002031 91077487 010394383
S068 115128 01013141 1 01013141 17135267 010140813
CS421 11096833 01389487 1 01389487 1023414 0100000133
S237 210302 0126941 1 0126941 29411314 0100000633
S111 118555 01093076 1 01093076 17310057 0100019333
S320 210892 01349644 1 01349644 92118181 0100065833
S029 11646833 01002452 1 01002452 01270027 01630745
S0279 11676267 01007322 1 01007322 23108647 0100861833
　　铵态氮主要以 NH4 +与 NH3 两种形态在溶液中
处于动态转化中 ,其中 NH4 +占绝对优势 [ 13 ]。铵态氮
转运主要由 NH4 +特异转运蛋白 AMT完成。拟南芥
基因组中的 6个 AMT基因可分为 A tAM T1和 A tAM T2
两个亚家族 ,其中 A tAM T111和 A tAM T113被敲除后 ,
拟南芥缺氧根系对铵的吸收分别下降 30% ,双缺失
则可减少铵吸收高达 70% [ 14 ]。但有研究报道 ,绝大
多数突变体生长只受到轻微影响 ,表明剩余的铵转运
蛋白在多数情况下可以满足拟南芥的生长需要 [ 15 ]。
试验中选用的 3个 AMTm s在低氮环境中生长
的叶绿素含量和干物重与对照相比都有显著降低 ,
全氮含量与对照相比虽然存在差异 ,但并非完全不
能吸收利用培养基中的氮素 ,这表明 ,基因家族中的
其他成员对氮素的吸收利用也起了重要作用 ,存在
补偿效应。
随着基因组学和生物信息学的发展 ,已经系
统揭示了许多氮代谢相关基因家族的大小和成
员 ,但还需大量工作来鉴定其功能。目前 ,对氮素
转运蛋白的表达和活性调控机制还知之甚少 ,这
将是今后研究的重点。氮素转运蛋白与植物体内
其它组分的相互作用也使植物氮代谢研究更加复
杂而有趣。在研究手段上需要生理学和遗传学等
传统技术与生物信息学、基因组学、分子生物学等
现代生物学技术结合应用 ,将氮代谢融入植物整
体代谢调节和信号传递网络中 ,从而更深刻地了
解氮代谢的机制和生理功能 ,为将来在生产和科
研实践中的应用提供基础。
(下转第 99页 )
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