全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
捷安肽素高产突变株 96孔板筛选方法的建立
陈芬 1, 2 张晓勇 1 钟娟 1 周金燕1 李志东1 杨杰 1 谭红 1
( 1中国科学院成都生物研究所应用与环境微生物研究中心,成都 610041; 2中国科学院研究生院生命科学院,北京 100049)
摘 要: 建立了一种快速灵敏地筛选出捷安肽素 ( JAA )高产突变株的方法。主要利用 96多孔板固体培养菌体, 用 50%
乙醇为最佳浸提液浸提 4 h,滤纸片法检测 JAA生物活性的点样量为 100 L, 筛选出 5株高产突变株,经摇瓶复筛选出 2株高
产突变株, 经一剂量法检测,其抑菌圈直径较出发菌株提高了 14%左右。
关键词: 捷安肽素 96孔板 浸提 滤纸片法 初筛方法
Establishnent of a 96wellM icroplate ScreeningM ethod for
H igh Yield Strains of Jieanpeptide
Chen Fen
1, 2
ZhangX iaoyong
1
Zhong Juan
1
Zhou Jinyan
1
L iZhidong
1
Yang Jie
1
Tan H ong
1
(
1
Center for App lied and Environm entalM icrobiology, Chengdu Institute of B iology, Chinese A cademy of Sciences, Chengdu 610041;
2
College of L ife Science, Graduate University of Chinese A cademy of Sciences, B eijing 100049)
Abstrac:t A m ore rapid and sensitive screeningm ethod w as construc ted in th is a rtic le in o rder to screen out the highy ie ld ingmu
tants o f Jieanpeptide( JAA ). The m ethod included so lid cu lture stra ins in 96we ll m icrop la te, extrac tion ac tive ing red ients o f JAA w ith
50% e thano l for four hours, the filter paperm e thod to detect b io log ical activ ity of JAA. 100 L w as them ost appropr iate testing dosage
for the filter paper me thod. F ive h ighy ie ld mu tants w ere obtained by the screening m ethod. Tw o o f them we re chosen, through shake
flask ferm enta tion, wh ich ensured they we re highproduc ing stra ins. D iam e ters of antiblastic c irc les of them we re increased by about
14% compared w ith the sta rting stra in through one dosage technique.
Key words: Jieanpeptide 96w ellM icrop late Ex trac tion F ilter paper m ethod P rescreen ing m ethod
收稿日期: 20091125
基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向项目 ( KSCX2YWG0392)
作者简介:陈芬,女,硕士研究生,研究方向:微生物学; Em a i:l ch en jie19840000@ 126 com
通讯作者:谭红,研究员,研究方向:工业微生物学; Em ai:l abath@ cib ac cn
捷安肽素 ( JAA )是一种具有广谱抗真菌活性
的抗菌多肽, 可广泛用于防治各种作物、蔬菜和瓜
果的真菌病害 [ 1 ] , 具有稳定性好、抑菌持久、不易
产生抗药性和对环境安全等优点, 因此捷安肽素
是一种极具研究开发价值和应用前景的新型生物
农药 [ 2]。
由于 JAA菌株产素水平还不够高,微生物发酵
生产 JAA未能实现工业化生产。菌种选育在提高
微生物产物产量和纯度等方面都具有重要的作
用 [ 3, 4] ,是实现工业化生产的基础,而快速灵敏的筛
选方法是获得高产突变株的必要手段 [ 5]。目前,
JAA高产突变株的初筛是通过比较诱变后的单菌落
在初筛平板上形成的抑菌圈直径和菌落直径的比值
(抑菌比法 )进行,但是由于现在的试验菌株已经是
经多轮诱变后的高产突变株了, 抑菌比法已不能灵
敏的体现出突变株 JAA产量的变化。因此,寻找快
速、较大通量的菌种筛选方法是选育 JAA高产突变
株亟需解决的问题。本研究报道了用 96孔板建立
一种灵敏、快速筛选出 JAA高产突变株的筛选新
方法。
1 材料与方法
11 材料
111 菌种 芽孢杆菌属 ( Bacillus sp. )代号为
UV146,由本实验室从产自新疆阿克苏的棉株上分
离纯化得到菌株,经紫外诱变获得。疫霉属 (Phyto
phthora sp. )代号 C1, 由本实验室从产自新疆吐鲁
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
番的甜瓜病株上分离纯化获得。
112 培养基 斜面菌种培养基 (% , w /v ): 蛋白
胨 20, M gSO4 7H 2O 015, K 2HPO4 015, 甘油 10,
琼脂粉 17, pH70。初筛平板培养基: 085 NA +
015 PDANA培养基 (% , w /v ): 牛肉膏 03, 蛋白胨
10, NaC l 05, 琼脂 20, pH70; PDA培养基 (% ,
w /v ) :马铃薯 20, 葡萄糖 20, 琼脂 20, pH 自然。
多孔板培养基 (% , w /v ): 葡萄糖 30, 蛋白胨 25,
酵母膏 005, M gSO4 7H2O 03, KH 2 PO 4 02, 琼脂
20, pH80。摇瓶发酵培养基 (% , w /v ) : 葡萄糖
33,酵母膏 008, M gSO4 7H 2O 055, KH2 PO4 011,
黄豆粉水解液 24 (%, v /v ), pH80。疫霉属 (Phy to
phthora sp. )代号 C1菌培养基: PDA培养基,同上。
113 主要试剂 蒸馏水,乙醇,无水甲醇,乙酸铵。
12 方法
121 菌株诱变 以 UV146为出发菌株制备成菌
悬液, 然后进行紫外、微波和亚硝基胍诱变, 具体方
法参考文献 [ 6]。
122 单菌落的获得 将方法 121获得的菌悬
液进行 10倍系列依次稀释,吸取 103倍稀释后的菌
悬液 50 L涂布在初筛平板培养基上, 30 倒置培
养 24- 36 h, 获得单菌落。
123 多孔板初筛方法的建立 吸取 150 L多孔
板培养基,注入 96孔板的孔内, 待凝固后,用无菌竹
签挑取由方法 122获得的单菌落,接种在 96孔板
的每个孔内 (每个单菌落做 3个重复 ) , 接种时, 要
保证接种量一致, 还要尽量涂布均匀。30 静置培
养 48 h。
将多孔板培养中获得的菌落连同培养基一起从
多孔板里取出,放入对应标号的 2 mL离心管中,在
离心管中加入 450 L的浸提液,然后用超声波细胞
破碎仪进行破碎, 浸提合适的时间后, 12 000 r /m in
离心 5m in,取上清液测定 JAA生物活性。 ( 1)最佳
浸提液的筛选研究:分别用蒸馏水 ( pH70)、50%乙
醇、甲醇乙酸铵混合液 (甲醇!50 mM乙酸铵 = 8!2)
作为浸提液浸提相同时间后,测定浸提液中 JAA的
活性, 以确定最佳浸提液。 ( 2)最适浸提时间的筛
选研究:用浸提液分别浸提了 05、45、85、125 h
后,测定浸提液中 JAA的活性, 以确定最佳浸提时
间。 ( 3)滤纸片法检测 JAA生物活性: 往 50 保温
的 PDA培养基中加入 1%的疫霉属 C1菌液, 充分
混匀后制成测定平板,再将加样后的无菌滤纸片贴
于平板上, 30 培养 60 h, 以检测浸提液中 JAA的
活性。分别吸取由浸提液离心后获得的上清液 50、
80、100 L,点在直径为 9 mm的滤纸片上, 待其干
燥后, 121 灭菌 30m in,测定浸提液中 JAA的活性
以确定最佳点样量。
124 多孔板初筛方法的验证 ( 1)初筛: 随机
挑选 102株诱变后的菌株, 按照以上确立的方法
进行初筛, 挑选滤纸片法生测活性较高的菌株进
行复筛。将 D抑 ( mm )大于或者小于出发菌株的
D抑 ( mm ) 5%的菌株定义为突变菌株。 ( 2)复筛:将
初筛选出的高产突变株,接种在装有 60 mL摇瓶发
酵培养基的 250 mL三角瓶中, 30 , 150 r/m in振
荡培养 48 h, 取样, 管碟法 [ 7]检测发酵液中 JAA
活性。
125 高产突变株株遗传稳定性检测 将复选出
的高产突变株在斜面菌种培养基中连续传代 5次,
将不同传代次数的菌株在最适条件下进行摇瓶发酵
培养, 并测定发酵液中 JAA活性, 以观察遗传稳
定性。
2 结果与分析
21 多孔板培养
将方法 122获得的单菌落接种在 96孔板上,
培养 48 h, JAA菌株生长良好,各孔内菌落的大小比
较一致,见图 1。
图 1 多孔板培养 JAA菌株
204
2010年第 3期 陈芬等:捷安肽素高产突变株 96孔板筛选方法的建立
22 最佳浸提条件及滤纸片法检测 JAA生物活性
条件的确定
从表 1可以看出,不同浸提条件下的样品在点样
50 L时均无法检测出生物活性。点样量为 80 L
时,浸提不同时间后的蒸馏水 ( pH70)浸提液均无法
检测出生物活性, 而 50%乙醇和甲醇乙酸铵混合液
(无水甲醇!50mM乙酸铵 = 8!2)浸提液都能检测出
生物活性,但是二者的浸提效果差异不显著,而且抑
菌圈太小,且边缘较模糊和不平整,不易测量。
点样量为 100 L时, 蒸馏水 ( pH70)浸提液在
分别浸提 05 h、45 h条件下均能检测出 JAA生物
活性, 而在分别浸提 85 h和 125 h的条件下则无
法检测出 JAA生物活性,表现出蒸馏水 ( pH70)的
浸提效果不稳定。 50% 乙醇和甲醇乙酸铵混合液
(无水甲醇!50mM乙酸铵 = 8!2)浸提液分别在浸
提 05、45、85和 125 h的条件下都能检测出 JAA
活性。通过 SPSS软件分析,在浸提相同时间的条件
下, 50%乙醇和甲醇乙酸铵混合液 (无水甲醇!50mM
乙酸铵 = 8!2)浸提液中 JAA的生物活性差异不显
著。但由于甲醇对人体毒性较大, 所以确定最佳浸提
液为 50%乙醇,滤纸片法生测的点样量为 100 L。
在浸提液为 50%乙醇时, 除浸提 05 h条件下
的 JAA活性较小外,其它各浸提时间的 JAA活性较
一致,经 SPSS软件分析, 差异不显著, 说明 50%乙
醇的浸提效果比较稳定,且 45 h就将 JAA活性成
分完全浸提,所以确定最佳浸提时间为 45 h。由以
上结果确定最佳浸提条件及滤纸片法检测 JAA生
物活性测条件为: 最佳浸提液为 50%乙醇; 最适浸
提时间为 45 h; 滤纸片法检测 JAA生物活性时的
点样量为 100 L。
表 1 最佳浸提条件和滤纸片法生测条件测定结果
浸提时间 ( h)
浸提液
D抑 ( mm ) CK 05 45 85 125
50
80
100
水 ∀ ∀ ∀ ∀ ∀
50%乙醇 ∀ ∀ ∀ ∀ ∀
甲醇乙酸铵混合液 ∀ ∀ ∀ ∀ ∀
水 ∀ ∀ ∀ ∀ ∀
50%乙醇 ∀ 1050 1123 1132 1146
甲醇乙酸铵混合液 ∀ 1055 1119 1197 1198
水 ∀ 1124 1149 ∀ ∀
50%乙醇 ∀ 1157 1249 1245 1241
甲醇乙酸铵混合液 ∀ 1181 1246 1245 1249
注:表中数据为 n= 6测定之平均值
23 多孔板初筛方法的验证
231 多孔板初筛 对方法 122获得的 102株
诱变后的菌株进行多孔板初筛,以诱变前的出发菌
株作为对照,结果见表 2。通过 SPSS( 115)软件对
102株诱变后菌株的生物活性检测结果进行方差分
析,筛选出与出发菌株差异显著的 5株高产突变株,
结果见表 3。
232 摇瓶复筛 为了验证多孔板初筛效果,将初
筛选出的 5株高产突变株进行摇瓶复筛,选出 2株高
产突变株 (编号为 JAA7和 JAA94),结果见表 4。
表 2 多孔板初筛结果
菌株数 正突变率 (% ) 负突变率 (% )
正突变株 18 18 ∀
负突变株 27 ∀ 27
未突变株 57 ∀ ∀
菌株总数 102 ∀ ∀
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
表 3 多孔板初筛的生物活性检测结果
菌株编号 JAA7 JAA16 JAA94 JAA96 JAA101 CK
D抑 ( mm ) 1330 1367 1509 1483 1482 1209
显著性检验
( = 001) * * * * * * * * * * ∀
注:表中数据为 n= 6测定之平均值; CK为出发菌株; * * 表示在
001水平上差异显著
表 4 摇瓶复筛生物活性检测结果
菌株编号 JAA7 JAA94 CK
D抑 (mm ) 1846 1866 1627
显著性检验 ( = 001) * * * * ∀
注:表中数据为 n= 3测定之平均值; CK是出发菌株; * * 表示在
001水平上差异显著
233 高产突变株的遗传稳定性 将复筛选出的
菌株 JAA7和94按照方法 125进行遗传稳定性
检测, 结果见表 5。其形成的抑菌圈直径稳定在 18
mm左右,说明其遗传性状是稳定的。
表 5 JAA7和 JAA94各传代数的
生物活性检测结果
传代数
D抑 (mm )
菌株编号
F1 F2 F3 F4 F5
JAA7 1835 1836 1833 1836 1817
JAA94 1826 1813 1824 1815 1810
注:表中数据为 n= 6测定之平均值
3 讨论
高通量筛选 ( high throughput screening, HTS)是
将许多模型固定在各自不同的载体上,自动化加样,
培养后,用计算机纪录结果, 并进行分析处理, 使筛
选从繁重的劳动中解脱出来, 实现了快速、准确、微
量筛选 [ 8- 12]。不过,自动筛选仪器的一次性设备投
资费用很大, 设备的保养费和软件的费用也不
菲 [ 2]。本研究借鉴了高通量筛选的思路, 建立了 96
孔板筛选 JAA高产突变株的方法, 该筛选方法不仅
能更灵敏地筛选出高产突变株,而且还大大减少了
工作量,提高了初筛的准确性和进度,基本上实现了
对 JAA高产突变株的较大通量筛选。其优点有:使
用 96多孔板固体培养 JAA菌株,不仅节约资源,而
且可以同时培养成百上千的菌株, 从而提高了筛选
速度;使用滤纸片法检测生物活性不仅所需样品微
量, 而且通量高,在直径为 9 cm的平皿上可以放置
6个滤纸片, 如果使用直径为 12 cm或者更大的平皿
则可以放置更多的滤纸片。另外,通过 96孔板固体
培养菌株的方法来筛选 JAA高产突变株, 还未见
报道。
此方法的不足之处在于, 由于多孔板培养基的
量比较少,操作步骤有点繁琐,存在一定的误差。因
此该方法具有一定的适用范围, 只能筛选出较出发
菌株活性有显著提高的突变株。为筛选其他突变菌
株提供了一种思路与借鉴。如果能在多孔板上, 通
过自动化操作实现对多孔板培养所产生的 JAA活
性成分灵敏快速的检测,将极大地简化筛选工作,提
高筛选效率,但这还有待于进一步的研究。
参 考 文 献
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