全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
重组人睫状神经营养因子肽图分析
杨光 1 李祎 1 项光亚2
( 1江汉大学医学院,武汉 430056; 2华中科技大学同济医学院药学院,武汉 430030)
摘 要: 建立重组人睫状神经营养因子 ( recomb inant hum an c ilia ry neurotrophic fac tor, rhCNTF)的肽图分析方法,用于 rh
CNTF的质量控制。胰蛋白酶对 rhCNTF进行酶切后,利用 RPH PLC方法对酶切液进行分析, 以获得胰蛋白酶切最佳条件及
色谱条件, 并对连续 3批样品进行分析。 rhCNTF的胰蛋白酶最佳酶切条件为 37 酶切 24 h,以 A( 0 1% TFAH
2
O)、B ( 0 1%
TFACH3CN)为流动相, 采用梯度洗脱的方法对酶切液进行分析, 结果连续 3批 rhCNTF制备产品的肽图完全一致,且其检出
峰数目与理论推测值相符。 3批产品肽图的一致性为 rhCNTF产品的结构同一性提供了有利证据,同时,建立了 rhCNTF产品
质量控制的一项指标。
关键词: 重组人睫状神经营养因子 肽图 RPHPLC系统 胰蛋白酶
PeptideMapping Analysis of RecombinantHuman
Ciliary Neurotrophic Factor
Yang Guang
1
L iY i
1
X iangGuangya
2
(
1
M edical College of J ianghan University, Wuhan 430056;
2
T ongjiM edical College of H uazhong University of Science& Technology, Wuhan 430030)
Abstrac:t To establish standards peptide m apping me thod, prove the structural hom ogene ity of three batches o f recom binant hu
m an c ilia ry neurotroph ic factor in preparation, and se t up an index for quality contro l in rhCNTF produc tion. To exp lore the best trypsin
hydro lyz ing and chroma tog raphy cond itionsw ithH PLC system and autom a tic sam pler o f contro lling temperature. The peptidem aps of rh
CNTF produc ts w ere h ighly identica,l and the numbers o f detec ted peaks in m aps correspond to the theo re tica l deduction. The identica l
m aps o f three batches reflect the structura l hom ogene ity of rhCNTF in preparation. These peptidem aps se t up an index for qua lity con
trol in rhCNTF production.
Key words: Recom binant hum an ciliary neuro troph ic factor Peptidem apping RPHPLC system T rypsin
收稿日期: 20100414
作者简介:杨光,女,硕士研究生,主要从事新药合成与药物色谱分析研究; Em ai:l sun sh ine77@ 126. com
通讯作者:项光亚,男,博士,教授,主要从事靶向药物传递系统和药物合成研究; Em ai:l you jit@i m ails. tjm u. edu. cn
睫状神经营养因子 ( c iliary neuro trophic factor,
CNTF)最初是从鸡胚脉络膜、虹膜、睫状体中提取出
来,具有维持鸡副交感神经节的活性而得名 [ 1 ]。
CNTF能促进多种神经细胞的存活, 是第一个被发
现的能维持在体和离体脊髓运动神经元的存活及突
起生长的神经营养因子, 又称为抗损伤因子和多功
能因子 [ 2]。CNTF还具有骨骼肌营养作用, 能够促
进神经元损伤的修复 [ 3] , 在神经系统发育、分化中
具有非常重要的作用。
基因工程药物 ( genetic recomb inant drug )中杂
质和有害物的质量控制研究是一个极为重要的课
题。尤其是当用于生产基因工程药物的重组体发生
突变或对目的产品进行修饰、纯化时,都有可能产生
或带入一些与目的产品相关联的、结构相差甚微而
生物活性迥异的变异体。因此, 除了要加强对原材
料及生产过程的控制外, 还必须通过各种手段严格
保证每一批次终产物的一致性和安全性,从而有效
地控制基因工程药物的产品质量 [ 4 ]。
目前, 控制基因工程药物一致性的一个重要手
段就是肽图分析 ( peptide mapp ing analysis)。肽图
分析是根据蛋白质的分子量大小以及氨基酸组成特
点, 使用专一性较强的蛋白水解酶 [一般为肽链内
2010年第 11期 杨光等:重组人睫状神经营养因子肽图分析
切酶 ( endopeptidase) ]作用于特殊肽链位点, 将蛋白
裂解成较小片段,通过一定的分离检测手段形成特
征性的指纹图谱。肽图分析对于蛋白质结构研究和
特性鉴别具有重要意义, 已成为许多基因工程药物
产品质量标准控制的重要方法 [ 5, 6]。目前常用的方
法有 CNBr裂解 SDSPAGE方法和胰蛋白酶切 RP
HPLC肽图法。胰蛋白酶切 RPHPLC方法具有更
高分辨率及检测灵敏度。这是由于蛋白质分子通过
色谱柱时会发生去折叠化, 内部某些疏水残基暴露
并与固定相相互作用, 表现出与其它色谱及电泳方
法不同的选择性,从而提供其它方法不能提供的信
息,这使得该法在蛋白质及多肽分离分析中得到广
泛应用。本研究采用胰蛋白酶对 rhCNTF进行酶
解,以 RPHPLC法对酶解的肽段进行分析,以建立
rhCNTF的质量控制方法。
1 材料
11 仪器和设备
W aters高效液相色谱系统: 600Pump717Auto
Sampler996PDA, M illennium32色谱分析软件和 W a
ters Symme tryC18反相色谱柱 ( 5 m, 39 mm
150mm )。
12 试药
重组人睫状神经营养因子理化测定对照品 (批
号: 070831, 湖北丝宝集团生科所提供 ) ; 重组人睫
状神经营养因子 3批制备原液 (批号: 081104、
081117和 081125) ; 胰蛋白酶 (测序级, ROCHE公
司 ) ; 三氟乙酸 ( TFA, 美国 SIGMA 公司 ); 乙腈
( CAN,色谱纯, 美国 F isher Sc ien tific公司 ) ;超纯水
(M illiQ超纯水仪制备 );透析袋 (美国 F isher Scien
t ific公司 );所用其它试剂均为国产分析纯。
2 方法
21 样品预处理
将 1 mL浓度为 3 mg /mL的 rhCNTF081104批
原液置于透析袋中,以 300mL的 1%碳酸氢铵为透
析液, 在冰浴条件下透析 4 h。然后, 取浓度为
1 mg /mL透析后的样品 400 L至微量进样瓶中,再
加入 01 mg /mL的胰蛋白酶 8 L并混匀。
22 酶切条件
将预处理后的样品在 37 恒温下进行酶切。
每 70m in进样 1针,进样量为 100 L,检测波长 214
nm,利用 RPHPLC监测最佳酶切时间。在第 19针
进样后, rhCNTF已被完全酶切, 酶切时间在 22- 26
h范围内的肽图图谱基本一致。因此, 确定最佳酶
切条件为 37 保温 24 h。
23 色谱条件
RPHPLC肽图分析条件:柱温 ( 30 5) ;流速
1mL /m in;上样量 100 L; 检测波长 214 nm。流动
相 A 为 01% TFAH 2O; 流动相 B为 01% TFA
ACN;梯度洗脱程序为: 0 - 2 m in, B: 2%; 2 -
60m in, B: 2% - 40% ; 60- 61m in, B: 40% - 2% ; 61
- 70 m in, B: 2%。
3 结果
31 理论裂解位点
rhCNTF共含 185个氨基酸,分子量约为 24 KD,
胰蛋白酶专一裂解 Lys(赖氨酸 )及 A rg(精氨酸 )羧基
端的肽键。 rhCNTF分子中分别含 7个 Lys和 11个
Arg。利用 DNAStar蛋白质序列分析软件进行 CNTF
全突变体的胰蛋白酶酶切后的理论肽段数分析,理论
上有 18个裂解位点和 19个 ( T1- T19)肽段。
32 连续 3批 rhCNTF制备样品肽图分析
RPHPLC可以分离极性差异微小的肽段,我们
通过氨基酸序列分析得到 rhCNTF裂解后的理论肽
段数为 19, 图 1为试验条件下 081104、081117和
081125连续 3个批号的产品进行胰蛋白酶水解肽图
分析。从 rhCNTF 3批样品的肽图分析结果可以看
出,其 19个峰的峰型及出峰时间上比较是完全一
致的。
33 冻融样品、氧化样品和酸降解样品的肽图分析
同时还采用上述方法对冻融样品、氧化样品
和酸降解样品进行肽图分析, 考察了不同供试品
溶液胰蛋白酶酶切的肽图图谱的变化, 结果见
图 2。
由图 2可见反复冻融对样品的肽图基本没有影
响。酸降解样品溶液的肽图则发生了较大的变化,
对于其降解后结构的改变与峰形的变化之间的关系
还有待于进一步的探讨。氧化作用促进了样品的降
解,大峰消失增加了很多细小的峰。说明该样品在
氧化及酸性条件下是不稳定的, 因此肽图有助于研
究样品在不同条件下的变化情况, 确定样品适宜的
贮存环境与条件。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
A.对照品 070831; B. 081104; C. 081117; D. 081125
图 1 连续三批 rhCNTF的胰蛋白酶酶解肽图谱
A.冻融样品; B.氧化样品; C.酸降解样品
图 2 不同试品溶液胰蛋白酶切肽图图谱
4 讨论
41 透析条件的确定
蛋白质样品在预处理过程中, 需在冰浴条件下
进行透析,透析后的样品澄清, 未见任何混浊及沉淀
现象。而在室温条件下,因温度过高,样品会出现明
显乳光现象,易导致蛋白质变性, 肽图分析结果会受
影响。
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2010年第 11期 杨光等:重组人睫状神经营养因子肽图分析
42 胰蛋白酶的选择
比较普通胰蛋白酶与测序级胰蛋白酶酶切后的
肽图, 发现普通胰蛋白酶酶切后的图谱比较杂乱不
易辨认,难以针对每个峰具体分析;而测序级胰蛋白
酶测得的肽图背景干净、重复性好, 更适用于样品
检测。
43 色谱条件的优化
431 色谱柱的选择 用 RPHPLC进行肽图分
析,首先需要选择合适的反相柱,即需要根据酶解后
肽段的大小和极性来选择合适的色谱柱。分别对相
同酶浓度和酶解时间的同一样品的酶解液, 用 C4、
C8和 C18柱进行了分析。结果表明,重组人睫状神经
营养因子的酶解液以 C18柱进行 RPHPLC的肽图分
析较好,易得到理想的分析结果。
432 流动相和柱温的选择 三氟乙酸 乙睛 水
和七氟丁酸乙睛水体系是目前在反相色谱系统中
分离蛋白质和肽段公认的最佳流动相选择, 由于七
氟丁酸较为昂贵, 本试验选用了三氟乙酸 乙睛 水
体系,通过梯度洗脱可以达到满意的分离效果。同
时柱温对该样品肽图的测定影响不大, 因此采用室
温进行检测。
433 检测波长的选择 由于蛋白质中存在肽键,
在 214 nm处有最大吸收 [ 7 ] ,因此选择 214 nm作为
蛋白类样品的肽图分析检测波长较有意义。应该考
虑到, 样品中的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香氨
基酸的含量高低与 280 nm处的最大吸收呈正相关,
可能会对分析结果造成影响, 而重组人睫状神经营
养因子中芳香氨基酸的含量占氨基酸总量极少, 因
此, 选择 214 nm比 280 nm进行检测更为科学,这与
试验结果一致。
参 考 文 献
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