全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
黄曲霉素合成相关基因表达与环境因素的关系
路子显 伍松陵 孙长坡
(国家粮食局科学研究院,北京 100037 )
摘 要: 简单介绍了黄曲霉毒素的发现、分布、危害和范围,详细叙述了黄曲霉毒素生物合成中相关基因的表达与调控, 概
述了黄曲霉毒素合成中的关键基因、酶和调控因子重要性, 分析了影响黄曲霉毒素合成的环境因素。不仅在基础理论上对黄曲
霉毒素合成机理进行了深入探讨,而且在应用研究上为减少粮食和食品受到重金属污染和黄曲霉毒素危害提供了新的思路。
关键词: 黄曲霉毒素生物合成 基因表达与调控 环境因素 重金属污染 粮食与食品
The Relationship of Aflatoxin B iosynthetic Gene Expression
and Environmental Factors
Lu Z ix ian Wu Songling Sun Changpo
(A cademy of S tateAdm inistration of Grain, Beij ing 100037)
Abstrac:t Th is paper simp ly introduced d iscovery, d istr ibu tion, damage and ex tent o f afla tox in. B io syn thetic genes and re la ted en
zym es o f aflatox in w ere a lso clar ified. Expression and regu lation of these genes in a flatox in b iosynthesis w ere desc ribed in the deta ils.
Key genes, enzym es and regulators o f a flatox in synthes is w ere summ arized. Env ironm enta l fac to rs o f aflatox in biosynthesis were analys
ized. A flatox in biosyn theticm echanism w as d iscussed deeply on the basic theo ry. A t last, we prospected how to reduce heavym eta l po l
lu tion and a flatox in dam age in g ra in and food by genetic eng ineer ing research and explor ing the relationsh ip o f a flatox in b iosynthetic
gene and env ironm enta l facto rs.
Key words: Aflatox in b iosynthesis Expression and regu la tion of gene Env ironm en tal factors H eavy m eta l po llution G rain
and food
收稿日期: 20100427
作者简介:路子显,男,副研究员,博士,研究方向:粮食生物技术; Em ai:l lzx@ ch inagrain. org
20世纪 60年代,在英国发生的 10万只火鸡突
发性死亡事件被确认与从巴西进口的花生粕有关。
进一步的调研证明, 这些花生粕被一种来自真菌的
有毒物质所污染,这些研究工作最终使人们发现了
黄曲霉 ( Asp erg illus f lavus )产生的一类有毒代谢物
质,它们被称为黄曲霉毒素 ( A flatox ins, AF)。黄曲
霉毒素是黄曲霉菌属黄曲霉菌、寄生曲霉菌产生的
代谢物, 剧毒,同时还有致癌、致畸、致突变的作用,
主要引起肝癌, 还可诱发骨癌、肾癌、直肠癌、乳腺
癌、卵巢癌等。黄曲霉毒素是目前发现的化学致癌
物中最强的物质之一。黄曲霉菌广泛存在于土壤
中,菌丝生长时产生毒素, 孢子可扩散至空气中传
播,在合适的条件下侵染寄生体,产生黄曲霉毒素。
黄曲霉毒素是生长在食物及饲料上的黄曲霉和
寄生曲霉的代谢产物,特曲霉也能产生黄曲霉毒素。
主要是黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2以及由 B1和 B2
在体内经过羟化衍生而成的代谢产物 M1、M2等 10
多种。B1、B2在紫外光照射下为蓝色, G1、G2为绿
色荧光。黄曲霉毒素主要存在于被黄曲霉污染过的
粮食、油及其制品中。例如,黄曲霉污染的花生、花
生油、玉米、大米和棉籽中最为常见, 在干果类食品
如胡桃、杏仁、榛子和干辣椒中,在动物性食品如肝、
咸鱼中以及在奶和奶制品中也曾发现过黄曲霉毒
素。花生是最容易感染黄曲霉的农作物之一, 黄曲
霉毒素对花生具有极高的亲和性。黄曲霉的侵染和
黄曲霉毒素的产生不仅发生在花生的种植过程 (包
括开花、盛花、饱果、成熟、收获 )中, 而且在加工过
程 (包括原料收购、干燥、加工、仓储和运输过程 )中
2010年第 11期 路子显等:黄曲霉素合成相关基因表达与环境因素的关系
也会产生。花生中黄曲霉毒素主要有 B1、B2、G1、
G2,其中 B1的毒性最强、产毒量最大。黄曲霉毒素
主要存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米中。
1 黄曲霉毒素的生物合成途径
自从 20世纪 70年代, 人们对黄曲霉毒素的生
物合成过程开展了全方位的研究。从柄曲霉素
( sterigm atocystin)向黄曲霉毒素 B1的转变,黄曲霉
毒素产生的抑制以及它的中间体识别, 在黄曲霉毒
素生物合成途径中敌敌畏抑制的步骤, 敌敌畏在黄
曲霉毒素和杂色曲霉素 A ( versico lo rin A )生产中的
效应, 黄曲霉毒素 B1的生物合成及其途径, 通过黄
曲霉菌物细胞提取物使柄曲霉素向黄曲霉毒素 B1
的酶促转变,以及在黄曲霉毒素生物合成研究中真
菌原生质的利用。到了 80年代,许多科学家对黄曲
霉毒素的生物合成过程进行了更加深入的研究。对
杂色曲霉素 A生物合成的调查, 通过有机磷化合物
对黄曲霉毒素的生物合成的抑制, 以及在黄曲霉毒
素的生物合成中反式呋喃结构的酶促形成等 [ 1 ]。
20世纪 90年代,人们普遍认为黄曲霉毒素 B1
的生物合成途径为如下过程: 乙酸 聚酮化合物
( po lyket ide) 诺素罗瑞尼克酸 ( norso lor in ic acid,
NA ) 奥佛兰提素 ( averant in, AVN ) 奥佛鲁凡素
( averufan in) 奥佛尼红素 ( averuf in, AVF) 羟基
杂色酮 ( hydroxyversico lorone, HVN ) 杂色半缩醛乙
酸 ( versiconal hem iaceta l acetate, VHA ) 杂色曲霉
素 B ( versico lorin B ) 杂色曲霉素 A( versico lorin A,
VA ) 柄曲霉素 ( sterigmatocystin, ST) O甲基柄曲
霉素 ( Omethy lsterigmatocystin, OM ST) 黄曲霉毒素
B1( aflatox in B1, AFB1)。在黄曲霉毒素 B1合成中
或合成后, 相继衍化出黄曲霉毒素 B2、G1、G2、M1
和 M2。例如: 二氢柄曲霉素 ( d ihydrosterigm atocys
t in, DHST) 二氢 O甲基柄曲霉素 ( d ihydroOmeth
ylsterigm atocystin, DHOMST) 黄曲霉毒素 B2( afla
tox in B2, AFB2)
[ 2]。
2 黄曲霉毒素的生物合成中的相关酶类
在黄曲霉毒素的生物合成中至少有 18个酶促
反应。 Bhatnagar等研究了催化 ST 或 DHST 成为
OMST或 DHOMST的甲基转移酶 ( methytransferase,
M T), 它含有 110 kD和 58 kD两个亚基, 还研究了
催化 OMST或 DHOMST成为 AFB1和 AFB2的氧化
还原酶 ( ox idoreductase, OR ) [ 2- 4]。Chang等 [ 5]对参
与黄曲霉毒素生物合成早期阶段的聚酮化合物合成
酶进行了研究。B rown等发现一个基因簇, 这簇基
因编码黄曲霉毒素的生物合成中的一组酶类, 例如
1个聚酮化合物合成酶、1个脂肪酸合成酶 ( 和
亚基 )、5个一氧化物酶、4个脱氢酶、1个酯酶、1个
O甲基转移酶、1个还原酶、1个氧化酶和 1个锌簇
结合蛋白 [ 6]。 Silva等 [ 7, 8]对杂色曲霉素 B合成酶开
展研究, 认为它是黄曲霉毒素 B1生物合成的关键
酶之一。Ke lkar等 [ 9 ]发现细胞色素 P450一氧化物
酶为柄曲霉素合成所必需, 该酶在黄曲霉毒素生物
合成中催化 AVN向 AVF的转变 [ 10]。在黄曲霉毒
素生物合成中,虽然过去认为 5!羟奥佛兰提素 ( 5!
hydroxyaverantin, HAVN )一步转变为奥佛尼红素
( averufin, AVF) , Sakuno等 [ 11 ]后来发现是两个步
骤, HAVN脱氢酶催化第一步反应, 把 HAVN转变
为一个新的中间产物, 5!氧奥佛兰提素 ( 5!oxoaver
antin, OAVN ); OVAN环化酶催化第二步反应, 把
OAVN变成 AVF。HAVN脱氢酶由两个 28 kD的同
源二聚体组成, 需要 NAD作辅酶; OVAN环化酶由
两个 79 kD的同源二聚体组成, 不需要任何辅酶。
Lee等 [ 12]对黄曲霉毒素生物合成酶 Nor1, V er1和
Om tA在寄生曲霉中的亚细胞定位进行了探索。
Chou等 [ 13]研究表明, 在亚细胞水平上,杂色曲霉素
B合成酶分布在全部细胞质中, 尤其集中在绕核的
环状结构上。
3 黄曲霉素合成中相关基因的表达与调控
参与黄曲霉毒素生物合成的酶类主要由一个基
因簇的各个基因转录和翻译而成 [ 14]。 Payne等 [ 15]
从黄曲霉中克隆出 afl2基因,基因长 22 kb, 调控
NA形成之前的步骤。黄曲霉毒素生物合成的调节
基因之一,一个寄生曲霉基因 apa2被克隆和转化
到寄生曲霉 SRRC 2043, 导致黄曲霉毒素生物合成
的中间产物大量产生, NA和 ST转化几乎增加 2
倍; 与黄曲霉素 afl2基因的 DNA序列比较发现同
源序列大于 95% [ 16 ]。Yu等 [ 17] 从寄生曲霉克隆
1 460 bp的 O甲基酶基因 om tA cDNA到大肠杆菌
表达系统;并且发现黄曲霉毒素生物合成途径中至
少 9个基因位于一个 60 kb的 DNA片段中,这些基
因在寄生曲霉中的顺序是 pksA, nor1, uvm8, aflR,
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
aad, ver1, ord1, ord2和 om tA,在黄曲霉中只有 nor
1, aflR, ver1和 om tA 基因已经被克隆 [ 18]。利用
ver1基因的启动子区域与来自大肠杆菌的 葡萄
糖苷酸酶 ( GUS)基因 ( u idA )融合, 形成报告基因表
达结构 GAP13,用它转化黄曲霉 6562,只有当培养
基中探测到黄曲霉毒素时, 带有 GAP13的转化株
才显示 GUS表达,并且 ver1基因启动子驱动的 u i
dA与 ver1基因的表达方式相同, 该结构在生物测
定中用于探测玉米粒中黄曲霉毒素生物合成的诱
导剂 [ 19]。
Hasan发现有些杀虫剂影响黄曲霉毒素生物合
成。在寄生曲霉中,膦酸衍生物 ( lancer)减少黄曲霉
毒素 B2的形成, 但 B1、G1、G2和蒽醌类 ( versico lorin
A, versiconal hem iacetal acetate and averufin)却积累;
硫代磷酸衍生物 ( pirim iphosmethy l and pyrazophos)
减少黄曲霉毒素 B2和 G2的形成,但 B1、G1和蒽醌
类却积累; 二硫代磷酸衍生物 ( d imethoate and mala
th ion)关闭 B2, 减少 B1和 G2,但 G1和蒽醌类却积
累;膦酸衍生物 ( profenfos)抑制所有黄曲霉毒素、杂
色曲霉素 A和杂色半缩醛乙酸, 但奥佛尼红素
(AVR)却积累;在 500和 1 000 ppm浓度下,苯基脲
衍生物 ( linuron and pencycuron)抑制所有黄曲霉毒
素,但蒽醌类却积累 [ 20]。在寄生曲霉和黄曲霉中, 从
奥佛尼红素 ( averuf in, AVF)到杂色半缩醛乙酸 ( ver
siconal hem iaceta l acetate, VHA )的转变中, av fA基因
产物参与其中。Yu研究表明, 该基因是参与黄曲霉
毒素 B1、G1、B2和 G2生物合成中 20多个酶基因之
一;从不产生黄曲霉毒素的曲霉或酱油曲霉 (A sp er
g illus sojae )中, 也克隆出一个 avfA基因拷贝。在一
个寄生曲霉突变株系 ( SRRC 165)中,没有黄曲霉毒
素产生,有 AVF积累, 引入来自黄曲霉的 avfA基因
以后, 该突变株系能够把 AVF转变为 VHA, 直到生
成黄曲霉毒素 B1、G1、B2和 G2。DNA序列分析表
明,单个氨基酸, 即天冬氨酸取代天冬酰胺, 导致寄
生曲霉突变株系 ( SRRC 165)中该酶失效。除 avfA
基因以外, 另一个黄曲霉毒素合成途径中的基因
om tB从寄生曲霉、黄曲霉和曲霉或酱油曲霉中被克
隆,它编码一个 O甲基转移酶, 催化二甲基柄曲霉
素 ( demethy lster igmatocystin, DM ST ) 到柄曲霉素
( sterigm atocystin, ST)的转变, 以及二氢去甲基柄曲
霉素 ( dihydrodemethy lsterigmatocystin, DHDMST )到
二氢柄曲霉素 ( d ihydrosterigm atocystin, DHST )的
转变 [ 21]。
在黄曲霉毒素 (AF)生物合成的调节中, AF途径
特异调控基因 ( aflR )的表达产物, AFLR是一个锌簇
转录因子,能够开关 AF途径的其它基因的转录。为
了确定 AFLR的羧基区 (AFLRC )与正或负反应蛋
白相互作用, Chang等 [ 22]融合寄生曲霉 aflR基因羧
基编码区 ( aflRC)到该霉菌的亚硝酸还原酶基因 ( ni
iA( p) ∀ aflRC ),用它转化寄生曲霉 SRRC 2043, 转化
菌株含有两个 n iiA ( p) ∀ aflRC拷贝, 一个位于 n iaD
基因位点,另一个位于 aflR基因位点,该菌株过量产
生 AF前体,不依赖于氮源。整合 n iiA( p) ∀ aflRC更
高的拷贝数, 其转化菌株 AF前体产量增加,在马铃
薯培养基和 A&M 培养基 ( potato dextrose broth and
A&M med ium )上, aflRC和天然 aflR基因的表达都增
加了。Hua[ 23]研究表明,乙酰丁香酮能够抑制黄曲霉
毒素生物合成中两个基因 ( nor1和 ver1)表达,抑制效
率达 80%。在代谢活跃的植物组织受伤以后,乙酰
丁香酮的浓度增加大约 10倍。
在黄曲霉毒素生物合成中, cypX和 moxY两个
基因位于黄曲霉毒素基因簇中, 为摸清它们的详细
功能,产生黄曲霉毒素的寄生曲霉 NRRL 2999的基
因被破坏, cypX基因缺失的突变体失去黄曲霉毒素
生产性能,在菌丝体中积累奥佛尼红素 ( AVF )。在
饲养试验中, 虽然该突变体能够转变羟基杂色酮
( HVN )、杂色酮 ( versico lorone, VONE )、杂色半缩醛
乙酸 ( VHA )和杂色乙酸 ( versicono l acetate, VOA c)
成为黄曲霉毒素,但它不能从 5!氧奥佛兰提素 ( 5!
oxoaverant in, OAVN )和奥佛兰提素 ( AVN )生产黄曲
霉毒素。moxY基因缺失的突变体也失去黄曲霉毒
素生产性能,而它再度积累羟基杂色酮和杂色酮,在
饲养试验中,虽然该突变体能够转变杂色半缩醛乙
酸 (VHA)或杂色乙酸 ( VOAc)成为黄曲霉毒素, 但
它不能从 5!氧奥佛兰提素 ( OAVN )、奥佛尼红素
( AVF)、羟基杂色酮 (HVN )或杂色酮 ( VONE )生产
黄曲霉毒素。这些结果表明, cypX基因编码奥佛尼
红素一氧化物酶, 催化从奥佛尼红素到奥佛兰提素
的反应; moxY基因编码奥佛兰提素一氧化物酶, 催
化一个 BaeyerV illiger反应,从奥佛兰提素到杂色半
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2010年第 11期 路子显等:黄曲霉素合成相关基因表达与环境因素的关系
缩醛乙酸的反应,也包括杂色酮到杂色乙酸 [ 24 ]。在
细胞培养中,利用稳定性同位素标记氨基酸的方法,
能够迅速确定黄曲霉菌中黄曲霉毒素生物合成对环
境刺激响应的蛋白质变化。针对黄曲霉毒素生物合
成,比较在可诱导的温度 ( 28# )和不可诱导的温度
( 37# )之间,发现在 37# 时有 31种蛋白是丰富的,
在 28# 时有 18种蛋白是丰富的 [ 25]。利用增强的绿色
荧光蛋白 ( enhanced green f luorescent protein, EGFP )
基因与 ver1基因融合,转化寄生曲霉 CS10N2株系,
转化体分析表明,在感受细胞中, 无论 EGFP融合到
ver1基因的 N末端还是 C末端, 补充无功能 Ver1
之功能。W estern杂交分析探测在转化体中全长 Ver
1融合蛋白占优势。共聚焦激光扫描显微镜显示,
在固体培养基上生长 48 h的菌丝体中, V er1融合
蛋白定位在液泡 ( vacuo le)的细胞质和细胞腔中, 达
80%以上。对照 EGFP(无 Ver1)时仅占 13%。这
些数据支持一个模型:中后期黄曲霉毒素酶类在细
胞质中合成,被转运到液泡中,它们在那里参与黄曲
霉毒素合成 [ 26]。由于氧化压力减弱, 以及谷胱甘肽
氧化还原状态的变化,在黄曲霉菌中,乙烯能够减少
黄曲霉毒素的产生 [ 27]。
4 黄曲霉毒素合成中的关键酶和调控因子
黄曲霉毒素的生物合成路线如图 1所示, 图中
基本反应了黄曲霉毒素的生物合成中的关键
步骤 [ 28]。
A中箭头表示基因转录方向
图 1 在黄曲霉和寄生曲霉中, 基因簇 ( A)对黄曲霉毒素生物合成 ( B )的责任
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
由图 1可以看出, apa2、nor1、cypX、moxY、avfA
和 ver1等基因的表达在黄曲霉毒素的生物合成中
起关键作用,它们编码的蛋白质 (酶 )表达量的高低
直接影响黄曲霉毒素的产量。同时, 一些脱氢酶、一
氧化物酶、环化酶、甲基转移酶以及氧化还原酶等在
黄曲霉毒素的生物合成中起重要作用, 它们的活性
大小直接影响黄曲霉毒素的产率。虽然人们对调节
黄曲霉毒素生物合成的部分基因表达与调控有了一
定了解,但对一些基因的功能仍然知之甚少。对参
与黄曲霉毒素生物合成的有些酶的功能获得了初步
认识, 但对它们的结构、活性和作用条件仍缺乏全面
认识。
5 影响黄曲霉毒素合成的环境因素
影响黄曲霉毒素合成的最重要环境因素是碳氮
源、酸碱度、温度、水活度和植物代谢产物。有一个
六碳糖利用基因簇紧邻黄曲霉毒素生物合成基因
簇,可能影响黄曲霉毒素基因表达 (图 1)。已知简
单碳水化合物 (如葡萄糖和蔗糖 )诱导黄曲霉毒素
生物合成, 但是, 蛋白胨或复合糖 (如淀粉 )没有影
响。由于胚中含有最高水平的简单糖类, 当真菌入
侵种胚时,则产生最高水平的黄曲霉毒素,而种子的
其它部分复合糖类占优势, 黄曲霉毒素相对较低。
在某些曲霉中,已经证明硝酸盐抑制黄曲霉毒素合
成,而以铵作为氮源则促进毒素形成。黄曲霉毒素
合成的最佳酸碱度为 pH 在 34- 55范围内。黄
曲霉毒素合成的最适温度为 29- 30# , 25# 以下产
量明显减少, 37# 或以上被完全抑制。水活度越高,
越有利于真菌生长和毒素合成; 水活度在 085以
下,真菌生长和孢子萌发率非常慢, 水活度在 070
- 075, 生长和孢子萌发停止。植物挥发物能够改
变曲霉生长或黄曲霉毒素生产,如来自苦楝叶、棉叶
和玉米叶的挥发性醛类和其它化合物。花青素和相
关的类黄酮也影响黄曲霉毒素生物合成, 五倍子酸
抑制黄曲霉毒素生物合成等 [ 28]。
美国农业部农业研究服务西北地区研究实验室
在 1974年报道,在不同的玉米介质上, 完整玉米粒
是优质的黄曲霉培养基, 全脂玉米胚作为培养基具
有完整玉米粒相似的黄曲霉毒素水平。但是, 在胚
乳和脱脂玉米胚上,黄曲霉毒素减少。在培养基上
每克胚增加 5- 10 gM n、Cu、Cd或 C r,增加黄曲霉
毒素产量,增加 Pb或 Zn ( 50- 250 g /g )也增加毒
素积累 [ 29]。维基尼亚理工大学和州立大学 1986年
报道对 49个维基尼亚州收获玉米样品研究表明, 黄
曲霉毒素水平与 Zn ( Spearm an相关系数, 0385; P
< 0006)和 Cu ( Spearman相关系数, 0573; P <
00001)的水平正相关 [ 30]。美国农业部农业研究服
务南方地区研究中心 2003年报道, Fe、Cu、Zn离子
分别刺激黄曲霉生长, Zn2+ 作用最强, Cu2 +次之,
Fe
3+轻微。Cu2+ + Fe3+ + Zn2+ 刺激黄曲霉最强 ( 3
倍于对照 ) , Zn2+ + Cu2 +次之 ( 2倍于对照 ), Zn2+ +
Fe
3+较弱 ( 15倍于对照 )。在单独处理中, 3种金
属离子均比对照增加黄曲霉总 RNA合成, Zn2+效果
最高,随之是其它金属离子 ( Cu2+和 Fe3+ )。在联合
处理中, Zn2 + + Cu2+ + Fe3+、Zn2+ + Cu2+和 Zn2+ +
Fe
2+诱导总 RNA积累几乎 2倍于对照。金属离子
不仅增加黄曲霉毒素途径基因表达, 而且增加黄曲
霉毒素和它的前体氧甲基柄曲霉毒素生产 [ 31 ]。
6 展望
根据目前对黄曲霉毒素的研究现状, 结合粮食
生物技术的研究方向,在基础研究领域,今后应利用
基因工程技术,转入反义黄曲霉毒素合成基因,阻止
黄曲霉毒素生物合成;或利用基因突变技术,改变编
码黄曲霉毒素生物合成中关键酶的遗传密码, 使其
丧失活性,最终培育出无毒菌株, 探索黄曲霉毒素基
因表达与调控的机理。
在应用研究领域,由于我国正处在加速工业化
和现代化进程之中,农田重金属污染面积不断扩大,
占我国耕地面积 10%左右的农业用地已经被重金
属污染,人们对这些地区粮食感染真菌以后产生真
菌毒素的能力知之甚少, 每年受污染和毒害的农产
品正在引起巨大经济损失, 开始制约这些地区的农
业经济发展,并且不断加剧。受污染的粮食一旦染
上黄曲霉菌,与未被重金属污染的粮食染上黄曲霉
菌产生黄曲霉毒素能力大为不同, 这种双重危害对
人、畜和禽类的影响难以想象。开展粮食重金属污
染与黄曲霉毒素危害相关性的研究将为人们日益提
高的食品安全需求提供保障, 受重金属污染和黄曲
霉毒素毒害的粮食加工产品对人类、畜禽健康和社
会环境的危害极其严重, 此项研究所产生的社会效
益和经济效益将无法估量。
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2010年第 11期 路子显等:黄曲霉素合成相关基因表达与环境因素的关系
因此, 掌握黄曲霉毒素关键基因表达与调控的
分子机理,探明粮食重金属污染与黄曲霉毒素危害
相关性,必将改变目前粮食和食品中受污染的黄曲
霉毒素不易排除的局面, 为人类的粮食和食品安全
做出新贡献。
参 考 文 献
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