全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
类球红菌自诱导物合成酶基因 cer I的克隆及其原核表达
苗艳 1 　叶姜瑜 2 　习劲 2 　廖强 3
(1 西南大学生命科学学院 ,重庆 400715; 2 三峡库区生态环境教育部重点实验室 重庆大学城市建设与环境工程学院 ,
重庆 400045; 3 重庆大学动力学院工程热物理研究所 ,重庆 400044)
　　摘 　要 : 　根据类球红菌 (R hodobacter sphaeroides 21411)自诱导物合成酶基因 cerI的序列 ,设计并合成了 1对特异性引
物 ,在引物的 5′和 3′分别加入含有 H ind III和 Xho I限制性酶切位点的序列 ,以类球红细菌 Rhodobacter sphaeroides基因组为模板
扩增了 cerI基因序列。将 PCR产物与 pMD182T载体连接 ,转化大肠杆菌 DH5α。鉴定成功获得目的片段 ,经 H ind III和 X ho I
双酶切后与载体 pET228a ( + )连接 ,构建原核表达质粒 pET228a ( + ) 2cerI,并将其转化宿主菌 BL21 (DE3) ,用 IPTG诱导其表
达。SDS2PAGE分析表明 ,重组载体 pET228a ( + ) 2cerI可成功地在大肠杆菌中表达 cerI蛋白。
关键词 : 　类球红菌 　cerI基因 　克隆 　原核表达
Clon ing and Prokaryotic Expression of Auto inducer Syntheticase
Gene cer I of Rhodobacter sphaeroides
M iao Yan1 　Ye J iangyu2 　Xi J in2 　L iao Q iang3
(1 School of L ife Sciences, Southwest University, Chongqing 400715; 2 Key Laboratory of Eco2envirom ents of
Three Gorges Reservoir R egion of M inistry of Education, C ity Construction and Environm ental Engineering Academ y,
Chongqing University, Chongqing 400045; 3 Institute of Engineering Therm ophysics, Chongqing University, Chongqing 400044)
　　Abs trac t: 　A pair of specific p rimerswith two unique restriction sites of H ind III and Xho Iwere designed according to the cerI gene
sequence published p reviously1The full2length cerI gene was amp lified from genom ic DNA of Rhodobacter sphaeroides by PCR with the
specific p rimers1 The p lasm id of positive clone was identified after the PCR p roduct was cloned into pMD182T vector and transformed
into the Escherich ia coli strain DH5α1W hen the fragment was inserted into pET228a ( + ) p lasm id by double digestion with H ind III +
X ho I, thus the p rokaryotic exp ression vector pET228a ( + ) 2cerI was constructed1 The recombinant p lasm id was transformed into the
host strain bacteria BL21 (DE3) and induced by IPTG1 SDS2PAGE analysis showed that the target gene fragment was exp ressed suc2
cessfully1
Key wo rds: 　R hodobacter sphaeroides　cerI gene　Cloning　Prokaryotic exp ression
收稿日期 : 2009201219
基金项目 :国家自然科学基金重点课题 (90510020)
作者简介 :苗艳 (19822) ,女 ,山西省长治市人 ,硕士 ,主要从事微生物生态学研究 ; E2mail: m iaoyan831113@1631com
通讯作者 :叶姜瑜 ,副教授 ,硕士生导师
　　许多种类的细菌在高细胞密度下可以产生自体
诱导物分子 ( autoinducer)监控细胞群体密度的变
化 ,从而调控细菌特定功能基因的表达 ,这一现象被
称为群体感应 ( quorum sensing)。酰基高丝氨酸内
酯类化合物 ( acylated homoserine lactone, AHL )是在
革兰氏阴性细菌群体感应调控中普遍存在的信号分
子 [ 2 ]。迄今为止 ,所有已发现的 AHL都由一个可变
的酰基链尾部与一个稳定的高丝氨酸内酯 (HSL )头
部相连 ,不同的 AHL分子其酰基链的长度为 4～18
个碳 ,其第三个碳上的氢常被羟基或氧取代 ,另一个
改变是在酰基链上存在双键 ,这种可变的酰基链尾
部决定 AHL信号物的特异性 [ 3～5 ]。AHL介导的群
体感应系统最基本的模型包括一个产生 AHL信号
分子的合成酶 LuxI类蛋白和一个转录调节物 LuxR
类蛋白 ,当 AHL 积累到阈值浓度时 R 蛋白便与
AHL结合成复合物 ,与其靶启动子序列结合 ,识别
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
特殊的启动子序列并激活特定基因的表达 [ 6 ]。目
前已知群体系统能够调控细菌的多种生理生化功能
如细菌与真核生物的共生、细菌毒性、细菌质粒的接
合转移、抗生素的产生及生物膜的形成等 [ 7 ]。
类球红细菌 ( R hodobacter sphaeroides)属于变形
菌纲α23亚纲 [ 8 ] ,红螺菌亚目 ,红螺菌科 ,红假单胞
菌属 ,紫色非硫细菌 ,光合细菌的主要成员之一。光
能异养菌兼性好氧可在光下厌氧生活也可在黑暗下
好氧生活 [ 9 ] ,同时它也是光合产氢微生物菌种 ,能
在光照厌氧异养条件下产氢 ,且能利用的底物范围
广 ,理论转化产量高 ,能利用宽谱光能 ,因而作为微
生物产氢研究的重要对象 [ 10 ]。它产生酰基高丝氨
酸内酯 7, 82cis2N2( tetradecenoyl)类信号分子 [ 11, 12 ] ,
该自诱导物合成酶由 cerI基因所编码表达 [ 8 ]。到目
前为止 ,对其信号分子调控的群体感应功能研究
甚少。
本研究应用分子生物学技术 ,克隆了类球红菌
自诱导物合成酶基因 cerI,并将 cerI基因在大肠杆
菌中进行了表达。为了解 LuxI类蛋白的特性、功能
以及对类球红菌群体感应机理的深入研究奠定了
基础。
1　材料与方法
111　菌种、载体和菌株
类球红细菌 (R hodobacter sphaeroides)购自中国
科学院微生物研究所。pMD182T载体购自大连宝
生物工程有限公司产品 ; 大肠杆菌感受态细胞
DH5α, BL21 (DE3) , pET228a ( + )表达载体由本实
验室保存并提供。
112　主要试剂
T4 DNA连接酶、DNA胶回收试剂盒、质粒提取
试剂盒、H ind III和 X ho I、DNA Marker、Primer STARTM
高保真酶、X2Gal、IPTG均为大连宝生物工程有限公
司产品。
113　类球红细菌基因组 DNA的提取
将类球红细菌单个菌落接种于 5 m l RCVBN培
养基中 , 37℃恒温震荡培养过夜 ,取 115 m l培养物
置于离心管中 , 12 000 r/m in离心 2 m in,收集菌体
沉淀 ;沸水浴 10 m in, 12 000 r/m in离心 2 m in,取上
清 ,即为类球红细菌基因组 DNA, - 20℃保存备用。
114　cerI基因的克隆与鉴定
按照 GenBank中的类球红细菌自诱导物合成
酶基因 cerI基因序列 ,使用 Primer Prem ier 510设计
引物 ,分别在 5′端加入 H ind III酶切位点 , 3′加入
Xho I酶切位点 ,引物由 Invitrogen公司合成。以基
因组 DNA为模板 ,进行 PCR扩增。100μl的反应
体系如下 : 5 ×反应缓冲液 20μl (含有 Mg2 + ) , dNTP
8μl,基因组 DNA模板 4μl,上游引物 4μl、下游引
物 4μl, Primer STARTM高保真酶 2μl,补水至 100
μl。95℃5 m in; 95℃60 s, 5815℃60 s, 72℃1 m in 30
s, 30个循环 ; 72℃延伸 10 m in 。用 115%琼脂糖凝
胶电泳。产物纯化、回收后 ,直接被连入 pMD182T
载体 ,转化大肠杆菌 DH5α,提取质粒。将 PCR和双
酶切鉴定为阳性的克隆送大连宝生物工程有限公司
测序 ,正确的重组质粒命名为 pMD182cerI。
115　重组表达质粒的构建
将 pMD182cerI质粒和 pET228a ( + )表达载体
用 H ind III + X ho I双酶切 ,回收酶切产物 ,用 T4 DNA
连接酶连接 ,将连接物先转化到 DH5α,再在 LB液
体培养基 (含卡那霉素 ) 37℃培养 ,抽提质粒。经
PCR和 H ind III + X ho I双酶切鉴定。将阳性质粒再
转化到 BL21 (DE3)宿主菌 ,涂布含卡那霉素的 LB
平板 ,得到重组阳性克隆菌并测序。
116　重组表达质粒的诱导表达
将经测序鉴定为阳性的重组菌 50μl接种至 5
m l LB培养液 (含 5 mg/L卡那霉素 )中 , 37℃震荡过
夜。取过夜培养物 50μl接种于 5 m l LB培养液 (含
100 mg/L卡那霉素 )中 ,剧烈振摇至 OD600为 014～
016时 ,加入 IPTG至终浓度为 1 mmol/L , 37℃诱导
表达 5 h后收集菌液 ,对其进行 SDS2PAGE分析检
测。同时用未诱导的菌液和空载体诱导物作阴性
对照。
2　结果
211　目的基因的 PCR扩增
取 5μl PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 ,出现了
与预期大小一致的目的条带 (图 1)。
212　重组质粒的 PCR及酶切鉴定
用设计好的引物对重组质粒进行 PCR鉴定 ,获
得 1条与目的条带相符的约 650 bp 的条带。用
H ind III + X ho I对重组质粒进行双酶切后取 5μl进
行琼脂糖凝胶电泳检测 ,获得 2条带 ,一条为目的
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2009年第 6期 苗艳等 :类球红菌自诱导物合成酶基因 cerI的克隆及其原核表达
带 ,另一条为载体带 ,大小与预期的结果相符 (图
2)。结果表明已成功克隆了 cerI基因。
M1250 bp Ladder DNA Marker; 1～21类球红细菌基因组 DNA的 cerI
基因扩增
图 1　目的基因 cer I的 PCR扩增
M. 250 bp Ladder DNA Marker; 1～21重组质粒 pMD182cerI H ind III +
Xho I双酶切产物
图 2　重组质粒的酶切鉴定
213　序列测定
将阳性克隆的测序结果与 GenBank收录的类
球红细菌 R hodobacter sphaeroides 21411 cerI序列进
行比较。二者的同源性高达 100% ,说明 cerI基因
序列极为保守。
214　重组表达载体的构建与鉴定
用 cerI的引物对构建的重组表达质粒进行了
PCR鉴定 ;用 H ind III + X ho I对重组表达质粒进行了
双酶切鉴定。结果表明 ,成功构建了含有 cerI基因
的重组质粒 pET2cerI(图 3,图 4)。
M1DNA marker(DL2000) ; 1～81重组质粒 pET28a ( + ) 2cerI的 PCR
扩增产物
图 3　重组表达载体 pET28a( + ) 2cer I的 PCR鉴定结果
M1DNA marker(7 000, 3 500, 1 000, 500 bp ) ; 11重组质粒 pET28a2
cerI的 H ind III和 Xho I双酶切产物
图 4　重组表达质粒 pET28a( + ) 2cer I酶切鉴定
215　表达菌的 SDS2PAGE
SDS2PAGE分析显示 ,在 IPTG的诱导下 ,重组
表达质粒表达出了约 23 kD的融合蛋白 (图 5) ,与
核苷酸序列推导的蛋白质的分子质量大小相符。
3　讨论
将新构建的表达载体 pET28a ( + ) 2cerI转化至
大肠杆菌 BL21 (DE3 )中 ,用 IPTG诱导表达了目
的蛋白 。从 SDS 2PAGE电泳结果分析 ,观察到一
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M1p rotein molecularweightmarker; 1、21重组质粒未经 IPTG诱导的产
物 ; 3、41重组质粒经过 IPTG诱导后的表达产物
图 5　表达产物的 SD S2PAGE分析
相对分子质量与理论值 (约 23 kD)相符的诱导表达
带 ,该条带正是作者诱导表达的 cerI蛋白。从试验
结果看 ,目的蛋白表达量仍偏低 ,因此 ,需进一步探
究其原因 ,改进试验条件 ,以期获得目的蛋白高效的
表达。
本实验室已经采用类球红细菌信号分子的同系
物对类红球菌的群体感应系统做了研究 ,发现这种
分子对细菌的生理存在调控 ,虽然其结构与细菌自
产诱导物类似 ,但类红球菌自身产生的自诱导物对
其生理功能的影响还有待研究。所以可以将表达出
的并通过活性检测的蛋白加入菌液中 ,通过对照来
研究此蛋白对类球红菌生长 ,聚集 ,产氢等一系列生
理活动的影响 ,为研究类球红菌群体感应系统的调
控机制奠定基础。
参 考 文 献
1　 Fuqua WC, W inans SC, Greenberg EP1 Bacteriol, 1994, 176: 269
～2751
2　W hitehead NA, Barnard AM, Slater H, et al1 FEMS M icrobiol Rev,
2001, 25: 365～4041
3　 W atson W T, M inogue TD, Val DL, et al 1Mol Cell, 2002, 9: 685
～6941
4　 Park SY, Lee SJ, Oh TK, et al1 M icrobiol, 2003, 149 ( 6 ) : 1541
～15511
5　 Hanzelka BL, Parsek MR, Val DL, et al1 J Bacteriol, 1999, 181
(18) : 5766～57701
6　 Zhu J,W inans SC1 Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 4832～48371
7　 Hardman AM, Stewart GS, W illiam s P1 Antonia van Leeuwenhoek,
1998, 7 (4) : 199～2101
8　 Puskas A, Greenberg EP, Kap lan S1 Bacteriology, 1997, 179 ( 23 ) :
7530～75371
9　 Donohue TJ, Cain BD, Kap lan S1 J Bacteriol, 1988, 152: 585～6061
10　Lee CM, Chen PC, W ang CC1 Hydrogen Energy, 2002, 27: 1309
～13131
11　Salmond GPC, Bycroft BW , Stewart G1Mol M icrobiol, 1995, 16: 615
～6241
12　Hustade E, Steinbuchel A, Schlegel HG1 App lM icrobiol B iotechn2
ol, 1993, 39: 871
051
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