全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
罗格列酮对胰岛素抵抗人肝细胞 Angp il3和
LXR基因表达的影响
黄家利 王继红 程梅 曾建涛
(重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,重庆 400016)
摘 要: 研究罗格列酮对胰岛素抵抗人肝 L02细胞 Angp tl3基因及与脂代谢相关的 LXR基因的影响。采用高胰岛素
诱导法建立胰岛素抵抗模型 ( IRL02),分别加入含有和不含罗格列酮的不同葡萄糖浓度培养液培养, 用葡萄糖氧化酶过氧化
物酶法 ( GODPOD法 )检测培养液残存葡萄糖量,并用 RTPCR方法检测基因 Angp tl3、LXRmRNA表达水平的变化。结果表
明相同葡萄糖浓度下罗格列酮作用组 ( IRR组 )的培养液残存葡萄糖量比无罗格列酮作用组 ( IR组 )减少; IRR组的 Angp tl3、
LXRmRNA表达水平较 IR组显著升高 (P < 0 05)。
关键词: Angp tl3 LXR 罗格列酮 胰岛素抵抗
Effect of Rosiglitazone on the Gene Expression ofAngpil3 and
LXR of InsulinresistantHuman Liver Cells
H uang J iali W ang Jihong Cheng M ei Zeng Jiantao
(D epartment of B iochem istry andM olecular Biology, College of BasicM ed icine, ChongqingM edical University, Chongqing 400016)
Abstrac:t The research w as to investiga te the e ffect o f ros ig litazone on geneAngp tl3 and LXR of insulinresistant L02 cells An
insu linresistant L02 ce ll w ith high concentration insulin was estab lishedRosiglitazone w as added in the cu lture so lu tion of insu linre
sistant L02 cells as treated g roupThe content of g luco se rem ained in the cu lture so lution was m easured by the m ethod o f g lucose ox id i
zes perox ides( GODPOD) The expression of geneAngp t13 mRNA and LXRmRNA w as de tected by reverse transcriptionpo lyme rase
cha in reac tion( RTPCR ) Resu lts show ed that the content o f g luco se rem a ined in culture so lution o f insulinresistant L02 cells wh ich
added ros ig litazone was lowe r than the contro l g roup o fw ithout rosig litazoneThe expression of genes Angp t13 and LXRmRNA o f IR
R group w ere h ighe r than the IR g roup(P < 005)
Key words: Angp tl3 LXR Ros ig litazone Insu linresistant
收稿日期: 20081106
基金项目:重庆医科大学创新基金 ( CX200528 )
作者简介:黄家利 ( 1980) ,女,硕士生,主要从事高脂血症发病机理方面的研究; Em ai:l h jsccd@ tom com
通讯作者:王继红 ( 1955) ,女,副教授,硕士生导师; Em ai:l w jhkyh@ 163 com
血管生成素样蛋白 3( ang iopo ientinlike protein
3, ANGPTL3)是一种主要在肝脏表达的血管生成素
相关蛋白 [ 1] , 能抑制脂蛋白脂肪酶 ( lipoprote in li
pase, LPL)的活性,减少血液中三酰甘油的清除。有
研究 [ 2]发现, 肝 X受体 ( 1 iver X receptor, LXR )配体
可增强 Angp tl3 mRNA表达和肝肿瘤细胞 ANGPTL3
的产生。K aplan等 [ 3 ]发现 LXR激动剂提高了小鼠
肝脏 Angp tl3 mRNA水平。
胰岛素抵抗是 型糖尿病的主要发病机制之
一, 即肝脏、脂肪等组织对胰岛素敏感性降低, 对葡
萄糖的摄取发生障碍。罗格列酮属于过氧化物酶增
殖体激活受体 ( PPAR)的激动剂, 可结合 PPAR
,增加葡萄糖转运蛋白的合成, 加快葡萄糖向细胞
内转运,增加细胞膜上胰岛素受体的数量,促进胰岛
素介导的葡萄糖摄取 [ 4]。
本试验建立胰岛素抵抗 L02细胞模型 ( IRL02),
研究罗格列酮对不同葡萄糖浓度下 IRL02细胞的
Angp tl 3和 LXR基因表达量的影响。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
1 材料与方法
11 主要材料
L02细胞株 (重庆医科大学基础医学研究所 ) ;新
生牛血清 (杭州四季青公司 ); RPM I1640普通培养基,
RPM I1640无糖培养基, RPM I1640无酚红培养基 (美
国 G ibco公司 );罗格列酮 (天津葛兰素史克有限公
司 );胰岛素 (徐州万邦生化制药有限公司 ) ;葡萄糖
测定试剂盒 (北京华宇亿康生物工程技术有限公
司 ); Angptl3, LXR, G3PDH 引物 (上海生工合成 );
RT试剂盒 ( Toyobo公司 ) ; PCR试剂 (广州东盛生物
公司 ) ; PCR仪,凝胶成像仪 (美国 B ioRad公司 )。
12 方法
121 细胞模型建立及分组 用含 10%新生牛血
清的 RPM I1640培养液在 5% CO2, 37 条件下培养
L02细胞。取对数生长期的 L02细胞以每孔 3 105
个细胞 /孔接种于培养板, 随机分为 5组,分别为 IR
组 (胰岛素抵抗组 )、IR平行组、IRR组 (罗格列酮
作用的胰岛素抵抗组 )、IRR平行组和 N平行组
(正常平行组 )。在含 10%胎牛血清、56 mmo l /L
葡萄糖的无酚红 RPM I1640培养液中培养 36 h后,
更换无血清无酚红培养液 (含 1% BSA )继续培养 24
h。前 4组每孔加入 2 m l新配制的含 5 10- 7mo l/L
人胰岛素的无血清无酚红培养液,培养 16 h,建立胰
岛素抵抗细胞模型 [ 5, 6] ; N平行组加入不含胰岛素
的无血清无酚红培养液培养 16 h。后将 IR组和 IR
平行组各分为 4个亚组 ( IR1~ IR4) , 分别用含 05
ng /m l胰岛素的葡萄糖浓度 56, 70, 111, 330
mmo l /L的培养液培养 24 h。 IRR组和 IRR平行
组各分为 4个亚组 ( IRR1~ IRR4) , 分别用含以上
成分的培养液加入 10 m o l/L罗格列酮培养 24 h。
122 细胞培养液中葡萄糖浓度测定 在 IR平行
组和 N平行组分别用含胰岛素和不含胰岛素的无血
清无酚红培养液培养 16 h后,分别加入含 0 ng /m l、1
ng /m l、10 ng /m l、50 ng /m l、100 ng /m l、200 ng /m l胰岛
素的培养液培养 30 m in,加入葡萄糖 56 mmo l/L继
续培养 2 h。采用临床常用于检测血糖的葡萄糖过氧
化酶 ( GODPOD)法检测上清葡萄糖残余量,鉴定胰
岛素抵抗模型是否成功。在另一 IR平行组和 IRR
平行组分别用含罗格列酮和不含罗格列酮的各葡萄
糖浓度培养液培养 24 h后,检测上清葡萄糖残余量,
判断罗格列酮是否促进葡萄糖进入细胞。
123 基因 Angp tl3和 LXRmRNA表达的检测 常规
方法提取 IR组、IRR组细胞总 RNA, 检测总 RNA的
纯度和完整性, RTPCR方法检测Angp tl3和 LXRmR
NA的相对表达量。逆转录反应条件: 30 10 m in,
42 20 m in, 99 5 m in, 4 5 m in。根据文献设计引
物如下: Angp tl3上游引物: 5TCC TGC TGA ATG TAC
CAC CA3,下游引物: 5TCA AGC CTC CCA AAA CCA
TA3; LXR上游引物: 5TCC CAC GGA TGC TAA
TG, 3下游引物: 5TCC CAG GAA TGT TTG CC;
G 3PDH 上游引物: 5ACC ACA GTC CAT GCC ATC
AC3,下游引物: 5TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA
3。LXR和G 3PDH的 PC反应条件: 94 预变性 5m in
后进入循环 ( 94 30 s, 55 30 s, 72 1m in),共 35个
循环, 72 延伸 10 m in; Angp tl3的 PCR反应条件: 94
预变性 5m in后进入循环 ( 94 30 s, 58 30 s, 72 1
m in),共 35个循环, 72 延伸 10 m in。取 PCR产物 6
l用于 25%琼脂糖电泳, EB染色后在凝胶成像仪采
集图片, Quantity One软件分析条带, Angptl3、LXR条
带的灰度值分别与 G 3PDH 的比值作为各基因在转录
水平的相对表达值。
124 统计学处理 数据均以 x s表示, 用 SPSS
100软件分析,同组内各亚组间均数比较采用方差
分析,组间两两比较用 t检验。结果 P < 005为差
异有显著性意义。
2 结果
21 细胞培养液中葡萄糖含量比较
由表 1可见, N平行组和 IR平行组培养液残存
葡萄糖含量均随胰岛素浓度的升高而降低 (P <
005) ;在 0 ng /m l胰岛素状态下, 两组残存葡萄糖
无显著差异性 (P > 005) ; 在加入胰岛素后, IR平
行组的残存葡萄糖含量均高于 N 平行组 ( P <
005)。由表 2可见, 加入罗格列酮的 IRR平行组
各亚组培养液残存葡萄糖量较未加入罗格列酮的
IR平行组降低 (P < 005)。
22 Angp tl3、LXR基因相对表达量的比较
由表 3和图 1, 图 2可见, Angp tl3 mRNA在 IR2
~ IR4组与 IR1组比较, 以及 IR组各亚组间比较,
差异均有显著意义 (P < 005) ;在 IRR2~ IRR4组
与 IRR1组比较,以及 IRR组各亚组间比较,差异亦
102
2009年第 5期 黄家利等:罗格列酮对胰岛素抵抗人肝细胞 Angp il3和 LXR基因表达的影响
表 1 不同胰岛素浓度下培养液残存葡萄糖量 (x s, n= 3)
组别 ( ng /m l) N平行组 (mm ol/L) IR平行组 (mm ol /L )
0 340 003 345 003
1 294 009 335 006*
10 247 007 292 001*
50 175 001 243 004*
100 117 003 181 002*
200 090 003 158 003*
与 N平行组比较, * P < 005
表 2 IR平行组、IRR平行组残存葡萄糖量 (x s, n= 3)
组别 IR( mm ol /L) IRR (mmol /L )
1 359 004 276 007*
2 578 012 376 008*
3 915 014 624 005*
4 2846 004 2623 008*
与 IR组比较, * P < 005
均有显著意义 (P < 005)。在 IR组和 IRR组中 An
gp tl3 mRNA均随葡萄糖浓度的增加而升高;相同葡
萄糖浓度条件下, IR组与 IRR组比较 Angp tl3 mRNA
的差异有统计学意义 (P< 005)。
由表 3和图 3,图 4可见, LXRmRNA在 IR2组
与 IR1组比较、IRR2组与 IRR1组比较时差异无统
计学意义 (P > 005); IR3~ IR4组与 IR1组比较、IR
R3~ IRR4组与 IRR1组比较差异有统计学意义 (P
< 005), IR2~ IR4组间、IRR2~ IRR4组间有差异
(P < 005) ;相同葡萄糖浓度条件下 IRR组的 LXR
mRNA较 IR组显著升高 (P< 005);当葡萄糖浓度
111 mm o l/L时, IR组和 IRR组中 LXRmRNA均随
葡萄糖浓度的升高而增加。
表 3 IR组、IRR组 Angp tl3、LXRmRNA相对表达量 (x s, n= 3)
组别 IR组
ANGPTL3 LXR
IRR组
ANGPTL3 LXR
1 0183 0014 0217 0027 0256 0021* 0862 0031*
2 0294 0019a 0226 0020 0348 0019* a 0887 0014*
3 0392 0014a 0274 0016a 0443 0018* a 0967 0010* a
4 0622 0026a 0313 0013a 0675 0021* a 1026 0025* a
相同葡萄糖浓度下 IRR组与 IR组比较, * P < 005;同组内其他亚组与第一亚组比较, aP < 005
MDNA M arker I; 1 ~ 4依次为 IR1~ IR4的 PCR扩增产物
图 1 不同葡萄糖浓度下 IR细胞 Angp tl3 mRNA表达
MDNA M arker I; 1 ~ 4依次为 IRR1~ IRR4的 PCR扩增产物
图 2 不同葡萄糖浓度下 IRR细胞 Angp tl3 mRNA表达
MDNA M arker I; 1 ~ 4依次为 IR1~ IR4的 PCR扩增产物
图 3 不同葡萄糖浓度下 IR细胞 LXRmRNA表达
MDNA M arker I; 1 ~ 4依次为 IRR1~ IRR4的 PCR扩增产物
图 4 不同葡萄糖浓度下 IRR细胞 LXR mRNA表达
3 讨论
肝细胞属于人体胰岛素的主要靶组织之一, 存
在 PPAR受体。罗格列酮作为 PPAR的合成配
体, 可增加肝脏细胞对葡萄糖的摄取。
本试验采用 GODPOD法检测培养液残存葡萄
糖含量,客观评价了在胰岛素刺激下细胞的葡萄糖
摄取能力,用于判断是否存在胰岛素抵抗。由结果
可见,加入胰岛素后的 IR平行组比 N平行组的葡
萄糖残留量明显增多,说明胰岛素诱导的胰岛素抵
抗细胞模型是成功的;无胰岛素作用的 IR平行组和
N平行组葡萄糖残留量无显著差异 ( P > 005) , 说
明在无胰岛素作用时的正常细胞葡萄糖摄取能力与
胰岛素抵抗细胞无明显差异。而 IRR平行组的细
胞培养液残存葡萄糖量较同葡萄糖浓度的 IR平行
组明显减少 (P < 005), 说明罗格列酮促进了胰岛
素抵抗细胞对葡萄糖的吸收。
相同葡萄糖浓度下 IRR组 LXRmRNA水平
较 IR组明显增加 (P < 005), 原因可能是罗格列酮
(下转第 108页 )
103
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
研究。
致谢: 本文的实验部分在河南省生物工程技术研究中心
完成, 特此表示感谢!
参 考 文 献
1 ELDeiryW S, et alNatGen et, 1992, 1 ( 1) : 45~ 49
2 Ko L J, Prives CGenesDev, 1996, 10 ( 9) : 1054~ 1072
3 E ldeiry W S, T ok ino T, W aldman T, et al C ancer Res, 1995, 55
( 13) : 2910~ 2919
4 张勇,程小款,吴宁华,等 中国医学科学院学报, 2004, 26 ( 1 ) :
52~ 55
5 OConnor L, S trasser A, OR eilly LA, et alEMBO J, 1998, 17 ( 2 ) :
384~ 395
6 Jiang Z, Zheng X, et al JN eurochem, 2004, 89( 1) : 168~ 178
7 Sun tersA, Fernandez d eM attosS, S tah lM, et al JB iolChem, 2003,
278( 50 ): 49795 ~ 49805
8 BennettMK, Osborne TFProc Natl Acad S ciUSA, 2000, 97 ( 12 ):
6340 ~ 6344
9 W ein rnam AS, Farnham PTM ethods, 2002, 26( 1 ) : 37~ 47
10 KuoMH, A llis CDM ethods, 1999, 19( 3) : 425~ 433
11 H ech tA, G runstein MMethods En zym o,l 1999, 304: 399 ~ 414
12 Im pey S, M cC ork le SR, et alC el,l 2004, 119: 1041~ 1054
13 Sun YM, G reenw ay DJ, John son R, et alM olecu lar B io logy of the
C el,l 2005, 16: 5630~ 5638
14 KaeserMD, Iggo RDProc Natl A cad Sci USA, 2002, 99 ( 1 ) : 95
~ 100
15 E ssaf i A, Fernndez de M attos S, H assen YA, et alOncogene,
2005, 24( 14 ): 2317 ~ 2329
16 Yam am ura Y, et al J B io lCh em, 2006 , 281( 8) : 5267~ 5276
(上接第 103页 )
增加细胞对葡萄糖的摄取, 促进 LXRmRNA水平
的升高,而且罗格列酮作为一种 PPARr激动剂,本
身也可以增加 LXRmRNA的表达,导致了 IRR组
的 LXRmRNA的表达量比 IR组显著增高。当 IR
R组和 IR组的葡萄糖浓度 111 mm o l/L时, 葡萄
糖促进了 LXRmRNA的表达升高, 且成剂量依赖
性; IR2与 IR1组、IRR2与 IRR 1组 LXR mRNA
差异无显著性 (P > 005), 可见当葡萄糖浓度 70
mmo l /L时,葡萄糖浓度的改变对细胞 LXRmRNA
表达水平的影响不明显。结果也显示, 随着葡萄糖
浓度的增加, IR组和 IRR组的 Angp tl3 mRNA水平
升高。同葡萄糖浓度的 IRR组 Angp tl3 mRNA较
IR组也有明显增加 (P < 005。有研究 [ 7, 8]显示胰
岛素抵抗状态可明显提高 Angp tl3 mRNA的表达,因
此由试验结果推断, 10 m o l/L罗格列酮作用于 IR
细胞 24 h后, 细胞对葡萄糖摄取增加和高表达的
LXRmRNA都明显促进 Angp tl3 mRNA的表达,且
明显高过了由罗格列酮引起细胞胰岛素抵抗状态缓
解出现的 Angp tl3 mRNA表达降低。本试验建立的
不同葡萄糖浓度结合胰岛素抵抗的 L02肝细胞模拟
了型糖尿病状态下的人肝细胞状态,初步研究了
在此状态下罗格列酮对脂代谢相关基因 Angp tl3、
LXR的影响。由此认为, 罗格列酮作用于 IRL02
细胞后 Angp tl3 mRNA的表达增加是由高表达的
LXRA mRNA和细胞对葡萄糖摄取增加同时作用,但
具体由哪种途径为主尚需进一步研究。
参 考 文 献
1 Ono M, Sh im izugaw a T, Sh im amu ra M, et al1 J B iol Ch em, 2003, 278
( 43 ) : 41804 ~ 418091
2 Inaba T, M atsuda M, Sh im am ura M, et al1 J B iol C hem, 2003, 278
( 24) : 21344~ 21351.
3 K ap lan R, Zhang T, et al1 J Lipid R es, 2003, 44( 1) : 136~ 143.
4 H allsten K, et al1D iabetes, 2002, 51( 12 ): 3479 ~ 34851
5 李晨钟,等 1重庆医科大学学报, 1998, 23( 4 ) : 335~ 3371
6 李倩,王继红,等 1现代预防医学, 2007, 34( 22 ): 4233 ~ 42361
7 N aoum ova RP, et al1 Lancet, 2002, 359( 9325 ): 2215 ~ 22161
8 Inukai K, N akash im a Y, W atanabe M, et al1 B iochem B iophys Res
C omm um, 2004, 317 ( 4) : 1075~ 10791
108