全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
圆斑星鲽肌钙蛋白 I基因的克隆和序列分析
王健 1, 2 苏浩 2 高祥刚 2 李云峰2 赫崇波 2
( 1辽宁师范大学生命科学学院,大连 116029; 2辽宁海洋水产科学研究院辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室,大连 116023)
摘 要: 通过建立圆斑星鲽肌肉 cDNA文库,大规模的 EST测序和 PCR技术得到了圆斑星鲽肌钙蛋白 I的完全表达序
列, 该序列全长 845 bp, 编码 171个氨基酸。经同源性分析结果表明, 与多种鱼类的肌钙蛋白 I具有较高同源性,其中与鳜鱼
的肌钙蛋白 I同源性最高,为 86%。序列提交 GenBank收录, 登录号为 GU229275。
关键词: 圆斑星鲽 肌钙蛋白 I基因 cDNA文库 序列分析
Cloning and Characterization of Troponin
I gene from Verasper variegates
W ang Jian
1, 2
Su H ao
2
GaoX ianggang
2
L iYunfeng
2
H eChongbo
2
(
1
College of Life Sciences, L iaoning N ormal University, D alian 116029;
2
Liaoning O cean and F ishery Science Institute,
L iaoning K ey Laborato ty of M arine F isheryM o lecular Biology, D alian 116023)
Abstrac:t In th is pape r, the cDNA libra ry from musc le of Verasp er variega tes was construc ted using C rea tor SMART cDNA con
struction kit and large numbers of co lonies we re random ly picked and sequenced from the 5 . One EST w ith h igh hom o logyw ith T ropo
n in I gene of o ther spec ies was found and then the com plete express sequence of troponin I from Verasper variegates w as ob tained by
PCR. This genew as 845 bp w ith 516 bp o fORF, which encodes 171 am ino ac ids and had the h ighest s im ilar ityw ith S iniperca chuatsi
hom o loguew ith percent identities be ing 86% .
Key words: Verasp er var iegates T ropon in I gene cDNA library Sequence ana lys is
收稿日期: 20091217
基金项目:国家海洋经济规划实施的科技推进平台与运行项目 ( 2008- 2009 ) ,鲆鲽类现代农业产业体系建设专项 ( nycytx50S08)
作者简介:王健,硕士研究生,研究方向:海洋生物分子生物学; Em ai:l w angjian_ tx@j hotm ail com
通讯作者:赫崇波,研究员,硕士生导师,研究方向:水产分子遗传学; Em ai:l hechongbo@ hotm ail com
圆斑星鲽 ( Verasp er variega tus )属鲽形目 ( P leu
ronectiformes)、鲽科 ( P leuronectidae )、星鲽属 ( Ve
rasp er )
[ 1 ]是分布于中国黄渤海及日本九州和朝鲜海
域的珍贵鱼类,其肉质鲜美, 营养价值高, 具有广阔
的开发前景。
肌钙蛋白 ( T ropon in, Tn)是横纹肌收缩的重要
调节蛋白,由 3个亚基组成: 肌钙蛋白 C ( TnC ), 肌
钙蛋白 T( TnT)和肌钙蛋白 I( TnI)。其中 TnI是
肌动蛋白抑制亚基 [ 2] , 随着 Ga2+浓度的升高或降
低, TnI也相应的与肌动蛋白和原肌球蛋白脱离或
结合, 同时肌肉也表现出收缩或舒张 [ 3]。骨骼肌收
缩影响肌蛋白的生成 [ 4] , 从而可能影响鱼类的生长
和肉质。本研究通过构建圆斑星鲽肌肉和脾脏组织
的 cDNA文库,然后从文库中随机筛选重组克隆子
进行 5 测序分析得到 TnI的部分 cDNA序列,进一
步通过 PCR反应并测序得到了圆斑星鲽 TnI基因
的完全表达序列; 同时借助生物信息学手段对该基
因进行分析研究, 以期为进一步确定其生物学功能
及圆斑星鲽肌肉生长和肉质研究提供重要依据。
1 材料和方法
11 材料
圆斑星鲽采自辽宁省海洋水产科学研究院旅顺
养殖基地。选取 10条圆斑星鲽 ( 1龄, 身长 10- 14
cm,个体重量 200- 300 g) ,迅速解剖取其肌肉和脾
脏组织,分别放入液氮中保存。
12 cDNA文库的构建及 TnI序列的获得
取两种不同组织 (肌肉与脾脏 )各 50 - 100 g,
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
放于有液氮的研钵中研成粉末状,然后按照 TRIZOL
试剂盒说明提取总 RNA。总 RNA经过分离纯化后
作为模板合成 cDNA。最后将得到的 cDNA链进行
修饰后连接到载体上并转化感受态细胞从而建立圆
斑星鲽的 cDNA文库。从 cDNA文库中随机挑取克
隆,由上海美季生物技术有限公司进行 5 端测序。
利用 B lastN和 B lastX对测序后所有序列进行
同源搜索比对。根据 EST序列比对的结果, 筛选出
TnI部分 cDNA序列。基于该 cDNA序列设计正向
引物 F1( 5 agaaaatgacttcgagccgcagg3 ) ,逆向引物为
T3载体引物 ( 5 attaaccctcactaaagggaa3 ) ,在质粒原
液中扩增得到 TnI的完全表达序列。
13 TnI序列分析
使用 DNA star 70分析核苷酸和氨基酸序列,
利用 B lastN和 B lastX进行同源序列搜索比对 [ 5] ;用
S igna lP V 20 分析信号肽 [ 6] ; 用 Pfam ( http: / /
pfam sangeracuk / )对其结构域进行分析; 采用
C lusta lX183[ 7]作聚类分析; 使用 M ega 40[ 8]软件
Ne ighboeJo in ing ( N J)算法绘制同源蛋白系统进
化树。
2 结果
21 TnI核苷酸和预测氨基酸序列分析
通过测序及拼接, 获得了圆斑星鲽 TnI cDNA
序列及按照标准密码子翻译后的氨基酸序列 (图
1)。获得的 cDNA长 845 bp, 5 UTR为 48 bp, 3 UTR
为 281 bp。编码区域 ( cod ing sequence, CDS)为 516
bp, 编码 171个氨基酸,终止密码子 TAA下游 242 nt
出现多聚腺苷酸加尾信号 AATAAA, po ly ( dA )尾巴
出现在加尾信号下游 15 nt。序列提交 GenBank收
录 ( G enB ank登录号: GU229275 )。
阴影部分为起始密码子; * 表示终止密码子;方框部分为多聚腺苷酸的加尾信号
图 1 圆斑星鲽 TnI基因 cDNA全长序列及其编码的氨基酸序列
180
2010年第 5期 王健等:圆斑星鲽肌钙蛋白 I基因的克隆和序列分析
按照标准密码子翻译后的 TnI蛋白分子式为
C832H 1407N239O 255 S13, 预测相对分子量约为 19256
kD,等电点 ( pI)为 928。TnI氨基酸组成中带正电
荷的氨基酸 ( A rg + Lys ) 35个, 占总氨基酸的
2046%, 带负电荷的氨基酸 ( A sp + G lu) 28个, 占
1637%, 没有发现信号肽。对该蛋白序列的功能域
分析结果表明: 圆斑星鲽 TnI属于 Tropon in超家
族,是一种不涉及马达功能的与肌钙蛋白结合的蛋
白质, 推测其在肌肉发育中有引发肌肉组织成熟的
功能。这与 TnI在其它物种的功能相似 [ 9]。
22 TnI核苷酸和预测氨基酸序列同源性分析
将圆斑星鲽 TnI的核苷酸序列和氨基酸序列
通过 B lastX和 B lastP进行同源序列搜索, 结果显示
与多种鱼类的 TnI核苷酸和氨基酸序列同源,圆斑
星鲽 TnI与鳜鱼 ( FJ560879)的核苷酸序列相似性
最高,为 86% ;氨基酸同源性结果显示与鳜鱼的氨
基酸序列相似性为 85% ,与其他鱼类 TnI氨基酸序
列的同源性达 60%以上,与其他生物 TnI氨基酸序
列的同源性也达到 50%以上 (表 1) ,由此可见, TnI
可推测为圆斑星鲽的 TnI基因之一。
表 1 圆斑星鲽与其他生物 TnI氨基酸序列同源性比较
目 科 种 GenBank登录号 同源性 (% )
鲽形目 鲽科 圆斑星鲽 GU 229275
鲈形目 鮨科 鳜鱼 S in iperca chua tsi FJ560897 85
鲟形目 鳕科 大西洋鳕 G adus m orhua AF498091 77
鲈形目 鲷科 金头鲷 Spa rus aura ta AY 550964 73
鲑目 鲑科 大西洋鲑鱼 Sa lm o sa lar BT057739 65
鲑目 鲑科 虹鳟鱼 On corhyn chus m ykiss NM _001129990 60
鲤形目 鲤科 斑马鱼 Dan io rerio AY 929849 70
鲤形目 鲤科 胖头鲦 P im ephales prom elas DQ 785101 67
无尾目 负子蟾科 非洲爪蛙 X enopu s laevis AF480427 58
鸡形目 雉科 原鸡 Ga llu s ga llu s NM _205417 58
啮齿目 鼠科 小家鼠 Mu sm uscu lu s NM _009405 57
灵长目 人科 人类 H om o sapien s NM _001145841 57
23 TnI系统进化
利用 C lustalX183和Mega 40软件,对圆斑星鲽
与已知的 12个物种 TnI在氨基酸水平上进行聚类分
析并绘制系统进化树 (图 2)。结果显示, 所有的 13
个物种分为两大支,其中鱼类聚为一支,鲽形目的圆
斑星鲽与鲈形目鳜鱼进化关系最近,这与利用线粒体
蛋白质氨基酸序列构建系统进化树结果一致 [ 10] , 进
一步证明了鲽形目与鲈形目的亲缘关系较近。分支
节点的数值表示自引导值 ( bootstrap) ,重复 1 000次。
3 讨论
近年来, 随着人类基因组计划的完成和分子生
物学研究的不断深入, 人们越来越认识到 cDNA文
库的构建和 ESTs在快速获得和研究人和动物功能 图 2 圆斑星鲽 Tropon in !氨基酸序列分析聚类结果
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
基因中的重要作用 [ 11]。肌钙蛋白是横纹肌兴
奋收缩耦联的主要调节蛋白, 其中 TnI是肌肉舒缩
的分子开关 [ 12]。本研究通过构建圆斑星鲽的 cDNA
文库最终克隆得到了圆斑星鲽 TnI的完全表达序
列,圆斑星鲽与其它鱼类 TnI的开放阅读框长度相
当,鸟类、两栖类、人的 TnI基因开放阅读框略长,
在昆虫中, TnI基因编码大约 269个氨基酸 [ 9 ] ,这种
TnI氨基酸序列长度的差异可能是由于物种的不
同或者不同的 TnI亚型而导致的。
TnI主要功能是在静止时抑制肌肉的收缩 [ 13 ] ,
许多研究也表明 TnI与肌蛋白的生成和肌肉的发
育有关 [ 4, 9]。其原理是肌肉收缩时释放的 cAMP响
应结合蛋白 ( CREB )可以启动核内 cmyc和其它原
癌基因的表达, 而 cmyc和其它原癌基因单独或协
同作用调控肌蛋白的生成, 完成一系列肌纤维的生
长或分化 [ 4, 14]。多物种来源的 TnI蛋白序列比对
显示, 圆斑星鲽 TnI氨基酸序列与鳜鱼和大西洋鳕
的氨基酸序列相似性最高,分别为 85%和 77%。基
于 TnI氨基酸序列的系统进化分析也显示,圆斑星
鲽、鳜鱼和大西洋鳕聚为一支。同时,以上 3种鱼均
属于肉食、冷水性鱼, 并且肉质均细嫩鲜美。似乎可
以推测不同物种肌肉的肉质和 TnI基因特异性之
间存在一定的关系。圆斑星鲽 TnI cDNA的克隆为
为进一步确定其生物学功能及圆斑星鲽肌肉生长和
肉质研究提供重要依据。
参 考 文 献
[ 1] 王以康. 鱼类分类学 [M ]. 上海:上海科学技术出版社, 1958,
532540.
[ 2] Af ifiNA, E lSooud KA. T issue concentrat ion and ph arm acok inetics
of florfenicol in bro iler ch icken s. Brit Pou lt S c,i 1997, 38: 425428.
[ 3] Tao T, Gong BJ, Leavis PC. Ca lcium indu cedm ovem en t of tropon in
I relative to actin in skeletal m uscle th in filam en ts . Science, 247:
13391341.
[ 4] 田兴国,陈瑶生,凌飞,等. 猪骨骼肌快肌肌钙蛋白 C 2基因的
cDNA克隆与表达分析.遗传, 2006, 28 ( 8) : 949955.
[ 5 ] RenHL, W ang KJ, ZhouH L, et a.l C lon ing and organ izat ion analys is
of a hep cid inl ike gen e and cDNA from Japan sea bass, Lateolabrax
japon icu s. Fish Shellf ish Imm uno,l 2006, 21 ( 3) : 221227.
[ 6] H en rik N, Sren B, GunnarvonH. M ach ine learing approach es to the
pred ict ion of signal p ept ides and other protein sort ing signals . Pro
tein Eng ineering, 1999, 12: 39.
[ 7] Thom pson JD, G ibson T J, Plew n iak FJ, et a.l Th e C lustalX w indow s
interface: flexib le strateg ies formu lt ip le sequence al ignm en t aided by
qu ality analysis tools. N ucleic Acid sResearch, 1997, 56: 604614.
[ 8] Kum ar S, Tam ura K, Ne iM. M ega3: In tegrated softw are for m olecu
lar evolut ionary genetics analys is and sequence alignm en t . B rief ings
in B io informat ics, 2004, 5( 2 ): 150163.
[ 9] 许西奎. 野桑蚕肌原纤维钙结合蛋白及相关蛋白的基因分析
[ D] . 江苏:苏州大学, 2009.
[ 10] 赫崇波,高祥刚,王效敏,等. 圆斑星鲽线粒体基因组全序列结
构及其进化.中国水产科学, 2007, 14( 4) : 584592.
[ 11] Bogusk iMS, Schu ler GD. E ST ab lish ing a hum an transcript m ap.
N ature Genet ics, 1995, 10 ( 4) : 369371.
[ 12] 翟中和,王喜忠,丁明孝. 细胞生物学 [M ] . 北京: 高等教育出
版社, 2000, 317327.
[ 13 ] Perry SV, Qu irkPG, Gao Y. Th e ordered phosphorylation of card iac
tropon in I by the cAMPdependen t protein k inase: structu ral conse
quen ces and functional im pl icat ion s. European Jou rnal of B iochem
istry, 1997, 248: 329337.
[ 14] 吴恒芳,张寄南,马文珠. 心肌肌钙蛋白 I与心力衰竭.心血管
病学进展, 2004, 25 ( 3) : 181184.
182