全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
酶联免疫斑点法的研究进展
庞盼姣 1 张付贤 2 李长安3
( 1 河南科技学院新科学院,新乡 453003; 2中国科学院武汉病毒研究所, 武汉 430071; 3河南省新乡医学院第三附属医院传染科,新乡 453003)
摘 要: 酶联免疫斑点技术 ( EL ISOP )在目前已经被广泛应用在生物学领域。较为详细地从原理、发展简史、操作步骤、
优缺点及应用、展望阐述了酶联免疫斑点技术。
关键词: 酶联免疫斑点 游离细胞因子 抗感染免疫
The Advance of Enzymelinked Immonosorbent Sopt
Pang Panjiao
1 Zhang Fux ian2 L iChangan3
(
1
X inke CollegeH enan Institute of Science and T echnology, X inx iang 453003;
2
Wuhan Institute of Viro logy, ChineseA cademy of Sciences,
W uhan 430071;
3
TheD epartment of Inf ection D isease of theT hird H osp italAff iliated X inx iang M edical University, X inx iang 453003)
Abstrac:t ELISPOT has been w ild ly used in the filed o f life sc iences. In th is ove rv iew, it described the princ iple, h istory, advanta
ges and d isadvan tages, app lication prospect.
Key words: ELISPOT F ree cy tok ine Antiinfection imm un ity
收稿日期: 20091118
作者简介:庞盼姣,女,助教,从事分子免疫学方面研究; Em a i:l pangpan jiaoxx@ 126. com
随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广
泛应用,体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新
的突破。在研究免疫应答机制时, 以往人们常用酶
联免疫吸附试验 ( ELISA (检测体液中游离的细胞因
子 ( CK )或抗体,但由于游离的循环抗体或 CK半衰
期不同,使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结
合,而不能确切地反应体内抗体及 CK水平。而酶
联免疫斑点 ( ELISPOT)技术则可以在单细胞水平上
进行细胞测控。 20世纪 80年代中期, Sedgw ick、
Ho lt和 Czerk in sky等根据 ELISA技术的基本原理,
建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK分泌细
胞的固相酶联免疫斑点技术,因其具有较高的特异
性和敏感性,目前正被国内外广泛应用。
1 酶联免疫斑点法的原理
ELISPOT 技术采用类似于 ELISA 的酶学方
法 [ 1] ,将抗原或特异性单抗预先包被在贴有 PVDF
(聚偏氟乙烯 )膜或硝酸纤维素膜的 96孔微孔板
上,将经适量抗原刺激后的免疫细胞加入微孔中,于
37 含 5% CO2孵箱中孵育,捕获抗原或抗体与免
疫细胞分泌出的抗体或细胞因子结合, 将细胞和未
结合的成分洗掉后,加入酶标记的单抗或多克隆抗
体, 与被检测的抗体或细胞因子结合。加入底物后,
可在有相应抗体、细胞因子的位置产生有色斑点,每
个斑点代表一个分泌抗体或细胞因子的细胞。
2 酶联免疫斑点技术发展史
自 20世纪 70年, 代单克隆抗体技术的发展使
E IA成为理想的免疫检测技术, 广泛应用于抗原、抗
体的组织定位及体液中游离抗体测定 [ 2]。E IA包括
酶联免疫吸附试验 ( ELISA )、细胞 ELISA ( CELISA )、
体外细胞 (酶 )增殖反应技术和酶联免疫斑点 ( ELIS
POT)试验等。ELISPOT技术是从单细胞水平检测抗
体生成细胞,其沿革可追溯到 1963年 Jerne等人设计
的溶血空斑技术 ( hemo lyt ic plaque form ing cell assay,
HPF),可识别并计数单个抗体形成细胞,是免疫方法
学的一项进步。HPF系用羊红细胞 ( SRBC)免疫动
物后取出其淋巴细胞,与高浓度 SRBC结合,加到琼
脂凝胶中, 每个释放溶血抗体的细胞致敏其周围的
SRBC,加入补体使致敏 SRBC溶解, 产生局部溶血
区,即为溶血空斑。但利用补体介导的 SRBC溶血区
作为指示物不够灵敏,有时分泌的抗体也很难偶联到
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SRBC上,或许多抗原决定簇与 SRBC偶联困难,使之
应用受到限制。
20世纪 70年代 Celisa首次以酶标记物取代放射
标记物定量细胞表面分子。该方法先使细胞吸附于
96孔平板上 (预先用多聚 2L赖氨酶处理平板,有助
于细胞吸附 ),然后加入单克隆抗体上清,再加入酶标
Ig和底物,着色区表明单抗与细胞结合。该法所用辣
根过氧化物酶或碱性磷酸酶都是内源性的, 由于细胞
的存在可产生较深的背景; 细胞需固定于平板上, 也
会引起非特异性结合,产生假阳性结果;此外,固定还
会引起一些细胞表面抗原的破坏。1983年瑞典和奥
地利的两个研究组分别同时报道了另一抗体分泌细
胞检测技术, 即 ELISPOT。 1988年又提出用反向
ELISPOT技术, 检测细胞因子干扰素 ( IFN2)分泌
细胞 [ 3]。
3 酶联免疫斑点法的操作步骤
ELISPOT 技术的基本步骤包括以下内容 [ 4, 5 ]。
将适量捕获性单抗或抗原预包被于 96孔 ELISPOT
板上, 用胶带封板,并在 4 孵育过夜。将板用 PBS
洗涤 3遍,再用含 10%胎牛血清 ( fe tal ca lf serum,
FCS)的培养基封闭,室温下孵育至少 1 h。 FCS可
以封闭所包被抗体的 Fc受体以降低非特异性反应。
将细胞样品如外周血单个核细胞 ( perip hera l blood
mononuclear ce l,l PBMC)、经纯化的 CD8+ T 细胞或
去除某种特异细胞群的 PBMC,用含 10% FCS的培
养基稀释至 5 ! 104 - 2 ! 105个 /孔, 分别加入
ELISPOT板微孔中,再加入特异的刺激物,如多肽或
基因表达产物、提取的抗原等, 阴性对照孔中只加入
培养基,阳性对照孔中加入植物血凝素 ( 2g / mL
PHA (或阳性多肽,于 37 5% CO2孵箱孵育 24- 48
h。用含 001% Tween20的 PBS洗涤 6次,加入酶
标记的检测单抗或多抗,孵育 3 h。洗涤 6次后,加
入酶底物室温下显色 20- 30 m in。弃去显色液,用
去离子水清洗 ELISPOT板,室温干燥后即可用检测
系统指示结果。
4 检测系统
目前, 使用的检测抗体标记方法和显色系统有
生物素、荧光素、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶显色
系统等。显微镜下人工计数显色斑点, 由于斑点大
小和形状差别很大, 结果存在较大的计数误差。借
助计算机成像和图像处理软件,可更准确、快速地记
录 ELISPOT的结果,尽量减少计数误差。
目前判断的首要标准还是斑点的大小,但是多
数情况下,试验会产生一些较淡的斑点,用肉眼判断
绝对是背景,所以在设计软件时必需考虑到斑点深
浅因素。计算机可以利用斑点的深浅、是否以中心
为原点向四周减淡等特征对细胞分泌动力学特征进
行分析,这项技术的成熟相信会使 EL ISPOT的应用
范围更加扩宽。
用解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统 [ 6]
计数斑点数, 并用斑点形成单位 ( sfu /L )记录结果。
每一个斑点代表一个特异分泌细胞因子或抗体的细
胞, 这样就可以确定样品中抗原特异性的分泌细胞
因子或抗体的细胞数量。目前已有科研团队自行开
发了 P la te Scanner与自动分析软件, 其中以 Pau l
Lehmann教授研究开发 ImmunoSpo tAnalyzer自动分
析仪最具代表性。分析 ELISPOT试验数据的过程
中, 仪器先以高分辨率镜头捕捉微小孔中膜上呈色
影像,而后储存成 T IF档;这些影像可以进一步使用
手动、或是自动方式计算斑点数目。使用 ImmuneS
po t分析软件, 可以先设定条件,然后同时分析斑点
的大小, 以推估激素分泌的多寡。像 ImmunoSpot
Ana lyzer这类自动图像扫描分析仪器, 可以克服传
统显微镜判读方法耗费人力、及人为客观性等缺点,
彻底解除 ELISPOT分析技术的瓶颈问题, 进一步推
广该技术的新颖应用。
5 酶联免疫斑点法的优势及其局限性
51 ELISOPT的特点
ELISPOT分析使单细胞分泌产物可视化, 且敏
感高,因为它是在直接在分泌细胞的周围进行捕捉,
而且是在表面被冲淡,或者被临近的细胞上的受体
捕获,或降解之前。最低至 1∀100万细胞精度的活
体外频率测量。这种分辨率已经远远超过使用细胞
内细胞因子的四聚物染色和 ELISA法测量的精度。
这种高敏感度非常关键,因为抗原特异性 T细胞在
体外都是典型性的低频率。
ELISPORT的应用使高产量 T 细胞分析成为可
行。例如, 45 mL的血液就足以用于测试 600种不
同抗原 /肽类物质的反应 (图 1)。 ELISPOT 分析在
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筛选肽库,绘制免疫因子方面是一个理想的工具,可
用于确定抗原特异性 T 细胞的功能性亲和力。可
以用于研究未经药物处理过的细胞的分泌过程,如
果观察到净产量减少, 可以确定是来自于分泌细胞
的减少,还是每个细胞分泌产量的减少。淋巴细胞
在 ELISPOT 分析后依然存活,这使得分析之后进行
增值, 用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为
可能。低温储藏后的人类淋巴细胞可以用于检测,
而不会丢失其功能。治疗前和治疗后的样本可以并
排进行测试,结果可以重复。
(指定数目的能产生 IFN- 的细胞与一百万个
抗原呈现细胞 ( APC )混合后,检测产生 IFN- v
细的细胞的数目 )
图 1 ELISPOT法 (左 )和 ELISA法 (右 )分别
测量 IFN的 T细胞数目 [ 1]
52 与其它方法比较
521 EL ISA ELISA通过显色反应, 在酶标仪上测
定吸光度, 与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
ELISPOT 也是通过显色反应,在细胞分泌这种可溶
性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点, 可直接
在显微镜下人工计数斑点或通过计算机辅助的分析
系统对斑点进行计数, 1个斑点代表 1个细胞, 从而
计算出分泌该蛋白的细胞的频率。由于是单细胞水
平检测, ELISPOT比 EL ISA更灵敏, 能从 20万 - 30
万细胞中检出 1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体具
有高亲和力、高特异性、低内毒素的单抗, 在研究者
以刺激剂激活细胞时, 不会影响活化细胞分泌细胞
因子。
522 有限稀释法 ( lim it ing dilution ana lysis, LDA )
LDA能够对特异性 CTL细胞进行定量,但该方法需
要高强度抗原刺激, 这会加快效应 CTL ( eCTL )凋
亡,且不能定量测定 eCTL细胞数量或测定值偏低。
其次, 该方法较繁琐, 培养时间可长达 2- 3周, 而且
很容易造成 T细胞数量损失。
523 四聚体法 ( Tetramer) 最近几年出现了
MHC2#类分子抗原肽四聚体法。该法的优势在于
迅速、直接、灵敏且特异性强, 但该技术也存在较多
应用上的困难,除了合成及稳定 MHC#类分子的技
术困难外,最主要的缺点是表位的选择。由于每次
反应只能分析单一的抗原表位, 而 MHC#类分子
结合的各种表位能否形成 CTL反应, 却随着基因
背景及时间的变化而变化, 因此选择正确的表位
就显得尤为重要。优势表位的筛选可以通过 E lis
po t来进行。同时, 有研究结果表明, 并非所有经
过 T etram er鉴定的阳性细胞都有确切的功能, T et
ramer阳性的细胞数是用 ELISPOT 分析能分泌
INF2细胞数的 10倍, 其中很多不表现功能的惰
性细胞, 可能代表了记忆型 CTL前体细胞。T et
ramer分析只增加了分析的灵敏度, 同时测定其功
能很重要。
524 Cr51释放法 此法是一种比较经典的方
法,虽然在检测 CTL识别的抗原多样性方面非常有
效,且能精确阐明被 CTL识别的最佳表位, 但至多
为半定量的层面,而且 Cr51标记细胞的自发释放率
较高,不适于较长时间培养; 标记时所需的细胞浓度
较高,因而给试验带来诸多不便;此外, Cr51释放法
所测定的是一个细胞群体的特性,而不是单个细胞。
525 胞内 CK染色法 与 EL ISPOT法相比较, 胞
内 CK染色法 ( intrace llu lar CK staining, ICS)主要应
用细胞内累积细胞因子的染色和多色参数的 FACS
法, 是检测循环淋巴细胞中抗原特异性 T 淋巴细胞
的可行方法, 而 ELISPOT 法却可以检测所有分泌
CK的 eCTL。
53 ELISPOT方法的缺陷 [ 7]
ELISPOT方法比 ELISA复杂而费时,需严密控
制试验条件,需要操作人员技术熟练且能对试验结
果进行分析, 以减少试验偏差。ELISPOT 只能检测
到效应 T细胞或 B细胞,如果 T细胞或 B细胞无功
能或分泌其他的细胞因子或抗体, 就有可能低估特
异性免疫细胞的数量。只要细胞分泌量达到一定阈
值, 即可显示斑点; 对一个细胞来说, 不论分泌量高
出阈值多少倍, 仍然显示一个阳性斑点。ELISPOT
无法确认细胞因子或抗体的分泌量, 只能利用计算
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机图像分析斑点的密度和数量粗略估计。
6 应用
目前, EL ISPOT已被用于检测药物、化学制剂及
其它 CK复合物的特性及功能等方面, 因此为体内
免疫功能的调节效应提供了检测依据。近几年来,
ELISPOT技术在肿瘤疫苗评价试验、免疫监测及免
疫学研究中越来越被广泛地使用。
61 人结核杆菌感染的诊断 [ 8]
近年来的研究发现, ELISPOT 技术可检测结核
杆菌显和隐性感染。通过检测 IFN2可计数产生
IFN2的特异性 T 细胞, 计数有色斑点的数量作为
结核杆菌感染的特异性诊断指标。应用 ELISPOT
试验的特异性高,敏感性为 96%, 而结核菌素试验
敏感性为 69%。EL ISPOT诊断结核杆菌感染更为
快速和准确,可与 BCG接种引起的结核菌素试验阳
性相鉴别。
62 ELISPOT 技术在抗肿瘤疫苗研究中的应用 [ 9]
监测疫苗的疗效 ELISPOT技术已用于分析和
评价从传染病病人的 PBMC中检测肽特异的 T淋巴
细胞, 以及在癌症病人中诱导肿瘤特异的 T细胞疫
苗试验。鉴定肿瘤抗原表位 EL ISPOT平板可以提
前大量准备, 移液、洗板和读板都可自动化, EL IS
POT很可能成为定量分析肿瘤或病毒特异性的 T细
胞反应的首选。
63 抗感染免疫中的应用 [ 10 ]
CTL在抗病毒感染的免疫应答中占有主要地
位,而 CD4+辅助性 T细胞亚群 Th1 /Th2的平衡在
抵御病毒感染中起着同样重要的作用 [ 11]。此外,利
用 ELISPOT方法检测 CK如 IFN2就可以进一步了
解到针对 H IV特异的 CTL应答, 相关免疫信息
ELISPOT法还用于评价由 H IV1感染引起粘膜的
CD4
+
T细胞免疫应答,以及 H IVgp 120 g与霍乱毒
素共表达的 DNA疫苗的免疫源性。在许多抗细菌
免疫研究中,该方法也发挥了重要作用。
64 器官移植方面的应用 [ 12 ]
受体对供体特异性 HLA抗体的存在不仅介导
超急性排斥反应而且还可导致急性排斥反应, 限制
了异体抗原敏感患者对供体器官的需要, 因而增加
了等待移植的时间。EL ISPOT是一种强有效的检测
单个抗体分泌细胞的方法, 具有很高的敏感性。因
此, 刺激记忆 B淋巴细胞增殖、分化成浆细胞, 并建
立一种特异性 ELISPOT方法检测 HLA抗体产生细
胞是最佳手段。
65 其它
此外, ELISPOT 检测方法在移植研究, 疫苗开
发, Th0 /Th1 /Th2细胞转换分析, 自体免疫研究, 癌
症研究, 过敏机制探 IL4诱导免疫球蛋白亚型转
换, 传染疾病研究, 抗原决定定位图, 及体液免疫力
研究等方面都有重要应用。
7 展望
ELISPOT在我国哈尔滨、北京和上海等少数单
位采用,并已通过国家级继续医学教育的渠道向全
国推广,将成为基础和临床实验研究的标准技术。
特别是可溶性和不溶性 EL ISPOT结合在一起,可用
于测定单个细胞水平 CK分泌数量及 CK分泌速度,
是细胞免疫研究的重要手段 [ 13]。欧美各国, ELIS
POT 分析技术正在发挥它的完整潜能,它让免疫学
家可以直接洞察活体内 T细胞相关生理学或病理
学, 就像是心脏外科医师手中的心电图,经由此技术
科研人员可以在活体内直接进入一个器官系统, 在
那里视察、发掘,得到全新的认知 [ 14 ]。
在体试验中, ELISPOT技术被当成重要的终结
指针。2003年 1月,世界卫生组织通过与中国北京
性艾中心合作,将应用 ELISPOT技术监测 H IV疫苗
研究免疫应答反应,该计划是首次利用 ELISPOT技
术对亚洲国家从事 H IV疫苗研究和临床试验的有
关研究。期待未来此技术能在我国免疫学界得到广
泛地应用。
参 考 文 献
[ 1] 何江,周郁,仇东辉,余伍忠,等.酶联免疫斑点法研究进展.中国
优生与遗传杂志, 2006, 14( 11) : 117120.
[ 2] 李文敏.酶联免疫吸附反应的技术进展及应用.湖北职业技术学
院学报, 2003, 6 ( 4) : 6569.
[ 3] 李庆生,吴圣楣,应大明,等.反相酶联免疫斑点法检测脐血免疫
球蛋白释放细胞的数量.免疫学杂志, 1998, 14( 1 ) : 6768.
[ 4] 侯世芳,许贤豪,刘广志,等.酶联免疫斑点 ( ELISPOT)技术的应
用.中国神经免疫学和神经病学杂志, 2002, 9( 4 ) : 200202.
[ 5] 赖春宁,黎燕,齐春会,等.酶联免疫斑点方法改进及应用.上海
免疫学杂志, 2001, 21 ( 6) : 355357.
[ 6] 陈茶,黄彬.一种细胞免疫学新技术 ∃ ∃∃ 酶联免疫斑点技术.国
际检验医学杂志, 2006, 27( 3) : 243246.
70
2010年第 3期 庞盼姣等:酶联免疫斑点法的研究进展
[ 7] 黄煜敏,王维治.酶联免疫斑点技术的进展. 中华神经科杂志,
1998, 31( 2 ) 115116.
[ 8] 史可云,胡忠义. 酶联免疫斑点技术在结核病诊断中的应用现
状.中华结核和呼吸杂志, 2006, 29 ( 6) : 414416.
[ 9] 刘娟妮,等.酶联免疫斑点技术在肿瘤研究中的应用.免疫学杂
志, 2006, 22( 3 ) : 101104.
[ 10 ] 高斯媛,齐俊英.酶联免疫斑点法在感染性免疫中的实际应用.
国际流行病学杂志, 2007, 34 ( 4) : 264266.
[ 11 ] H elm sT, Boehm BO, Trezza R J, et a.l D irect visualizat ion of cyto
k ineprodu cing recal l an tigenspecific CD4 m em ory T cells in
healthy ind ividua ls and H IV p at ien ts. Journal of Immuno,l 2000,
164: 37233732.
[ 12] 孟筱坚林茂芳牟海波,等.酶联免疫斑点法研究小鼠急性移植
物抗宿主病模型中产生干扰素 C细胞的水平.浙江大学学报,
2006, 35 ( 4) : 397402.
[ 13] Jakobson E, et a.l Cytok in e product ion in n ick elsens itized ind ividu
als analyzed w ith en zym elink ed immunos pot assay: possib le im p li
cation for d ignos is. Br J Derm ato,l 2002, 147: 442446.
[ 14] LarssonM, et a.l Amp lif icat ion of lowfrequ ency an t iviral CD8 type
1 responses us ing autologos d endritec cells. AIDS, 200, 16:
171174.
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