全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
真核表达载体 pcDNA31(- ) + KG的构建
及在 HeLa细胞中的表达
王洪振 1 王晓光 2 翟雷3
( 1吉林师范大学生命科学学院,四平 136000; 2长春师范学院生命科学学院,长春 130032; 3东北师范大学遗传与细胞研究所,长春 130024)
摘 要: 为了将绿色荧光蛋白 ( green fluorescent pro tein , GFP )引入细胞核内, 采用两轮 PCR方法从原先克隆在 pcD
NA31( ) + GFP载体中将 GFP编码序列扩增出来并引入 Kozak序列和核定位信号, 使用常规酶切和连接方法将其重组至
pUCmT克隆载体中,再将目的片段重组至 pcDNA3 1( )中, 对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定后, 构建了带有 Kozak序
列和核定位信号的绿色荧光蛋白 ( GFP )真核表达载体 pcDNA31( ) + KG。真核表达载体 pcDNA3 1( ) + KG被转染试剂 Su
perfect转染至 H eLa细胞中,绿色荧光蛋白基因在 H eLa细胞中得到表达而且在细胞核中观察到绿色荧光。该研究以绿色荧
光蛋白为标记初步建立了活体观察真核细胞核动态变化的研究体系。
关键词: Kozak序列 核定位信号 绿色荧光蛋白 真核表达载体
Construction of Eukaryotic Expression Vector pcDNA31( ) + KG
Containing Green F luorescent Protein and Its Expression in HeLa Cell
W angH ongzhen
1 W angX iaoguang2 Zhai Lei3
(
1
College of L ife Science, J ilin N ormal University, Sip ing 136000;
2
College of L ife Science, Changchun N ormal
University, Changchun 130032;
3
Institute of Cy tology and Genetics, N ortheastN ormal University, Changchun 130024)
Abstrac:t To introduce green fluorescent pro tein into nucleus, an eukaryo tic expression vector pcDNA3 1( ) + KG conta in ing
g reen fluorescent prote in gene w ith kozak sequence and NLS( nuclear loca lization signal) w as constructed GFP sequencew as am plified
by tw o rounds o f PCR from pcDNA3 1( ) + GFP vecto rw ith simu ltaneously being attached Kozak sequence and NLS, and then cloned
into pUCmT vector fo llow ing the routine procedures The in terest gene fragm ent w as recom binated into eukaryotic expression vec to r
pcDNA3 1( ) to construct pcDNA3 1( ) + KG After iden tification by enzyme digestion, PCR and sequenc ing, the pos itive clones
w ere transform ed intoH ela cells w ith transfec t reagent Superfect GFP genew as expressed in H e la ce lls and g reen fluorescent lightw as
observed in nuc leus Th is pape r prelim inarily estab lished a system fo r study on dynam ic changes o f nucleus in live ce lls w ith GFP as a
repo rter
Key words: Kozak sequence Nuclear localization signa l G reen fluorescen t prote in Euka ryotic expression vecto r
收稿日期: 20091022
基金项目:国家自然科学资金资助项目 ( 30040031) ,吉林师范大学博士科研启动项目 ( 2004010)
作者简介:王洪振,博士,副教授,研究方向:分子细胞生物学及植物生物技术; Em ai:l b iostuden t@ sohu com
绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和
珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外
或蓝光激发时, GFP发射绿色荧光。GFP是一种有
很多优点的报告基因, 在各种异源细胞中表达后均
可检测到荧光的发射, 且对宿主细胞不存在毒性。
与传统的活体染色、放射自显影以及使用相差显微
镜对细胞进行活体观察等研究方法相比, 重组 GFP
的检测不需要对细胞进行固定或破碎, 只需要一定
波长的光激发,能够方便地直接观察生活条件下的
细胞。自从 1994年 Cha lfie等首次在异源细胞中表
达了能发射绿色荧光的 GFP之后, GFP作为一种新
型的报告基因在现代生命科学研究中得到越来越广
泛的应用 [ 1- 5]。
在进行基因功能及其表达调控研究时, 如何使
目的蛋白得到高效表达是需要关注的重要问题之
一。通过研究起始密码子 ATG周边碱基定点突变
2010年第 1期 王洪振等:真核表达载体 pcDNA31(- ) + KG的构建及在 HeLa细胞中的表达
后对转录和翻译所造成的影响,总结出在真核生物
中起始密码子两侧序列的碱基分布所满足的统计规
律,即起始密码子两端序列为: G /NC /NC /NAN
NATGG,如 GCCACCATGG、GCCATGATGG时, 转录
和翻译效率最高, 特别是 - 3位的 A对翻译效率非
常重要,该序列被称为 Kozak序列 (以起始密码子
AUG为准, A为 + 1,其上游 C为 - 1,下游 G为 + 4,
以此类推 ) [ 6]。实际上, Kozak序列是位于真核生物
mRNA 5 端帽子结构后面的一段核酸序列,可以与翻
译起始因子结合而介导含有 5 帽子结构的 mRNA翻
译起始,对应于原核生物的 SD序列。
核定位信号 ( nuclear loca lization signa,l NLS) 是
一种存在于细胞内许多蛋白质中并介导蛋白质由细
胞质向细胞核内转运的氨基酸序列。虽然利用 GFP
为标记的研究报道较多, 但大多数集中于研究细胞
质中蛋白被 GFP标记的情况, 人为引入核定位信
号,使活体细胞核被 GFP标记的报道相对很少。本
试验在 GFP编码序列 5 端通过两轮 PCR法引入
K ozak序列和核定位信号, 构建了附加 Kozak序列
和核定位信号的绿色荧光蛋白真核表达载体 pcD
NA31( ) + KG并转染 HeLa细胞,经检测表达后的
绿色荧光蛋白能够特异地进入细胞核, 初步建立了
以绿色荧光蛋白为标记活体观察真核细胞核动态变
化的研究体系。
1 材料和方法
11 材料
宿主菌大肠杆菌 DH5、带有绿色荧光蛋白基因
的质粒 pcDNA31( ) GFP和 HeLa细胞系由东北师
范大学遗传与细胞研究所保存。 pUCmT载体 PCR
产物克隆试剂盒为上海生工公司产品, pcDNA31( )
真核表达载体为 Inv itrogen公司产品。DNA M arker、
限制性内切酶、T4DNA连接酶和 PCR预混液为大连
宝生物公司产品。DNA片段回收试剂盒为北京鼎国
公司产品, Superfect转染试剂为 Q IAGEN公司产品。
12 载体构建
121 中间克隆载体 T + KG的构建 根据绿色
荧光蛋白基因序列设计附加核定位信号的 5 引物
GPN1: 5 AAACCCAAGAAGATCAAGACGGAGGAC
GCCACCATGGTGAGCAAGGG3 ,双划线为核定位
信号,单划线为 GFP编码序列; 附加 Kozak序列的
带有核定位信号的 5 引物 GPK3: 5 GCCACCATG
GTGAAACCCAAGAAGATCAAGACGGAGG3 , 单划
线为 K ozak序列,其余对应于核定位信号编码序列;
3 引物 GPKN2: 5 TTACTTGTACAGCTCGTCCAT
GCCG3 , TTA为 GFP的终止密码子, 其余对应于
GFP编码序列;还设计了用于质粒构建过程中鉴定
插入片段方向的中间克隆载体 pUCmT插入点上游
5 引物 T5: 5 ATGATATCCCATGGGCG3 。
以带有绿色荧光蛋白基因的质粒 pcDNA31
( ) GFP为模板,以 GPN1和 GPKN2为引物,进行
PCR扩增。 PCR扩增条件为 94! 变性 5m in后, 进
行 PCR循环: 94! 1m in, 55! 1m in, 72! 1m in, 共
30个循环。再以此扩增产物为模板, 以 GPK3和
GPKN2为引物,进行 PCR扩增, 扩增条件同上, 得
到的扩增产物称为 KG。KG经琼脂糖凝胶电泳, 纯
化回收后,连接到中间克隆载体 pUCmT上, 重组质
粒转化感受态大肠杆菌 DH5,提取阳性重组质粒,
经过 P st∀酶切鉴定以及用 pUCmT 5 端引物 T5和
GPKN2为引物进行 PCR扩增鉴定插入片段的方
向, 构建成中间克隆质粒T+ KG。
122 真核表达载体 pcDNA 31( ) + KG的构建
分别小量制备中间克隆载体 T + KG和真核表达
载体 pcDNA31( )的质粒 DNA,同时分别用 E coR I
和 xho I双酶切,经琼脂糖凝胶电泳, 分别回收目的
粘性末端,用 T4DNA连接酶将带有 Kozak序列和核
定位信号的 GFP基因片段与载体 pcDNA31( )连
接, 转化感受态大肠杆菌 DH5,提取氨苄青霉素抗
性菌落的阳性重组质粒,经过 PCR鉴定与 E coR I和
xho I双酶切鉴定及测序鉴定, 构建成真核表达载体
pcDNA31( ) + KG。
13 细胞转染和相关检测
131 质粒的转染 将质粒 pcDNA31 ( ) + KG
及对照质粒 pcDNA31( )转染 HeLa细胞, 按照转
染试剂 Superfect(Q IAGEN)说明书操作。
132 GFP蛋白的荧光检测 将转染 24 h后的细
胞用荧光倒置显微镜观察并照相。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
2 结果
21 中间克隆质粒 T+ KG的酶切鉴定和 PCR鉴定
以带有绿色荧光蛋白基因的质粒 pcDNA31
( ) GFP为模板, 以 GPN 1和 GPKN2为引物, PCR
扩增得到 GFP基因的 753 bp的片段。再以此片段
为模板,以 GPK3和 GPKN2为引物, PCR扩增得到
765 bp的片段 KG,电泳结果见图 1。 pUCmT载体全
长 2 773 bP,具有一个带突出 T碱基的缺口,可以直
接连接 3 末端带有突出碱基 A的 PCR产物。KG经
纯化回收后,连接到中间克隆载体 pUCmT上, 构建
成中间克隆质粒 T + KG。pUCmT载体上下游各有
一个 P st I的酶切位点,因此可以利用限制酶 P st I酶
切验证重组子的是否含有插入片段,琼脂糖凝胶电泳
结果见图 2。同时用 pUCmT5 端引物 T5和 GPKN2
为引物进行 PCR扩增鉴定插入片段的连接方向, 琼
脂糖凝胶电泳结果见图 3。
22 真核表达载体 pcDNA31( ) + KG的构建
用 E coR I和 Xho I双酶切中间克隆载体 T +
KG,回收带有核定位信号和 Kozak序列的 GFP基因
片段, 经 T4连接酶连接于 pcDNA31( )的 E coR I和
Xho I位点之间, 转化感受态大肠杆菌 DH 5, 提取
氨苄青霉素抗性菌落的阳性重组质粒,经过 PCR鉴
定,琼脂糖凝胶电泳结果见图 4。再进行 E coR I和
Xho I双酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳结果图 5, 构建
成真核表达载体 pcDNA31( ) + KG。
委托上海联星生物工程公司利用 ABI PRISMTM
mode l 377核酸序列自动分析仪对重组质粒 pcD
NA31( ) + KG进行测序分析。测序结果表明, 构
建的 pcDNA31( ) + KG真核表达载体经测序是正
确的, 所得的 PCR片段以符合密码子的顺序插入到
载体 pcDNA31( )上, 得到了附加核定位信号和
K ozak序列的与 GenBank中绿色荧光蛋白 ( GFP)基
因序列的 C末端 cDNA序列 ( 851 - 1581)一致的
753 bp的测序结果。
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2010年第 1期 王洪振等:真核表达载体 pcDNA31(- ) + KG的构建及在 HeLa细胞中的表达
23 转染 H eLa细胞检测报告基因 GFP的表达
用转染试剂 Superfect分别将 pcDNA31( ) +
GFP和上述构建的附加 Kozak序列和核定位信号的
GFP真核表达载体转染至 HeLa细胞中, 荧光显微
镜观察结果见图 6。质粒 pcDNA31( ) + GFP是不
带有核定位信号的真核表达载体, 图 6- A所示为
其转染进入 H eLa细胞后 GFP不进入细胞核,细胞
质呈现绿色荧光,而细胞核中没有荧光,呈现为清楚
的圆形黑色细胞核轮廓。而质粒 pcDNA 31+ KG
是附加 K ozac序列和 NLS的 GFP真核表达质粒,图
6- B所示为其转染进入 H eLa细胞后, 则在细胞质
和细胞核中均可见到绿色荧光, 而且细胞核中的荧
光亮度明显高于细胞质, 呈现出明显的圆形绿色细
胞核。
A质粒 pcDNA31( ) + GFP转染;
B质粒 pcDNA31 () + GFP转染
图 6 质粒 pcDNA31( ) + GFP和 pcDNA31() + KG
转染 HeLa荧光显微镜观察的结果 ( 200 # )
3 讨论
基因功能的研究是当前生命科学研究的热点。
将目的基因导入某一细胞中, 通过观察细胞生物学
行为的变化来研究基因的功能, 这一技术习惯上称
为基因转染, 是目前基因功能研究中常用的方法。
绿色荧光蛋白由于其分子量小,对宿主细胞无毒,稳
定性好、易于检测, 可直接反映基因表达的时空动态
等优点,已经成为对活体细胞进行分子生物学研究
的有力工具 [ 7]。但当前的大量报道中,人为引入核
定位信号,使活体细胞核被 GFP标记的报道相对很
少。本试验目的是以绿色荧光蛋白为标记初步建立
活体动态观察真核细胞核的研究体系,由于在此过
程中没有经过如间接免疫荧光操作的细胞固定等后
续步骤,细胞在观察过程中是存活的,使试验结果更
具有真实性,可以对活细胞进行实时动态观察。
对大量脊椎动物蛋白 mRNA s的天然序列分析
及胰岛素前体蛋白的基因点突变试验均已证实了
Kozak序列 - 3位 A /G (嘌呤碱基 )能明显上调蛋白
的表达 [ 8, 9]。Kozak序列中的 + 4G也有上调蛋白表
达作用 [ 10]。谢庆军等报道在 p53基因 5 端加入
Kozak序列, 实现了重组腺病毒的高效包装与 p53
基因的高效表达 [ 11]。为了增加 GFP基因在真核细
胞中的表达,在设计 PCR引物时在目的基因序列的
ATG上游加上了一段 Kozak引导序列。GFP本身不
是核蛋白,没有核定位信号。为了将 GFP引入细胞
核内,根据文献报道,本试验选择了一种来源于人拓
扑异构酶 I的单一型核定位信号, 蛋白质的氨基酸
序列为 KPKK IKTED [ 12]。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
为了避免在 PCR引物 5 端引入过长的外源序
列对 PCR反应过程造成影响, 本试验设计了两种部
分重叠的 PCR引物,通过两轮 PCR, 在 GFP基因编
码序列 N端引入 Kozak序列和核定位信号。在鉴定
阳性中间克隆重组质粒时, 本试验设计了中间克隆
载体 pUCmT的插入位点上游 5 端 PCR引物 T5与
目的基因的 3 引物 GPKN2进行 PCR, 只有符合预
定方向的插入才能得到预期大小的片段, 若反向插
入则无法扩增出片段, 从而很好地鉴定了外源插入
片段的方向性。在构建真核表达载体 pcDNA31
( ) + KG时,我们充分利用定向克隆的优势, 在分
析中间克隆载体 pUCmT和真核表达载体载体 pcD
NA31( )酶切图谱的基础上, 直接利用两者共有的
分别位于插入位点上游的 E coR I和下游的 Xho ∀
两种单一酶切位点, 这两种内切酶酶切产生不同的
3 凸出末端,使目的基因和载体实现定向连接, 构建
成真核表达载体 pcDNA31( ) + KG。
使用转染试剂 Superfect分别将真核表达载体
pcDNA31( ) + GFP和 pcDNA31( ) + KG转染至
He la细胞, 转染 24 h后 H eLa细胞不经固定直接检
测绿色荧光蛋白的表达。真核表达载体 pcDNA31
( ) + GFP转染后的 HeLa细胞在细胞质内检测到
绿色荧光,而细胞核中没有观察到荧光,呈现为清楚
的圆形黑色细胞核轮廓。真核表达载体 pcDNA31
( ) + KG转染后的 H eLa细胞不仅在细胞质内检测
到绿色荧光, 而且在细胞核内也检测到绿色荧光。
由于转染后的细胞没有进行固定等处理, 处于生活
状态的细胞核即可进行直接观察。因此本试验成功
建立了以绿色荧光蛋白为标记的观察生活细胞内细
胞核的动态变化的研究体系,为进一步开展引入外
源核蛋白引起细胞核的异常形态变化的研究奠定了
基础。
参 考 文 献
[ 1 ] C halfieM , Tu Y, Eusk irchenG, et al Green fluorescen t protein as
a m ark er for gene express ion. Science, 1994, 263( 5148) : 802805
[ 2] GubinAN, R eddy B, N joroge JM , et al Longterm, stab le Exp res
sion of green fluorescen t p rotein inm amm alian Cells B iochem B io
phys Res Comm un, 1997, 236 ( 2) : 347350
[ 3] Oparka KJ, Rob ertsAG, San ta C ruz S, et al U sing GFP to s tudy vi
ru s invas ion and sp read in p lant tissues Natu re, 1997 ( 388 ):
401402
[ 4] 吴春利,刘洁生,杨维东 绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究
中的应用 细胞生物学杂志, 2002, 24 ( 4) : 226230
[ 5] 段青,王倩,祁庆生 绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用.生
命的化学, 2007, 27 ( 1) : 647651
[ 6] KozakM S tructural featu res in eukaryoticmRNAs th atm odu late the
in it iat ion of tran slat ion J B io l Chem, 1991, 266 ( 30 ): 19867
19870
[ 7] 郭光沁, 郑国锠 绿色荧光蛋白在活体细胞分子生物学研究中
的应用.世界科技研究与发展, 1998( 1) : 7075
[ 8] KozakM An analys is of 5 ~ noncod ing sequen ces from 699 verte
b rate m essenger RNAs Nucleic Acids Research, 1987, 15( 20 ):
81258148
[ 9] KozakM Poin tm u tat ions def ine a sequen ce flank ing the AUG in it i
ator codon th atm odu lates trans lation by eukaryot ic ribosom es C el,l
1986, 44( 2 ): 283292
[ 10] 杜明梅, 叶玲, 刘建伟, 等. K ozak序列 + 4G提高绿色荧光蛋
白在 HEK293细胞中的表达. 生物工程学报, 2008, 24 ( 3 ):
491494
[ 11] 谢庆军,范凌云,李季风, 等. Kozak序列引导的人 p53基因重
组智能腺病毒载体的构建与表达. 中国生物制品学杂志,
2008, 21( 2 ): 107110
[ 12] Mo YY, W ang CY, Beek TW A N ovelNuelear Localizat ion S ign al
in H um an DNA Topo isom erase ∀ . J B io Chem, 2000, 275 ( 52 ):
4110741113
192