全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
草原红牛 IGFI基因 5调控区序列的生物信息学分析
张金玉 1 张国梁2 赵玉民2 秦立红 1 鲍永华 1 刘畅 1 宋永利 1 赵志辉 1
( 1 吉林大学畜牧兽医学院,长春 130062; 2 吉林省农业科学院,公主岭 136100)
摘 要: 胰岛素样生长因子I( IGFI)基因为多启动子基因,也是影响动物生长发育和肉用性状的重要候选基因。在克
隆草原红牛 IGFI基因 5调控区 1 954 bP的基因组序列基础上, 利用生物信息学软件, 分析了 IGFI 5调控区的启动子结构;
预测出评分在 95分以上的转录因子结合位点有 71个; 分析结果没有发现 CpG岛和 TATAbox。研究结果为进一步研究 IGFI
转录效率以及对草原红牛生长和肉用性状的影响奠定基础。
关键词: 草原红牛 IGFI基因 5调控区 生物信息学
Bioinformatics Analysis on 5UTR of IGF I Gene in Red Steppes
Zhang Jinyu
1 ZhangGuoliang2 Zhao Yum in2 Q in L ihong1 Bao Yonghua1 L iu Chang1 SongYongli1 Zhao Zhihui1
(
1
Laboratory AnimalC enter of J ilin University, Changchun 130062;
2
Agricultural Sciences A cademy of J ilin, Gongzhuling 136100)
Abstrac:t As am ultiprom o ter gene, Insu linlike g row th factorI ( IGF- I) gene is essential candidate gene fo r anim a l g row th, de
ve lopm ent and mea t qua lity tra itThe red steppes IGF I gene 5UTR was cloned and sequenced, then a 1 954 bp gene sequence was ac
qu ired B io informa tics too ls w ere used to ana ly se the prom oter reg ions, by wh ich 71 transc riptiona l factors bind ing s ites were predicted
w ith sco res h igher than 95But the CpG island and the TATAbox w as not found in the reg ionThe resu lt cou ld estab lish the basis fo r
further research on IGFI transcription efficiency and its effect on grow th and m eat qua lity tra it of red steppes
Key words: Red steppes IGFI gene 5UTR B io inform atics
收稿日期: 20081208
作者简介:张金玉 ( 1982) ,女,硕士研究生,研究方向:分子遗传与动物育种
通讯作者:赵志辉,男,教授,博士生导师, Em ai:l zh ihu izh ao@ jluhp edu cn
基因表达调控机制是后基因组时代一个重要的
研究内容。真核生物基因的转录效率受 5UTR的调
节,基因正确的表达有赖于一个复杂的调控系统, 而
转录因子与转录因子结合部位的相互作用是这一系
统的重要组成部分。启动子是基因 5端区域且控制
转录起始,各基因启动子中转录因子结合位点的排列
各不相同, 决定着基因表达的组织特异性和时空
性 [ 1]。生物信息学的发展为真核生物基因调控研究
提供了新的工具和方法,利用生物信息学软件不仅可
以对转录起始位点和启动子区域作出预测 [ 2~ 4] ,而且
能够对潜在的转录因子结合位点进行分析, 旨在为基
因表达调控研究提供科学参考和依据。
胰岛素样生长因子I( IGFI)基因为多启动子基
因,是影响动物生长发育、繁殖和肉用性状的重要候选
基因,也是生长激素生长促进活动中的主要介导者。
成熟的 IGFI是由 70个氨基酸组成的具有内分泌、自
分泌和旁分泌特点的碱性单链多肽,由 6个外显子和 5
个内含子构成,全长 80 kb,是一种多功能细胞增值调
控因子 [ 5, 6]。虽然 IGFI是一个单拷贝基因,但是由于
选择性拼接和潜在的多个启动子的使用, 就使的对
IGFI的 5调控区的研究具有了重要的意义。
1 材料与方法
11 材料样品
草原红牛来源于吉林省农科院。颈静脉采血,
ACD抗凝, - 20 保存待用。试验所用 Taq DNA
Po lymerase、DNA M aker DL2000、dNTP及 DNA纯化
回收试剂盒均购自维特洁生化产品经销公司。
12 试验方法
121 引物设计 根据人, 小鼠及猪的 mRNA序
列, 确定第一外显子的位置, 与已经公布的牛基因组
进行 B last比对, 截取自第一外显子及其之前的 2
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
000 bp的基因组序列扩增 IGF I的 5调控区。用
Primer50软件设计一对引物。上游引物 S: 5
AAGCGGGGCTCATTAAAGG3;下游引物 AS: 5TTG
GTTAGCAGGAATAATGAGG3。引物由上海生工生物
工程有限公司合成。
122 目的片段的 PCR扩增 PCR反应体系为 25
,l包括 25 l 10 buffer(含 20 mo l/LM g2 + ), 05
l dNTP( 10 mmo l/L ) , 10 mol/L上、下游引物各
05 ,l模板 DNA 1 ,l TaqDNA聚合酶 03 ,l灭菌
去离子水 197 l。PCR扩增条件: 95 预变性 3
m in; 94 变性 45 s, 61 退火 1 m in, 72 延伸 2
m in, 35个循环; 72 延伸 10 m in, 4 保存。取 5 l
PCR产物用 10%的琼脂糖凝胶电泳检测。
123 目的片段的克隆测序 用 DNA回收试剂盒
回收 PCR扩增产物并连接到 pMD18T载体上, 16
过夜。转化大肠杆菌 DH5感受态细胞,接种转化后
的 DH5于含有 Amp的 LB固体培养基上 37 培养
12~ 16 h后,挑取阳性菌落接种于含有 Amp的 LB液
体培养基中, 37 200 r/m in培养 12 h,对菌液进行
PCR鉴定后,送上海生工生物工程有限公司测序。
124 序列分析与结构预测 启动子在线分析软件
NeuralNetwork Promoter Prediction (wwwfru itflyorg /seq
_too ls/promoterhtm l)、Promoter SCAN ( http: / /wwwbi
mascitn ihgov /molbio /proscan)、Promoter20 ( http: / /
wwwcbsdtudk/ serv ices/Promoter/ ),转录因子结合位
点预测软件 TFSEARCH ( http: / /wwwcbrc jp / research/
db /TFSEARCHhtm l)以及 CpG island预测软件 ( ht
tp: / /wwwurogeneorg /methprmi er/ index1htm l)。
2 结果与分析
21 牛的 IGF I基因 5调控区的扩增
经琼脂糖电泳检测目的条带大小与预计的相符
(图 1)。测序结果与牛基因组比对, 确定为草原红
牛 IGF I基因的 5调控区,大小为 1 954 bp。
22 牛的 IGF I基因 5调控区的启动子预测结果
将测序得到的草原红牛 IGF I基因 5调控区用 3
种不同的软件分析,得出潜在的启动子结构。Neural
Network Promoter Pred iction软件分析发现有 4个可能
的启动子,分别在 240~ 290 bp, 319~ 369 bp, 952~ 100 2
bp, 1 440~ 1 490 bp处; Promo ter SCAN分析发现在 14
~ 264bp处存在可能的启动子区段; Promo ter20预测
图 1 牛 IGFI基因扩增产物琼脂糖电泳
结果没有发现启动子区段 (图 2)。
图 2 启动子预测结果
23 牛的 IGF I基因 5调控区的转录因子结合位
点预测结果
将牛 IGF I基因 5UTR序列用在线工具 TF
SEARCH分析,发现有 185个评分在 90分以上的潜在
转录因子结合位点, 95分以上的有 71个。其中 HSF有
44个, N IT2有 5个, ADR1有 14个, STRE有 2个, AML
1a有 1个, SRY有 2个, CdxA有 5个, AP4有 2个, cap
有 2个, HSF2有 1个, dl有 1个。牛 IGF I基因 5UTR
没有发现 CpG island,结果如图 3所示。
图 3 CpG预测结果
3 讨论
基因启动子特异的 DNA序列与特定的转录因
120
2009年第 5期 张金玉等:草原红牛 IGF I基因 5调控区序列的生物信息学分析
子的相互作用,决定下游基因表达的时间、空间和数
量等特性,也是基因表达调控的重要组成部分,因此
进行基因表达调控的研究就需要确定基因序列中的
转录因子结合部位。 5UTR区是各种转录因子结合
的区域,不同的转录因子对基因的表达调控起着不
同的作用,基因的表达是这些转录因子共同作用的
结果 [ 7]。
IGF I基因是影响动物生长、繁殖和肉质性状的
主要调控因子。由于具有选择性拼接的特点,使 IGF
I具有了多种启动子结构。本实验对多种启动子区段
及转录起始位点的预测结果表明,在牛 IGF I基因上
存在多个可能的启动子区段。通常大多数基因具有
一个结构明显的 TATAbox型启动子序列,但是在牛
基因组中的 5调控区或外显子 1和 2附近没有典型
的 TATAbox序列,这与在人、小鼠和羊的研究结果是
一致的 ( AH002705, AH002176和 X69472)。这就可
以解释 IGFI的 mRNA在不同的物种中有多种转录
起始位点。不同的转录起始位点使 IGFI以不同的
方式进行转录,使得各种不同的转录子具有不同的功
能。因此,研究 5UTR对转录水平的调控具有重要意
义。 IGF I基因是机体生长、发育和代谢的一个重要
调控因子,同时也是生长激素 (GH )启动生长活性的
主要介导者,对机体组织和个体生长起着非常重要的
作用。而生物信息学作为一门新的学科对 IGFI的
作用机理的研究有着重要的辅助作用。因此预测启
动子和转录因子对牛 IGFI转录调节的意义还有待
进一步研究
参 考 文 献
1 刘天婵,余应年.中国病理生理杂志, 2004, 20( 4 ) : 668~ 672
2 H annenha lli S, Levy SP B ioinform at ics, 2001, 17: 90~ 96
3 Colem an SL, et alHum M olG enet , 2002, 11( 16 ) : 1817~ 1821
4 Ba jie VB, et alB ioin form atics, 2002, 18 ( 1) : 198~ 199
5 Sh im atsu A, Rotw ein P J B iol Chem, 1987, 262: 894~ 900
6 D icksonMC, et a l JM olE ndocrino,l 1991, 6: 17~ 31
7 Lem on B, T jian R G enes Dev, 2000, 1( 4) : 2551~ 2569
(上接第 112页 )
sea基因全长序列为 774 bp, 其中 1 ~ 72 bp为
信号肽序列,共编码 257个氨基酸。采用 PCR法克
隆了 774 bp的 sea序列, 以 pGLSRED为基础, 构
建了 pGLSSEA真核表达质粒。经 DNA序列分
析,以 ATCC25923基因组为模板获得的 sea基因序
列,与 GenBank( NC_003923和 M18970)相比, 共有
9处碱基有差异,其中有 4处为有意义差异, 该序列
分别经过 3次合成引物、3次 PCR、3次克隆、经 2个
生物公司测序所证实, 该基因序列已登录至 Gen
Bank,登录号为 EF520720。
尽管所构建 SEA真核表达质粒的目的基因带
有信号肽序列, 但仅在重组质粒转化 A 549细胞的
裂解液中检测出了诱导 PBMC活化的超抗原活性,
而在其上清液中未检测出超抗原活性。分析其原
因:由于采用了未建稳定转染细胞株的瞬时转染,同
时瞬时转染的上清液又未进行浓缩, 故很难检测出
其上清的超抗原活性。结果表明, 真核细胞表达的
SEA具有诱导 PBMC活化的超抗原活性, 该活性是
由非特异性活化的淋巴细胞、以及由其释放的细胞
因子进一步活化单核巨噬细胞、NK细胞等免疫细
胞所共同表现的, 这种活性与天然原核表达的 SEA
的异同有待进一步研究。
本研究构建了 Surv iv in启动子调控的 SEA真核
表达质粒,并在细胞水平研究了其功能,证实了该质
粒在肺癌 A549细胞中能表达 SEA、表达产物具有
超抗原活性。关于 SEA表达的定量研究以及如何
利用减毒沙门菌等肿瘤靶向性载体递送该质粒到肿
瘤组织、进而在体内发挥抗肿瘤效应等有待进一步
研究。
参 考 文 献
1 Sundsted tA, et al Int Immunoph arm aco,l 2008, 8( 3) : 442
2 Bao R, et al JN at lC ancer Inst, 2002, 94 ( 7) : 522~ 528
3 罗利琼,等 广东药学院学报, 2004, 20( 3) : 269~ 270
4 宋宏萍,等 免疫学杂志, 2004, 20( 5) : 357~ 360
5 邓晓芳,曾波航, 胡伟民 现代临床医学生物工程学杂志, 2005,
11( 5) : 386~ 388
6 J Sch lievert PM, et al M ethodsM ol B io,l 2007, 391: 113
7 Lu SY, et al W orld J Gastroen tero,l 2004, 10( 1 ): 53~ 57
121