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综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
乳酸乳球菌作为基因工程受体菌研究进展
李芳1, 2  李永明 2  徐子伟 1, 2  张磊 1, 2
( 1浙江师范大学,金华 321000; 2浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,杭州 310021)
  摘  要:  乳酸乳球菌 ( Lactococcus lactis )是一种 公认安全 !的革兰氏阳性细菌, 广泛存在于人、畜的肠道中并发挥许多
重要的生理功能。由于它兼具安全性与益生性,近几年来研究者们开始关注用乳酸乳球菌作为受体菌来表达外源蛋白。随
着生物技术的发展, 人们对乳酸乳球菌基因表达及调控过程的认识不断深入并构建了一系列表达 ,成功地表达了许多外源蛋
白, 初步展示出良好的应用前景。主要对近年来国内外将乳酸乳球菌作为外源蛋白表达受体菌方面的研究进展做简要综述。
关键词:  乳酸乳球菌 受体菌  外源蛋白 表达系统
Research Progresses on Lactococcus lactis as Cell Factory
for Recombinant Protein Expression
L i Fang
1, 2  L iYongm ing2  Xu Z iw ei1, 2 Zhang L ei1, 2
(
1
Zhejiang N ormal University, J inhua 321000;
2
Institute of AnimalH usbandry and Veterinary Science,
Zhejiang A cademy of Agr icultural Sciences, H angzhou 310021)
  Abstrac:t  Lactococcus lactis as a G ram positive bacter ium wh ich p lay important functions in the gastro in testina l tract of anim a l o r
hum an have been c lassified as genera lly regarded as safe! ( GRAS) stra in. Due to the ir safety and prob io tic effects, L. lactis have been
stud ied em phasisly as a vector of recomb inant prote in expression. W ith the deve lopm ent of bio
technology, a series o f expression sys

tem s have been construc ted, w herem any heterogeneous pro te ins have been produced. The paper rev iew ed the recent progresses on Lac

tococcus lactis as cell facto ry fo r recomb inant prote in express ion.
Key words:  Lactoco ccus lactis Vec to r H etero logous protein Expression system
收稿日期: 2009
12
21
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30871799) ,浙江省重大科技专项 ( 2008C02003
2 )
作者简介:李芳,女,在读硕士研究生,研究方向:动物健康养殖与分子生物学; E
m ai:l lifang034177421@ yahoo. com. cn
通讯作者:徐子伟,研究员,博士生导师, E
m ai:l xzw fyz@ s ina. com
乳酸乳球菌是一种 公认安全 !的革兰氏阳性
菌, 广泛存在于人、畜的消化道中并发挥着重要的
生理功能。近 20多年关于乳酸乳球菌的研究表
明, 它的新陈代谢相对来说比较简单, 其生理、生
化和遗传背景等也比较清楚。一些试验菌株, 如
IL1403的基因组序列已经测出来 [ 1 ]。虽然乳酸乳
球菌在蛋白的分泌表达中出现了与枯草芽孢杆菌
(Bacillus subtilis ) (图 1)相似的问题, 即许多外源
蛋白在枯草芽孢杆菌中分泌表达时, 经常被胞外
蛋白水解酶降解 [ 2]。但乳酸乳球菌作为一种表达
受体菌仍具有许多优势, 如主要只有蛋白 U sp45
分泌到细胞外, 因此其产物的下游纯化过程相对
简单;有些试验菌株只有一种输出性的蛋白水解
酶,因此可能得到无细胞外蛋白水解酶的突变菌
株 [ 3]。此外, 乳酸乳球菌在试验条件下很容易生
长、繁殖 [ 4]。所以, 乳酸乳球菌可作为外源蛋白表
达的一种很好的受体菌。
1 乳酸乳球菌表达系统
有关乳酸乳球菌表达系统的描述很多,可以分
为组成型表达系统和诱导型表达系统。
1. 1 组成型表达系统
组成型启动子 ( constitutive promoter)是指在该
类启动子的控制下,结构基因的表达大体恒定在一
定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差
异。这些启动子控制的表达没有一定的规律, 也不
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
受生长条件的调控, 且在试验条件下就可以构建。
用组成型启动子所构建的表达系统就是组成型表达
系统。乳酸乳球菌表达系统中常用的组成型启动子
都是从其基因组中分离出来的,并与含有氯霉素抗
性的 cat
86基因融合 [ 5] , 所以这类启动子的强弱与
氯霉素乙酰转移酶活性大小有关。目前已经有
P21、P23、P32、P44和 P59等 5种启动子融合在质粒
中并控制表达, 如 D ieye等 [ 5]利用 P59启动子在乳
酸乳球菌中控制表达了感染性囊疾病病毒 ( IBDV )
的 VP2和 VP3蛋白。在上述的 5种启动子中, P21,
P23和 P59属于强启动子。P32和 P44属于弱启动
子。研究还发现强启动子的序列比较保守 [ 6]。目前
已经利用这些启动子在乳酸乳球菌中表达出许多外
源基因。
图 1 外源蛋白在乳球菌中分泌表达示意图
1. 2 诱导型表达系统
诱导型启动子 ( inducible promo ter)是指在某
些特定的物理或化学信号的刺激下, 可以大幅度
地提高基因转录水平的启动子。乳酸乳球菌的很
多启动子都属于诱导型启动子, 在特定的条件下,
如抗菌素的攻击、温度或 pH值的变化, 或是加入
特定的糖等都有可能诱导启动子从而启动功能基
因的表达。
1. 2. 1 N ICE系统 乳链菌肽生物合成自身调节模
型,即 N ICE系统, 是由 Kuipers等 [ 7]提出的。N isin
是一种生物合成的抗菌肽, 称乳酸链球菌素。在
N ICE表达系统中加入 N isin后, 可高效诱导调控基
因的表达。有效的 N ICE系统主要由 3个成份构
成, 包括携有 n isR K基因的宿主菌;作为诱导分子
的 n isin或其类似物; 含有 n isA或 n isF启动子片段
的质粒, 其中含有可插入目的基因的多克隆位
点 [ 8]。 n isA或 n isF是由 N isin诱导的启动子, N isK
作为 N isin的传感器, N isR作为反应调节子,激活靶
基因的转录。基因的受体蛋白和反应调节子 nisK
和 n isR基因被分离并整合于适当宿主菌的染色体
上, nisA或 n isF启动子则位于质粒载体上, 当目的
基因被克隆到这个启动子的下游, 并被转化进含有
n isRK的宿主菌中, 这个基因便可诱导表达 [ 9]。其
作用机制如图 2。
62
2010年第 5期 李芳等:乳酸乳球菌作为基因工程受体菌研究进展
N ICE系统已经广泛也应用于乳酸乳球菌中表
达各种外源蛋白。这个表达系统有许多优点: 使用
方便, 受控严格, 非诱导条件下不表达目的蛋白或表
达量很少,使细菌生长与外源基因的表达分为两个
阶段, 减轻了宿主菌在表达目的蛋白时的代谢负荷;
容易调控并且可以高效的诱导表达, 可以使外源蛋
白的合成量达到很高的水平 [ 10 ] ; N isin作为诱导物
的消耗量非常低。该系统同样适用于其他的革兰氏
阳性菌,如干酪乳杆菌 ( L. casei )、清酒乳杆菌 ( L.
sakei)和植物乳杆菌 (L. p lantarum ) [ 11]。然而, 在工
业生产中, N isin添加物价格贵, 且用于药物学上的
蛋白, 必须有一个下游的去除 N isin的过程。
图 2 N ICE系统表达蛋白示意图
1. 2. 2 P170表达系统 P170表达系统已经应用
于乳酸乳球菌的工业生产和发酵等过程。该表达系
统由 orfX启动子控制,通过 pH值的降低来调节蛋
白的表达。P170的诱导依靠 RcfB, RcfB是 CRP
FNR
正调节家簇中的一员 [ 12]。
与 N ICE系统相比,在蛋白的生产中, P170表达
系统的主要优势在于可以通过生长过程中乳酸的积
累从而实现自我诱导,因此在工业生产中,易于蛋白
的纯化。虽然此系统的启动子是一个强诱导型启动
子,但其依存的 pH值范围较狭窄, 仅当 pH5. 5时才
能够强烈转录。此外,它受培养温度的影响较大,温
度低时比温度高时活性更强 [ 13]。
2 蛋白质的分泌表达
外源蛋白分泌到胞外培养基主要是通过信号肽
引导实现的。分泌的早期阶段是蛋白前体的识别及
跨膜转运,而跨膜转运的机制是通过信号肽位点的识
别将蛋白转运出去。在前体蛋白转运通过细胞膜后
进行信号肽的切除、蛋白的释放和折叠等一系列过
程。因此,在分泌表达中,信号肽起着关键的作用。
2. 1 蛋白质分泌机制
2. 1. 1 转运机制 乳酸乳球菌转运组件包括以下几
个: SecA作为蛋白质转运途径中的 动力泵 !, 通过
ATP的水解循环驱使蛋白质前体穿过细胞内膜,为前
体蛋白转运提供能量需求; SecY、SecE和 SecG整合
膜蛋白,在不亲水的膜环境中形成一个导电通路。因
为乳酸乳球菌没有 SecDF组件,它的分泌机制比其它
的宿主菌 (如枯草杆菌和大肠杆菌 )都要简单。
2. 1. 2 信号肽的切除 在前体蛋白转运出细胞膜
的过程中或出细胞膜后不久, 信号肽就被 ∀型信号
肽酶切除,释放成熟蛋白。在枯草杆菌或巨大芽孢
杆菌 (Bacillus m ega terium )中, 这个过程依赖多种
信号肽酶, 因此经常是外源蛋白分泌表达的瓶
颈 [ 14]。在乳酸乳球菌中只有一种独特的 ∀型信号
肽酶 S ipL。
2. 1. 3 蛋白质折叠  通过分泌机制运输出细胞的
蛋白都不具活性,当蛋白从细胞膜出来时,通过蛋白
质量控制系统保证蛋白折叠到天然结构。该蛋白质
量控制系统包括折叠因子, 如分子伴侣和折叠催化
剂; 管家蛋白水解酶,主要降解非折叠或折叠错误的
蛋白。此蛋白质量控制系统在一定程度上影响外源
蛋白在乳酸乳球菌中的分泌表达。
2. 2 蛋白分泌表达的影响因素
分泌蛋白是指由宿主分泌系统识别并运输到细
胞质外的蛋白,这些蛋白的前体包含信号肽 ( signa l
peptide, SP)和成熟蛋白。目前, 人们已成功地在乳
酸乳球菌中分泌表达了分子量从 9. 8 kD到 165 kD
的外源蛋白,这表明在乳酸乳球菌中分泌表达外源
蛋白时,蛋白质分子量的大小并非是主要障碍 [ 15]。
研究表明,影响蛋白分泌表达的因素主要有信号肽、
连接短肽和细胞外水解蛋白。
2. 2. 1 信号肽 现在应用于乳酸乳球菌中的信号
肽可以分为内源信号肽和外源信号肽。内源信号肽
是指乳酸乳球菌信号肽, 而外源信号肽则是非乳酸
乳球菌信号肽。Usp45信号肽 ( SPU sp45)是一种内
源信号肽,它是乳酸乳球菌中外源蛋白分泌表达时
常用的一种信号肽。 SPU sp45可以与启动子, 如
P59或诱导型 N ICE表达系统等构建成为分泌型表
63
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
达系统。如孙强正等 [ 16]利用分泌蛋白 ( U sp45)基
因的核糖体结合位点、分泌信号肽和成熟肽前 11个
氨基酸的编码序列 ( SPusp45 ), 克隆到食品级载体
pSH91中,成功构建了一个组成型分泌表达系统,并
且实现了报告蛋白 NucA的分泌表达。Nuc信号肽
( SPNuc)由耐热核酸酶的 nuc基因编码, 是一种外
源信号肽。 LELOIR等 [ 17]研究发现, 以葡萄球菌核
酸酶 (Nuc)为报告蛋白在乳酸乳球菌中表达时,内
源信号肽 SPU sp与 nuc基因融合分泌表达的效率比
外源信号肽 SPNuc与 nuc基因融合表达的效率要
高。说明表达同一种外源蛋白时, 内源信号肽和外
源信号肽之间的分泌表达率有很大的差别。
2. 2. 2 连接短肽  一种人工合成的短肽 ( LE IS

STCDA )融合插入信号肽和成熟蛋白之间可以提高
外源蛋白在乳酸乳球菌中的分泌效率, 如在信号肽
和目的蛋白之间插入该短肽可提高乳酸菌中 N ucB、
NucT和 B abortus L7 /L12抗原等异源蛋白的分泌
表达效率 [ 18]。 LE ISSTCDA在提高蛋白质分泌效率
方面的作用机制是在目的蛋白的 N端插入负电荷
残基, 从而消除分泌蛋白与膜的共价结合作用,因此
提高信号肽的效率和蛋白输出效率 [ 19 ]。此外,
LE ISSTCDA能影响细胞内蛋白前体的水解, 因此可
以提高融合蛋白的产量。
2. 2. 3 其它  PmpA是乳酸乳球菌的一种脂蛋白,
属于肽基脯氨酰顺反异构酶家簇。它与枯草杆菌的
Prs蛋白相似,是一种蛋白折叠因子, 能促进外源蛋
白的分泌表达。如猪葡萄球菌 L ip蛋白在乳酸乳球
菌中表达时,其降解率很高, 当 L ip蛋白与 PmpA蛋
白同时在乳酸乳球菌中表达时,这种降解就会受到
抑制 [ 20]。研究显示, PmpA能够促进蛋白折叠,从而
提高外源蛋白在乳酸乳球菌中表达效率。
在乳酸乳球菌中, H trA是一种输出性的管家蛋
白水解酶。H trA主要负责清除细胞表面的一些异
常蛋白。H trA失活能消除分泌型外源蛋白的降解。
研究表明,几乎所有的测试蛋白在 H trA缺失的突变
菌株中都能稳定表达, 因为这种突变菌株表面没有
蛋白水解酶。
3 总结
乳酸乳球菌是一种 公认安全 !的微生物, 作为
益生菌定植于胃肠道发挥防病促生长的作用, 有利
于人类及某些动物宿主恢复并提高健康状态。以乳
酸乳球菌作为蛋白表达的受体菌具有许多优点, 可
以集益生和外源基因表达的双重功能于一身。目前
已经吸引了国内外许多研究者的眼球。虽然如此,
重组乳酸乳球菌基因工程还存在一些困难和问题,
如由于目前大多数的表达载体仍含有非 食品级 !
的片段,这给乳球菌直接作为活菌微生态制剂带来
了严重的安全隐患;共生乳酸乳球菌长期在消化道
内表达的抗原蛋白能否引起机体免疫耐受等。这些
问题成为制约乳酸乳球菌基因工程发展的瓶颈 [ 21]。
但是随着现代生物技术手段的发展, 相信乳酸乳球
菌将对人类的发展做出巨大的贡献。
参 考 文 献
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(下转第 81页 )
64
2010年第 5期 倪福太等:现代生物技术在植物研究中的应用
性研究的主要内容 [ 7]。
223 抗冷性方面  在植物抗冷性研究方面, 近
年来, 国内外在植物抗冷性的鉴定、抗冷性状的遗传
与基因作图、现代生物技术在植物抗冷育种中的应
用及抗冷性种质资源的筛选等方面均取得了较大的
研究进展。应用植物分子标记技术创建植物数量性
状基因的连锁图,用以辅助选择对植物抗冷性进行
遗传改良。现代生物技术与传统育种方法的有机结
合为抗冷性的遗传改良开辟了的途径 [ 8]。
3 总结
总之,伴随着生物科学世纪的到来,生物技术越
来越多的将会被运用到植物学的研究领域, 这将使
人们的生活变得丰富多彩, 而生物技术本身也将不
断地更新,给人们的生产、生活带来新的飞跃。
参 考 文 献
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