全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
植物游离小孢子胚胎形成机理
袁素霞 孙继峰 刘玉梅 方智远
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081)
摘 要: 植物小孢子胚胎的形成是基于具有单套染色体的小孢子在外界胁迫条件下通过脱分化和再生而形成一个完
整植株的过程，是产生双单倍体的常用方式。它体现了植物细胞的全能性，为植物组织培养和胚胎发育的基础研究提供了一
个独特的模式。从细胞学水平、代谢水平和分子水平 3 个方面综述在植物游离小孢子胚胎形成机制方面已取得的研究进展，
并提出目前尚待解决的问题，以及对未来的展望，为进一步研究小孢子胚胎发生机制提供理论依据和奠定技术基础。
关键词: 小孢子胚胎形成 胚性小孢子 小孢子胚 基因表达 胁迫
Mechanisms of Microspore Embryogenesis Induction and
Embryo Formation
Yuan Suxia Sun Jifeng Liu Yumei Fang Zhiyuan
(Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081)
Abstract: Microspore embryogenesis is the most commonly used method to produce doubled haploids，which is based on the abili-
ty of a single haploid cell，the microspore，to de-differentiate and regenerate into a whole plant as being exposed to stresses． It is an ex-
ample of totipotency in plants and provides a unique system to study fundamental aspects of plant tissue culture and embryo develop-
ment． This paper reviewed the research progress in mechanisms of microspore embryogenesis induction and embryo formation，including
cytological and ultrastructural，biochemical and molecular aspects． Additionally，the existing problems in the mechanism of microspore
embryogenesis and perspective were analyzed． This paper would be useful for next further research on the mechanism of androgenesis．
Key words: Microspore embryogenesis Embryogenic microspore Microspore embryo Gene expression Stress
收稿日期:2011-04-25
基金项目:国家自然科学基金项目(30871708) ，现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-25) ，浙江省重大科技专项农业项目(2008C1200421) ，
农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室项目
作者简介:袁素霞，女，博士，助理研究员，研究方向:园艺植物遗传育种与生物技术;E-mail:ysxia8@ 126． com
通讯作者:刘玉梅，女，博士，研究员，博士生导师，研究方向:蔬菜遗传育种;E-mail:liuym@ mail． caas． net． cn
游离小孢子培养是产生单倍体双单倍体的方法
之一，对加快农作物的杂交育种速度，提高育种效率
具有重要作用。植物游离小孢子培养最早成功于
1973 年［1］。近年来，游离小孢子培养在农作物单倍
体育种中已成为研究的热点之一。此外，游离小孢
子培养方法还可应用于诱变、突变体筛选和基因型
转化等研究，通过游离小孢子培养建立的双单倍体
群体也是进行分子标记和基因图谱的理想材料。因
此，前人在某些作物游离小孢子培养技术上作了大
量工作，对影响小孢子胚胎发生的一些重要因素，如
基因型、供体植株的生长环境、小孢子发育时期、预
处理和培养条件等进行了研究［2 － 9］，并在小孢子胚
植株再生［10］、倍性鉴定及染色体加倍［11］等方面进
行了改进，已取得了较大的进展。这一技术已被广
泛用于常规杂交育种、种质创新和遗传分析，逐渐成
为作物改良和新品种培育工作的一个重要手段。目
前已经在 250 多个物种上进行了游离小孢子培养技
术研究，但只在近 30 个种中获得了成功的培养方
案，其余很多物种是较顽抗的，只能获得极少数或甚
至无法获得小孢子胚胎，并且一些成功的物种也存
在着较顽抗的基因型［12］;尤其是一些农艺性状重要
的作物在小孢子胚胎形成时表现出顽抗性［13］。由
于对小孢子胚胎发生的机理尚未明确，近而阻碍了
这一技术的有效应用。此外，小孢子胚胎诱导和形
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
成作为一种研究细胞全能性的模式体系已经引起很
多学者的兴趣［14，15］。因此，不少学者采用各种研究
方法从细胞形态学、代谢组分及分子水平对小孢子
胚胎发生的机制进行了研究，并已取得一些进展。
1 小孢子胚胎发生的细胞形态学变化
小孢子在外界胁迫(预处理)诱导的条件下，从
配子体发育途径转向孢子体发育途径，从而诱导小
孢子胚的形成。Maraschin 等［16］将游离小孢子胚胎
形成的整个过程划分为 3 个典型的阶段: (1)小孢
子在外界胁迫条件下获得胚胎发生的能力; (2)具
有胚胎发生能力的小孢子(即胚性小孢子)进行分
裂形成有孢子壁包裹的多细胞结构; (3)从孢子壁
里释放出来的类胚结构按合子胚发育模式发育
成胚。
1. 1 第一阶段:胚性小孢子的获得
小孢子正常发育方向是通过不对称核分裂后发
育成花粉，而要让小孢子发育成胚，就要阻断原有的
配子体发育方向，使小孢子进行对称性分裂向孢子
体方向发育，即对称分裂才能诱导小孢子胚发
生［17 － 20］。姜立荣等［17］观察白菜小孢子发现，单核
晚期小孢子大部分都有一个清晰的占整个细胞
50%以上的大液泡，25℃条件下，单核期晚期小孢子
进行不对称分裂;而经过 32℃处理后，对称分裂成
为其主要的分裂方式。
外界胁迫被认为是诱导小孢子从配子体发育途
径转向孢子体发育途径的关键因子，并使其发生均
等分裂。目前比较常用的胁迫方式有热激预处理、
低温预处理、饥饿预处理和秋水仙素预处理及高 pH
值等［1，7，21，22］。
小孢子在受到外界胁迫后，获得胚性，随之细胞
内发生一些特有的形态学变化，如细胞核向中央移
动、液泡破裂和细胞膨大等［19，23，24］。此外，还发生
一些亚细胞器结构的变化，如细胞质形态消失、淀粉
粒减小及数目减少、质体降解、核糖体总数目减少
等［14，25，26］。这一系列变化导致在小麦、玉米、烟草
和水稻等物种上出现“星”状小孢子［4，25，27］。
微管参与细胞分裂并决定细胞分裂面，小孢子
核向中央移动时，微管起着重要的作用，所以被认为
是影响胚胎发生的最主要细胞器。Hause 等［28］通
过细胞学观察，发现抗微管物质秋水仙素可以改变
细胞内细胞器的分布。Zhao［29］也报道不用热激处
理只用秋水仙素，同样可以诱导小孢子胚发生。小
孢子核向中央移动，除微管发生变化外，细胞骨架同
时也发生重排［30］。在甘蓝型油菜小孢子培养中发
现，热激和低温预处理均等引起细胞骨架的重排和
核向中央移动［31，32］。因此，微管和细胞骨架的变化
也是小孢子获得胚性的标志。
1. 2 第二阶段:孢子壁包裹的多细胞结构形成
小孢子获得胚性之后，要按一定的分裂方式进
行分裂进而发育成由孢子壁包裹的多细胞结构。在
此阶段小孢子发育所经历的分裂途径可能存在以下
5 种［20］。
A途径:营养细胞反复分裂。最初是在烟草的
花药培养中观察到的［33］。当双核期的小孢子进行
培养时，其营养细胞进行均等分裂后继续进行反复
分裂形成小孢子胚，而生殖核或者死亡或者分裂为
两个精核之后再死亡，这种分裂方式被命名为 A 途
径［34］。之后，在甘蓝型油菜［18］、小麦［35］和毛曼陀
罗［36］等作物游离小孢子培养中也发现了类似的分
裂途径。
B途径:小孢子核均等反复分裂。最早也是在
烟草的花药培养中观察到的，被定义为 B 途径［33］。
当单核期小孢子进行培养时，小孢子核进行均等分
裂形成两个大小一致的核，无细胞骨架形成，两个核
再继续进行反复分裂，形成一个大约 30 个核的多核
含胞体，这个多核体分化成多细胞团或不分化成多
细胞团，如果这个多核体不能经分化形成多细胞团，
则会死掉。试验证明，这种分裂方式在小孢子培养
中是较常见的［30］。
C途径:此分裂途径中发生核融合。这种分裂
方式导致染色体加倍或多倍体的形成。核融合发生
的情况可以有以下两种:两个均等的单倍体的营养
细胞发生核融合，或一个单倍体营养细胞和一个单
倍体生殖细胞发生核融合。这在毛曼陀罗的花药培
养中较为常见［20］。当小孢子的第一次有丝分裂被
细胞质的流动所阻碍时，发生核融合，之后这两个已
经融合的核又在分裂赤道板及核纺锤体的作用下同
时进行下一轮的正常分裂，形成两个核，且每一个核
都含有一套以上的染色体。当核融合发生在一个核
或两个核的 DNA复制完成之后时，就可获得多倍体
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2011 年第 10 期 袁素霞等:植物游离小孢子胚胎形成机理
胚［36］。在经过甘露醇和低温预处理的大麦游离小
孢子培养中，核融合是导致染色体自然加倍的主要
机制［37］。
D途径:小孢子核均等反复分裂，但与 B途径相
反，形成的多核体直接分化成胚或愈伤组织［38］。但
是这种分裂途径还有待于进一步检验［20］。
E途径:生殖细胞或生殖细胞和营养细胞两者
反复分裂。Raghavan［39］认为，在小孢子培养中，生
殖细胞也具有独自分裂并形成胚或愈伤的能力。只
在黑茛菪的花药培养中发现这种分裂方式，胚形成
于生殖细胞，而营养细胞不分裂，或进行少量分裂并
在来源于生殖细胞的胚的基部形成类似于胚柄的
结构。
从上述 5 种分裂途径来看，在大多数物种中，胚
性小孢子的第一次有丝分裂是均等分裂，而 E 途径
的分裂方式比较少见，在其他物种中还有待被检验。
胚性小孢子对分裂途径的选择可能与其所经历的胁
迫诱导方式有关。
1. 3 第三阶段:类胚结构发育成胚
胚性小孢子在早期胚胎发育过程中经历上述某
一分裂途径后，形成类胚结构并从孢子壁中被释放
出来，其再继续发育的形态与过程类似于合子胚，也
经历球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚，且小孢子各
器官分化时期与合子胚也相似［20］。但是合子胚在
进行最初的不均等分裂时就确定了胚轴，建立了合
子胚发育的极性［40，41］;而小孢子胚是在类胚结构被
释放后，外周细胞才开始进行平周分裂，导致表皮分
化［26，42］，随着表皮的分化，类胚结构逐渐发育成球
形胚、心形胚、鱼雷胚及子叶胚，这一过程类似于合
子胚的发育。
虽然小孢子胚发育的形态与过程类似于合子
胚，但小孢子在胚形成早期所经历的细胞分裂方式
与合子胚不同。这也预示着小孢子胚胎形成在机理
上与合子胚存在一定差异。
2 小孢子胚胎发生的代谢水平变化
Zarsky等［43］和 Garrido等［44］在经过蔗糖饥饿处
理的烟草游离小孢子中，均发现 RNA合成量和蛋白
激酶活性都在下降。Barinova 等［22］发现，培养基的
高 pH有利于诱导烟草游离小孢子的胚胎发生，在
高 pH值培养基中培养的小孢子，其体内转化酶的
活性大幅度降低，从而导致小孢子对培养基中蔗糖
的代谢减慢。
Boutilier 等［15］以甘蓝型油菜为试材，从胚胎高
频发生的小孢子和未反应的小孢子培养 19 d 时的
培养基中分别进行小蛋白质的提取和分离，共得到
60 多个片段，其中大约 40 个片段是蛋白质、多肽和
代谢物;并从中鉴定出 12 个蛋白质来自于无反应小
孢子培养基中，16 个蛋白质来自于胚胎高频发生的
小孢子培养基中，这两组蛋白质仅存在两个相同的
小蛋白质分子。对其中的 6 个小蛋白质进行了测序
和比对，除了两个是未知基因编码的蛋白外，其余分
别与未知花基因(油菜)、BAN54(油菜)、Bp4(甘
蓝)及 LTP(油菜)具有一定的同源性。但是在游离
小孢子培养中，这些小蛋白在代谢途径中如何产生，
又是如何调节胚胎形成的，还有待进一步研究。
3 小孢子胚胎发生的分子水平变化
前人对小孢子胚胎发生的分子机制也开展了一
些工作，主要从 mRNA水平和蛋白质水平对诱导胚
胎发生的机制进行了研究，已取得了一些进展。下
面也从小孢子胚胎发育的 3 个阶段进行阐述。
3. 1 胚性小孢子时期的基因表达
由于外界胁迫是诱导小孢子获得胚性的关键因
素之一，因此对各种预处理诱导小孢子基因表达的
研究已成为研究胚胎发生机理的热点之一。
3. 1. 1 激素调控相关的基因 植物细胞在外界胁
迫(渗透、高盐、低温和缺氧等)作用下均能产生
ABA［45］，ABA 参与胚性细胞的发育。Reynolds
等［46］利用构建的 cDNA 差显文库获得了一个在小
麦花药培养中特异表达的克隆 ECMt，编码一个早期
的半胱氨酸标记第二类金属硫因蛋白;其在花药诱
导之后的 6 h 时特异表达，表达被认为可以作为小
孢子胚胎发生的标记。其启动子区域含有一个
ABA反应元件，在胚胎形成中表现为上调且与内源
ABA水平的波峰相关。进一步的研究表明，Ca2 +参
与 ABA的信号转导，来启动 ECMt 的表达。培养中
的小孢子和其他组织，在 ABA 的作用下，均能诱导
ECMt的表达。但目前还不能确信 ECMt 的表达是
标志着胚性细胞的发育还是简单的 ABA累积。
ADH(乙醇脱氢酶基因)家族的基因表达也是
受 ABA调控的［47］。在外界胁迫诱导大麦的小孢子
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胚胎发生时，ADH3 的诱导表达与高频的胚胎发生
相关，而高频的胚胎发生又与高水平的 ABA 相
关［14］。因此，ADH3 的表达也是受高水平的 ABA调
控的。尽管还不清楚 ECMt 和 ADH3 在小孢子获得
胚性时是否起着调控作用，但是它们的表达与 ABA
水平的关系表明，在小孢子胚胎发生诱导启动时
ABA信号转导级联可能在激活特有基因的表达程
序上起着重要的作用。
Kyo等［48］从氮饥饿的烟草小孢子中分离出一
个磷蛋白 NtEPc。NtEPc 的表达限定于小孢子胁迫
处理的早期，同时，受低 pH 值的诱导，但受细胞分
裂素的抑制。
这些结果表明，除 ABA 信号分子外，其他激素
信号转导级联有可能参与小孢子胚胎诱导过程中基
因表达的程序。
3. 1. 2 细胞保护基因 小孢子受到胁迫处理时，热
激蛋白基因家族的很多成员被诱导并高效表达。
Sabehat等［49］在低温处理后的小麦游离小孢子中，
分离出两个特异表达的小热激蛋白基因(tom66 和
tom111) ，认为这两个基因在低温处理中被诱导表达
可能是用来保护细胞免受冷害。在热激处理的小孢
子中发现了一些热激蛋白的合成，其中 HSP70 被认
为是用来抑制小孢子的程序性死亡。Zarsky 等［50］
在进行饥饿处理的烟草双核早期的游离小孢子中也
发现了一个小热激蛋白基因的表达。在经过热激处
理的玉米和甘蓝型油菜小孢子中均存在 HSP70 蛋
白的活跃合成［32，51］。这些结果表明，HSPs 水平的
升高可能与小孢子胚性的获得有着密切的联系。
Seguí-Simarro 等［52］在经过热激处理的甘蓝型
油菜游离小孢子中分离到 HSP70 和 HSP90，HSP70
存在染色质区域和核仁中，而 HSP90 主要存在染色
质中，在诱导的和非诱导的小孢子中均发现了
HSP70 从细胞质向细胞核中转运。但是，在诱导的
小孢子中，HSP70 的细胞核 /细胞质的密度比值是非
诱导小孢子的 2 倍。这种 HSP70 在核中的富集现
象在烟草和辣椒的热激处理后的小孢子中也被发
现［53］。因此，热激处理能够控制 HSP 的核穿梭，
HSPs的亚细胞定位可能与它的调节功能有关。
秋水仙素处理的油菜小孢子中并没有发现
HSPs水平的升高［54］，可能原因是秋水仙素处理只
改变了 HSPs的核穿梭强度和 HSPs的亚细胞定位。
此外，Telmer等［19］认为，HSPs 也参与了小孢子
细胞命运的再规划，在小孢子中合成的 HSPs 能够
抑制在正常发育成花粉粒时所需要蛋白的活性。由
于大多数 HSPs 是分子伴侣，可能它通过调控其他
关键调节蛋白的亚细胞定位，或利用其高耐热性能，
实现其在小孢子胚胎形成中的间接作用［16］。
Vrienten等［55］通过建立 cDNA文库和差异表达
分析从培养了 3 d的大麦游离小孢子中分离到 3 个
高效上调表达的基因:ECLTP、ECGST和 ECA1，这 3
个基因分别编码非专一的脂肪转运蛋白、谷胱甘肽
S转移酶及未知蛋白。ECLTP 与已知的 LTPs 具有
同源性，一个已知的 LTP 蛋白在胡萝卜体细胞胚胎
形成体系中已成为胚胎发生早期的标记，ECLTP 与
此 LTP具有相似的表达模式。Tsuwamoto等［56］通过
建立差减 cDNA文库和差异显示方法，从甘蓝型油
菜诱导的小孢子中分离出多个 LTP基因。LTP基因
在玉米的合子胚形成过程中也表达［57］。ECGST可能
在保护细胞免受氧化伤害方面起着重要的作用［14］。
进一步的表达分析表明，只有 ECA1 的表达水平与
小孢子胚胎发生能力有关。
另外，GST(谷胱甘肽转移酶基因)在小麦小孢
子胚发生时也被诱导表达，其家族成员在胚胎形成
早期均呈上调表达［58］;GST表达水平与不同预处理
诱导的小孢子胚性能力之间不存在直接的关系［14］。
这些结果表明，在小孢子胚性获得阶段，GST基因的
表达可能主要是用于保护细胞免受 ROS的伤害。
3. 1. 3 淀粉合成基因 在游离小孢子培养中，淀粉
粒的合成被抑制，因此，合成淀粉的基因表达也被抑
制［59］。通过基因芯片的分析手段发现，在甘露醇诱
导的大麦小孢子胚胎形成中，一些调控淀粉合成的
关键基因，如蔗糖合成酶 1、葡萄糖磷酸变位酶、
UDP-4-葡萄糖异构酶、葡萄糖-1-磷酸腺嘌呤转移
酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶转移酶、小颗粒淀粉
合成酶基因均表现下调，而且这些基因下调的同时
伴随着麦芽糖酶和转化酶被诱导，因为麦芽糖酶和
转化酶参与了淀粉和蔗糖的分解［25］。这些结果为
淀粉粒的合成受抑制在小孢子胚胎形成中可能起重
要的作用提供分子证据。
3. 1. 4 水解蛋白基因 利用蛋白质组学的方法研
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2011 年第 10 期 袁素霞等:植物游离小孢子胚胎形成机理
究表明，受到胁迫诱导的小孢子表现出蛋白质合成、
磷酸化、糖基化的改变［44，60，61］，被诱导的小孢子的
蛋白质水平整体下降。因此推断，花粉特有的蛋白
质其表达被下调，提高蛋白质的降解水平也许对小
孢子的孢子体发育途径起重要的作用。事实证明，
阻止花粉特有基因的表达确实有利于启动胚胎的发
生［62］。Maraschin 等［25］发现，编码一个泛酸-26S 调
控分子、半胱氨酸蛋白酶 1 前体、天冬氨酸蛋白酶前
体以及金属蛋白酶 FtsH 的基因与大麦小孢子的胚
胎形成相关。这些结果表明，在小孢子胚胎形成的
早期，水解蛋白酶对氮源的再定位起着重要的作用。
Yu等［63］认为 FtsH 基因是形成正常的叶绿体所必
需的。Maraschin等［25］认为泛酸途径中一些元件及
蛋白酶基因表达的诱导可能与胚性小孢子的有丝分
裂调控有关。
3. 1. 5 细胞分裂相关的基因 均等分裂已成为甘
蓝型油菜游离小孢子胚胎发生的标志，在小孢子改
变原有发育途径而转向孢子体发育途径的同时也伴
随着一系列的细胞形态学变化，如小孢子膨大、细胞
骨架的改变等。而 ROP GTPase 被认为是发育途径
改变的一个分子开关。基于此，Chan 等［64］从培养
了 3 d的甘蓝型油菜小孢子中利用 RT-PCR 技术分
离出了 5 个 ROP 克隆，BnROP4、BnROP5、BnROP6、
BnROP9 和 BnROP10，它们与拟南芥的 ROP 具有高
度同源性。进一步的表达分析表明，BnROP5 是花
粉特有的基因，在无胚性小孢子中的表达水平是胚
性小孢子的 2. 8 倍，而 BnROP9 在根、茎、叶和花粉
中均表达，但在胚性小孢子中的表达水平高出无胚
性小孢子 2. 5 倍。因此，BnROP5 和 BnROP9 的表
达水平可以作为小孢子是否获得胚性的标记。
已经转向孢子体发育途径的小孢子在启动均等
分裂的同时，一些与细胞分裂有关的基因也会被诱导
表达。Tsuwamoto等［56］从甘蓝型油菜小孢子中分离
出了一个与植物硫黏蛋白(PSK)的前体同源的基因。
PSK具有提高有丝分裂活性的作用［65］，能够促进细
胞生长和繁殖［66］及胡萝卜体细胞胚的形成［67］。因
此，PSK在小孢子胚胎形成过程中可能起着作用。
3. 2 细胞分裂形成孢子壁包裹的多细胞结构过程
中的基因表达
3. 2. 1 基因表达的主要调控因子 目前由于甘蓝
型油菜游离小孢子培养体系已经比较成熟，而且其
基因组的外显子和蛋白质编码序列与拟南芥具有较
高的同源性，所以它被视为研究小孢子胚胎发生机
理的模式植物之一。因此，利用甘蓝型油菜研究胚
胎发生过程中的基因表达及功能鉴定工作已经开
展，并取得了一些进展。
Pechan等［61］利用差减显示技术，在甘蓝型油菜
中获得 5 个与小孢子胚胎形成相关的 cDNA 片段，
其中，BNM2A和 BNM2B编码 BURP的结构域蛋白;
BNM4 编码 AtKAT1 蛋白;BNM5 编码未知蛋白;
BNM3(BABY BOOM，BBM)编码的蛋白类似于
AP2 /EREBP结构域转录因子家族。AP2 /EREBP转
录因子家族的特点是具有一个 DNA 结合域(AP2 /
ERF)。AP2 /ERF蛋白是植物特有的并调节不同的
发育及胁迫反应的相关蛋白。BBM 是从已诱导的
并处在分裂过程中的小孢子中分离出来的。BBM
的表达模式和功能在甘蓝型油菜和拟南芥中已被详
细、深入的研究和验证［68］。BBM 在小孢子胚和种
子发育的整个过程几乎都表达，但是在胚乳早期只
有短暂的表达。在 BUI 和 35S 启动子调控下的
BBM异位过表达，能够诱导油菜和拟南芥的体细胞
胚形成，以及其幼苗的营养组织产生类似于子叶胚
的结构，偶尔也会诱导成株叶片产生类似于子叶胚
的结构。而且 UBI∶ BBM和 35S∶ BBM转化的植株均
能被诱导出体细胞胚。因此，BBM 转录因子在植物
细胞分裂和胚胎形成中起至关重要的作用。Boutili-
er等［68］把 UBI∶ BBM和野生型两种拟南芥外植体均
接种在不含生长激素和含生长激素的培养基中，在
这两种培养基中，UBI∶ BBM外植体的再生能力均超
过野生型。由此可见，BBM具有促进细胞生长和分
化的能力。到目前为止，BBM 是第一个被公认的在
小孢子胚胎形成过程中与小孢子分裂起始相关的
基因。
另外一个调控蛋白(AGL15) ，被认为在胚胎形
成的细胞分裂起始期起作用，它是含有 MADS 结构
域的转录因子家族成员之一，尽管其功能是在核内
实现的，但被认为是在小孢子胚、合子胚、体细胞胚
以及无融合生殖胚形成过程中的细胞分裂起始期被
转运到核内的［69］。
此外，一些转录调控胚胎形成的基因，如 LEC
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
(LEC1、LEC2)、WUS和 PICKLE，其功能已通过功能
缺失突变和过表达方式被验证，它们同 BBM一样在
胚胎形成过程中起重要作用。但是，PICKLE 与
LEC、WUS 及 BBM 不一样的是，体细胞胚胎的形成
是在 PICKLE 功能缺失的条件下完成的。试验表
明，LEC、WUS 及 BBM 和功能缺失的 PICKLE 在小
孢子特异启动子［70］调控下的表达，均能诱导一些顽
抗基因型的分生组织或小孢子胚性细胞的形成，或
提高一些反应基因型的出胚率。
Malik等［71］通过构建差减 cDNA 文库从甘蓝型
油菜小孢子中也分离到了 LEC1、LEC2 和 BBM，可
见，这 3 个基因在小孢子胚胎形成时起着重要的作
用。此外，他们还分离出了其他 13 个标记基因，并
对这 16 个基因根据表达方式将其分为 3 大类:胚胎
特异表达的基因(BnFUS3、BnLEC2、BnLEC1、Bn-
UP1 和 BnUP2) ;胚胎表达的基因(BnNAPIN、Bn-
BBM1、BnFAD1、BnWOX9、BnABI3 和 BnATS1)。但
是在其他的某一非胚胎组织中也表达;孢子体表达
的基因(BnLRR1、BnCP1、BnCYP78A、BnWOX2 和
BnCYP81F)除在胚胎形成的过程中表达外，还在孢
子体发育途径的其他阶段的组织中也表达。它们均
是从培养 3 － 7 d的小孢子中分离出来的，在小孢子
胚胎形成过程中均呈上调。由此推断，它们可能在
小孢子胚胎形成中均起促进作用。
SERK是第一个从激素诱导的胡萝卜胚性体细
胞中分离出来的基因，它编码一个亮氨酸丰富非多
跨膜区的类受体激酶。DcSERK 在拟南芥合子胚和
体细胞胚中，只在形成球形胚之前的细胞分裂期进
行短暂的表达［72］。AtSERK1 与 DcSERK同源，其在
拟南芥幼苗中的异位表达表明，高水平的 AtSERK1
表达有利于体细胞胚的形成［73］。有趣的是在玉米
小孢子培养中，在小孢子被诱导获得胚性时和多细
胞结构形成的起始期，ZmSERK1 进行高水平表达，
这也表明，小孢子在获得胚性时及胚胎形成的初期
依赖于 SERK的信号转导途径被启动［74］。类似的，
EP2 只在体细胞胚和合子的多细胞结构中表达，它
编码脂肪转运蛋白，ECLTP 与之同源，它们在大麦
中也伴随着小孢子胚胎形成的起始进行表达［55，75］。
3. 2. 2 信息传递相关基因 Massonneau 等［76］利用
RT-PCR技术对 5 个合子中特异表达的基因在玉米
小孢子胚胎形成过程中的表达情况进行了研究发
现，在小孢子胚胎发育的多细胞结构中同时检测到
3 个在合子胚中特异表达的基因(LTP2、ZmOCL1 和
ZmOCL3)及 2 个在合子胚乳中表达的基因
(ZmESR2、ZmAE3) ，其中 ZmESR2、ZmAE3 的表达
只在培养第 7 天时的游离小孢子中被检测到，但是
在培养第 18 天时的培养基中还检测到 ZmESR2 表
达的蛋白。此外，在成型的小孢子胚中也检测到了
合子胚及胚乳的标记蛋白，这说明小孢子胚与合子
胚在发育中存在差异，小孢子胚在发育过程中扮演
胚和胚乳的双重角色;另外，ZmESR2、ZmAE3 的表
达及 ZmESR2 的分泌蛋白也许对小孢子多细胞结构
的发育起促进、调节和保护作用。研究表明，这些分
泌蛋白对合子胚的发育也起促进作用［77］。进一步
分析表明，玉米小孢子胚胎形成过程中胞外分泌蛋
白大多是糖基化的蛋白(如阿拉伯半乳聚糖蛋白)。
此外，几丁质酶和一些与病原体相关的蛋白也在培
养基中短暂地出现，它们调节培养基更适合于小孢
子多细胞结构体(MCSs)的发育［78］。上述研究表
明，这些分泌蛋白起体外信号的作用，以激活小孢子
胚胎形成过程中特异的时间和空间发育程序。
3. 3 类胚结构发育成胚过程中的基因表达
小孢子胚的类胚结构被释放后，外周细胞才开
始进行平周分裂，导致表皮分化［26，42］。随着表皮的
分化，类胚结构逐渐发育成球形胚、心形胚、鱼雷胚
和子叶胚，这一过程类似合子胚发育。这预示类胚
结构在发育成胚的过程中与合子胚发育有着类似的
分子机理。试验证明，14-3-3 家族的调控蛋白在小
孢子胚和合子胚发育中存在类似的时间和空间上的
调节机制。在大麦小孢子胚形成中，14-3-3A 是在
类胚结构未分化为表皮的外层进行表达;而 14-3-3C
的表达是具有极性的，与盾片的形成有关。在小孢
子胚和合子胚形成的晚期，14-3-3C 只在盾片和顶
端分生组织 L1 层下的一团细胞中表达［79］。
Cock［80］利用 mRNA 差异显示技术分离到一个
基因 DD3-12，编码一个 74 氨基酸的分泌蛋白
(CLE19) ，属于类 CLAVATA3 /ESR(CLE)蛋白家
族。CLE蛋白的特点是分子小(平均 8 kD)、N端是
分泌信号肽、C 端含有保守氨基酸序列 KRXVPXG-
PNPLHN。目前对 CLE 基因家族了解不多，只有对
21
书2011 年第 10 期 袁素霞等:植物游离小孢子胚胎形成机理
其中一个基因(CLV3)了解得比较清楚，它在茎尖分
生组织的干细胞中表达，对维持分生组织中干细胞
数量起着重要的作用。CLE19 在球形胚至心形胚时
期表达，目前它在小孢子胚胎形成中的功能还在研
究中，初步研究结果表明，其功能可能与 CLV3 类
似，利用其信号环的作用促使细胞分化或器官的
建成。
4 问题
尽管前人对小孢子胚胎形成的机理进行了一些
研究，在细胞形态学观察、代谢组分分析及基因表达
上已取得了一定进展，但还存在许多问题有待解决
及进一步研究。
目前，外界胁迫诱导是启动胚胎发生的关键因
素，诱导之后的胚性小孢子具有很多形态学上的特
有特征，但仍不确定哪一个形态特征是小孢子进行
胚胎发育的普遍特征。例如在小麦、玉米、烟草和水
稻等物种上观察到的“星”状小孢子像具有胚性的
小孢子，而在甘蓝型油菜上发现胚性小孢子并没有
“星”状的细胞质结构，只是出现了细胞膨大现象;
均等分裂几乎被公认为是胚性小孢子进行第一次有
丝分裂时的分裂方式，但是 Hu［81］在小麦小孢子培
养中发现，甘露醇诱导的小孢子发生均等分裂，而低
温诱导的小孢子却发生了不均等分裂。此外，小孢
子胚胎发生的形态学特性是否与胁迫方式和物种有
关，还有待研究。
虽然，可以测定小孢子胚胎形成过程中的代谢
组分，对于特有的代谢物质在小孢子胚胎形成中是
怎样产生的，又是怎么发挥调节作用的，这些问题都
有待于进一步研究。
尽管从 mRNA 表达水平及蛋白质组学上利用
各种生物技术手段已经鉴定出一些在小孢子胚胎形
成过程中特异表达的基因和蛋白质，但是到目前为
止也只有 BBM基因已被公认为具有诱导胚胎发生
的能力，其他基因的功能及这些基因和蛋白在胚胎
发生过程中的基因表达程序中是怎样被诱导表达，
又是怎样进行信号转导的，尚不清楚，需要进一步深
入研究。
在游离小孢子培养中，不同物种可能有各自合
适的诱导方式，不同诱导方式也许诱导不同的基因
表达，但是这些不同的表达基因之间是否有必然的
联系，还有待探讨。
通过对小孢子胚胎发生机理进行深入研究，为
克服一些物种及基因型的顽抗性奠定基础，对游离
小孢子培养技术的有效广泛应用和加快单倍体育种
进程具有重要意义。
参 考 文 献
［1］Nitsch C，Norreel B． Effet d’un choc thermique sur le pouvoir em-
bryogene du pollen de Datura innoxia cultive dans I’anthere ou isole
de I’anthere． C R． Acad Sci Paris，1973，276 (serie D) :
303 -306．
［2］Lo KH，Pauls KP． Plant growth environment effects on rapeseed ni-
crospore development and culture． Plant Breeding，1992，99:
468-472．
［3］Takahata Y，Brown DCW，Keller WA． Effect of donor plant age and
inflorescence age on microspore culture of Brassica napus L． Euphyti-
ca，1991，58(1) :51-55．
［4］Touraev A，Vicente O，Heberle-Bors E． Initiation of microspore em-
bryogenesis by stress． Trends Plant Sci，1997，2:29-302．
［5］Soriano M，Cistué L，Vallés MP，et al． Effects of colchicines on anther
and microspore culture of bread wheat(Triticum aestivum L．)． Plant
Cell Tiss Organ Cult，2007，91:225-234．
［6］Ochatt S，Pech C，Grewal R，et al． Abiotic stress enchances andro-
genesis from isolated microspores of some legume species(Fabace-
ae)． J Plant Physiol，2009，166:1314-1328．
［7］Yuan SX，Liu YM，Fang ZY，et al． Effect of combined cold pretreat-
ment and heat shock on microspore cultures in broccoli． Plant Breed-
ing，2011，130:80-85．
［8］Prem D，Gupta K，Sarkar G，et al． Activated charcoal induced high
frequency microspore embryogenesis and efficient doubled haploid
production in Brassica juncea． Plant Cell Tiss Organ Cult，2008，93:
269-282．
［9］Loeroux B，Carmoy N，Giraudet D，et al． Inhibition of ethylene bio-
synthesis enchances embryogenesis of cultured microspores of Brassi-
ca napus． Plant Biotechnol Rep，2009，3:347-353．
［10］袁素霞，刘玉梅，方智远，等．结球甘蓝和青花菜小孢子胚植株
再生的研究．植物学报，2010，45(2) :226-232．
［11］袁素霞，刘玉梅，方智远，等．甘蓝类蔬菜游离小孢子再生植株
染色体倍性与气孔保卫细胞叶绿体数目相关性研究． 中国农
业科学，2009，42(1) :189-197．
［12］ Seguí-Simarro JM，Corral-Martínez P，Parra-Vega V，et al． Andro-
genesis in recalcitrant solanaceous crops． Plant Cell Rep，2011，30:
765-778．
［13］Wang M，van Bergen S，van Duijn B． Insights into a key develop-
mental switch and its importance for efficient plant breeding． Plant
Physiol，2000，124:523-530．
31
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
［14］Maraschin SF，Caspers M，Potokina E，et al． cDNA array analysis of
stress-induced gene expression in barley androgenesis． Physiol
Plantarum，2006，127:535-550．
［15］Boutilier K，Fiers M，Liu CM，et al． Biochemical and molecular as-
pects of haploid embryogenesis． In:Haploids in Crop improvement
Ⅱ-Biotechnology in Agriculture and Forestry［M］． Palmer CE，
Leller WA，Kashe KJ(eds)． Germany:Springer-verlag，2005，56:
73-95．
［16］Maraschin SF，de Priester W，Spaink HP，et al． Androgenic switch:
an example of plant embryogenesis from the male gametophyte per-
spective． J Exp Bot，2005，56:1711-1726．
［17］姜立荣，刘凡，李怀军，等．大白菜小孢子胚状体发生早期的超
微结构研究．北京农业科学，1996，16(3) :28-31．
［18］ Fan Z，Armstrong KC，Keller WA． Development of microspores in
vivo and in vitro in Brassica napus L． Protoplasma，1988，147:
191-199．
［19］Telmer CA，Newcomb W，Simmonds DH． Microspore development
in Brassica napus and the effect of high temperature on division in
vivo and in vitro． Protoplasma，1993，172:154-165．
［20］Aionesei T，Touraev A，Heberle-Bors E． Pathways to microspore em-
bryogenesis［M］． In:Haploids in Crop improvementⅡ-Biotechnolo-
gy in Agriculture and Forestry． Palmer CE，Leller WA，Kashe KJ
(eds)． Germany:Springer-verlag，2005，56:11-34．
［21］ Zhou WJ，Hagbery P，Tang GX． Increasing embryogenesis and
doubleing efficiency by immediatecolchicine treatment of isolated
microspores in spring Brassica napus． Euphytica，2002，128:27-34．
［22］Barinova J，Clement C，Marting L，et al． Regulation of developmen-
tal pathways in cultured microspores of tobacco and snapdragon by
medium pH． Planta，2004，219:141-146．
［23］Garrido D，Vicente O，Heberle-Bors E，et al． Cellular changes dur-
ing the acquisition of embryogenic potential in isolated pollen grains
of Nicotiana tabacum． Protoplasma，1995，186:220-230．
［24］Simmonds DH，Keller WA． Significance of preprophase bands of mi-
crotubules in the induction of microspore embryogenesis of Brassica
napus． Planta，1999，208:383-391．
［25］Maraschin SF，Vennik M，Lamers GEM，et al． Time-lapse tracking
of barley androgenesis reveals positiondetermined cell death within
pro-embryos． Planta，2005，220:531-540．
［26］Telmer CA，Newcomb W，Simmonds DH． Cellular changes during
heat shock induction and embryo development of cultured micro-
spores of Brassica napus cv． Topas． Protoplasma，1995，185:
106-112．
［27］Obert B，Szabó L，Mitykó J，et al． Morphological events in cultures
of mechanically isolated maize microspores． In Vitro Cell Dev
Plant，2005，41:537-547．
［28］Hause B，Hause G，Pechan P，et al． Cytoskeletal changes and in-
duction of embryogenesis in microspore and pollen cultures of Bas-
sica napus L． Cell Bio Inter，1993，17:153-168．
［29］ Zhao JP，Simmonds DH，Newcomb W． Induction of embryogenesis
with colchicines instead of heat in microspores of Brassica napus L．
cv． Topas． Planta，1996，198:433-439．
［30］Zaki MAM，Dickinson HG． Microspore-derived embryos in Brassi-
ca:the significance of division symmetry in pollen mitosis I to em-
bryogenic development． Sex Plant Rep，1991，4:48-55．
［31］Wallin M，Stromberg E． Cold-stable and cold-adapted microtubules．
Int Rev Cytol，1995，157:1-31．
［32］Binarova P，Hause G，Cenklóva V，et al． A short severe heat shock
is required to induce embryogenesis in late bicellular pollen of
Brassica napus L． Sex Plant Reprod，1997，10:200-208．
［33］Sunderland N，Wicks FM． Embryoid formation in pollen grains of
Nicotiana tabacum． J Exp Bot，1971，22:213-226．
［34］ Sunderland N． Pollen and anther． In:Plant tissue and cell culture
［M］． Street HE(ed)． Berkeley:University of California Press，
1973:205-239．
［35］Reynolds TL． A cytological analysis of microspores of triticum aesti-
vum(poaceae)during normal ontogeny and induced embryogenic
development． Am J Bot，1993，80:569-576．
［36］Sunderland N，Collins GB，Dunwell JM． The role of nuclear fusion
in pollen embryogenesis of Datura innoxia Mill． Planta，1974，117:
227-241．
［37］Kasha KJ，Simion E，Oro R，et al． An improved in vitro technique
for isolated microspore culture of barley． Euphytica，2001，120:379-
385．
［38］Zhu ZQ，Sun JS，Wang JJ． Cytological investigation on androgenesis
of Triticum aestivum． Acta Bot Sin，1978，20:6-12．
［39］Raghavan V． Role of the generative cell in androgenesis in hen-
bane． Science，1976，191:388-389．
［40］ Jürgens G． Apical-basal pattern formation in Arabidopsis embryogen-
esis． EMBO J，2001，20:3609-3616．
［41］Friml J，Vieten A，Sauer M，et al． Efflux-dependent auxin gradients
establish the apical-basal axis of Arabidopsis． Nature，2003，426:
147-153．
［42］Yeung EC． The canola microspore-derived embryo as a model sys-
tem to study developmental processes in plants． J Plant Biol，2002，
45:119-133．
［43］Zarsky V，Rihova L，Tupy J． Biochemical and cytological changes in
young tobacco pollen during in vitro starvation in relation to pollen
embryogenesis［M］． In:Nijkamp HJJ，Progress in Plant Cellular
and Molecular Biology． Van der Plas LHW，Van Aartrijk J(eds)．
Kluwer，Dordrecht，Boston，London:1990:228-233．
［44］Garrido D，Eller N，Heberle-Bors E，et al． De novo transcription of
specific mRNAs during the induction of tobacco pollen embryogene-
sis． Sex Plant Reprod，1993，6:40-45．
［45］Hoekstra S，van Bergen S，van Brouwershaven IR，et al． Androgene-
41
2011 年第 10 期 袁素霞等:植物游离小孢子胚胎形成机理
sis in Hordeum vulgare L．:effects of mannitol，calcium and abscisic
acid on anther pretreatment． Plant Sci，1997，126:211-218．
［46］Reynolds TL． Effects of calcium on embryogenic induction and the
accumulation of abscisic acid，and an early cysteine-labeled metal-
lothionein gene in androgenic microspores of Triticum aestivum．
Plant Sci，2000，150:201-207．
［47］ Macnicol PK，Jacobsen JV． Regulation of alcohol dehydrogenase
gene expression in barley aleurone by giberellin and abscisic acid．
Physiol Plantarum，2001，111:533-539．
［48］Kyo M，Miyatake H，Mamezuka K，et al． Cloning of cDNA encoding
NtPEc，a marker protein for the embryogenic differentiation of im-
mature tobacco pollen grains cultured in vitro． Plant Cell Physiol，
2000，41:129-137．
［49］ Sabehat A，Lurie S，Weiss D． Expression of small heat-shock pro-
teins at low temperatures:a possible role in protecting against chill-
ing injuries． Plant Physiol，1998，117:651-658．
［50］Zarsky V，Garrido D，Eller N，et al． The expression of a small heat
shock gene is activated during induction of tobacco pollen embryo-
genesis by starvation． Plant Cell Environ，1995，18:139-147．
［51］Gagliardi D，Breton C，Chaboud A，et al． Expression of heat shock
factor and heat shock protein 70 genes during maize pollen develop-
ment． Plant Mol Bio，1995，29:841-856．
［52］ Seguí-Simarro JM，Testillano PS，Risueno MC． Hsp70 and Hsp90
change their expression and subcellular localization after microspore
embryogenesis induction in Brassica napus L． J Struct Biol，2003，
142(3) :379-391．
［53］Testillano PS，Coronado MJ，Seguí JM，et al． Defined nuclear chan-
ges accompany the reprogramming of the microspore to embryogene-
sis． J Struct Biol，2000，129:223-232．
［54］ Zhao JP，Newcomb W，Simmonds D． Heat-shock proteins 70 kDa
and 19 kDa are not required for induction of embryogenesis of Bras-
sica napus L． cv． topas microspores． Plant Cell Physiol，2003，44
(12) :1417-1421．
［55］Vrienten PL，Nakamura T，Kasha KJ． Characterization of cDNAs ex-
pressed in the early stages of microspore embryogenesis in barley
(Hordeum vulgare)L． Plant Mol Biol，1999，41:455-463．
［56］Tsuwamoto R，Fukuoka H，Takahata Y． Identification and character-
ization of genes expressed in early embryogenesis from microspores
of Brassica napus． Planta，2007，225:641-652．
［57］Sossountzov L，Ruiz-Avila L，Vignols F，et al． Spatial and temporal
expression of a maize lipid transfer protein gene． Plant Cell，1991，
3:923-933．
［58］Vrienten PL，Nakamura T，Kasha KJ． Characterization of cDNAs ex-
pressed in the early stages of microspore embryogenesis in barley
(Hordeum vulgare)L． Plant Mol Biol，1999，41:455-463．
［59］Datta R，Chamusco KC，Chourey PS． Starch biosynthesis during pol-
len maturation is associated with altered patterns of gene expression
in maize． Plant Physiol，2002，130:1645-1656．
［60］Kyo M，Harada H． Specific phosphoproteins in the initial period of
tobacco pollen embryogenesis． Planta，1990，182:58-63．
［61］Pechan PM，Bartels D，Brown DCW，et al． Messenger-RNA and pro-
tein changes associated with induction of Bassica microspore embry-
ogenesis． Planta，1991，184:161-165．
［62］ Harada H，Kyo M，Immamura J． Induction of embryogenesis and
regulation of the developmental pathway in immature pollen of Nic-
otiana species． Current Topics in Developmental Biology，1986，20:
397-408．
［63］Yu F，Park S，Rodermel SR． The Arabidopsis FtsH metalloprotease
gene family:interchangeability of subunits in chloroplast oligomeric
complexes． Plant J，2004，37:864-876．
［64］Chan J，Pauls KP． Brassica napus Rop GTPases and their expression
in microspore cultures． Planta，2007，225(2) :469-484．
［65］Matsubayashi Y，Sakagami Y． Phytosulfokine，sulfated peptides that
induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus offici-
nalis L． Proc Natl Acad Sci USA，1996，23(15) :7623-7627．
［66］Matsubayashi Y，Takagi L，Sakagami Y． Phytosulfokine-alpha，a sul-
fated pentapeptide，stimulates the proliferation of rice cells by
means of specific high- and low-affinity binding sites． Proc Natl
Acad Sci USA，1997，94(24) :13357-13362．
［67］Hanai H，Matsuno T，Yamamoto M，et al． A secreted peptide growth
factor，phytosulfokine，acting as a stimulatory factor of carrot somatic
embryo formation． Plant Cell Physiol，2000，41:27-32．
［68］ Boutilier K，Offringa R，Sharma VK，et al． Ectopic expression of
BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryogenic
growth． Plant Cell，2002，14:1737-1749．
［69］Perry SE，Lehti MD，Fernandez DE． The MADS-domain protein AG-
AMOUS-like 15 accumulates in embryonic tissues with diverse ori-
gins． Plant Physiol，1999，120:121-129．
［70］Custers JBM，Oldenhof MT，Schrauwen JAM，et al． Analysis of mi-
crospore-specific promoters in tobacco． Plant Mol Biol，1997，35:
689-699．
［71］Malik MR，Wang F，Dirpaul JM，et al． Transcript profiling and iden-
tification of molecular markers for early microspore embryogenesis
in Brassica napus． Plant Physiol，2007，144:134-154．
［72］Schmidt EDL，Guzzo F，Toonen MAJ，et al． A leucine-rich repeat
containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent
to form embryos． Development，1997，124:2049-2062．
［73］Hecht V，Vielle-Calzada JP，Hartog MV，et al． The Arabidopsis SO-
MATIC EMBRYOGENSIS RECEPTOR KINASE 1 gene is ex-
pressed in developing ovules and embryos and enhances embryo-
genic competence in culture． Plant Physiol，2001，127 (3) :
803-816．
［74］Baudino S，Hansen H，Brettschneider R，et al． Molecular characteri-
sation of two novel maize LRR receptor-like kinases，which belong
51
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
to the SERK gene family． Planta，2001，213:1-10．
［75］Toonen MA，Verhees JA，Schmidt EDL，et al． AtLTP1 luciferase ex-
pression during carrot somatic embryogenesis． Plant J，1997，12:
1213-1221．
［76］Massonneau A，Coronado MJ，Audran A，et al． Multicellular struc-
tures developing during maize microspore culture express endo-
sperm and embryp-specific genes and show different embryogenic
potentialities． Eur J Cell Biol，2005，84:663-675．
［77］Paire A，Devaux P，Lafitte C，et al． Proteins produced by barley mi-
crospores and their derived androgenic structures promote in vitro
zygotic maize embryo formation． Plant Cell Tiss Org Cult，2003，73:
167-176．
［78］Borderies G，Béchec M，Rossignol M，et al． Characterization of pro-
teins secreted during maize microspore culture:arabinogalactan pro-
teins(AGPs)stimulate embryo development． Eur J Cell Bio，2004，
83:205-212．
［79］Maraschin S de F，Lamers GEM，de Pater BS． 14-3-3 isoforms and
pattern formation during barley microspore embryogenesis． J Exp
Bot，2003，54(384) :1033-1043．
［80］Cock JM，McCormick S． A large family of genes that share homology
with CLAVATA3． Plant Physiol，2001，126:939-942．
［81］Hu T，Kasha KJ． A cytological study of pretreatments used to im-
prove isolated microspores cultures of wheat(Triticum aestivum L．)
cv． Chris Genome，1999，42:432-441．
(责任编辑 狄艳红)
61