全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊 polyUBQ基因的
电子克隆及其序列分析
强承魁1 周保亚1 凤舞剑 1 赵虎2 苏新林 2 王胜永 1
( 1徐州生物工程职业技术学院农林工程系,徐州 221006; 2徐州生物工程职业技术学院教务处,徐州 221006)
摘 要: 针对具有选择性蛋白质降解功能的泛素在调控昆虫生长发育过程中的重要作用, 探讨埃及伊蚊、冈比亚按蚊
和致倦库蚊基因组中 po lyUBQ基因的有关生物信息。采用电子克隆的方法钓取 3种蚊虫基因组中 po lyUBQ基因序列,分析其
特征、分子进化关系、遗传多态性和密码子偏爱性。结果显示,成功获取埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊 po lyUBQ基因序列,
命名为 A apo lyUBQ ( GenBank登录号: AAGE02005963)、Agpo lyUBQ ( ABKP02009650)和 Cqpo lyUBQ ( AAWU01023041 ), 分别
编码 1 065个、218个和 533个氨基酸残基, 各具 14个、3个和 7个泛素单体, A apo lyUBQ、Agpo lyUBQ和 Cqpo lyUBQ蛋白二级
结构主要元件是延伸带和无规则卷曲, Leu、Ile和 Lys是构成 3种蛋白的主要氨基酸, 亚细胞主要定位于细胞质和细胞核,无
前导肽、信号肽和跨膜结构域, 除 Agpo lyUBQ蛋白外均呈碱性; 3种基因序列的同源性较高 ( 838% - 882% )且遗传距离较
近 ( 0129- 0 187) ;检出 135个多态位点,共生成 3个单倍型, 单倍型多样性 ( H d= 1000)、平均核苷酸差异数 ( K = 96 000)、
核苷酸多样性 ( P i= 0 14679)、SS核苷酸多样性均值 ( P i( s) = 057731)、NSS核苷酸多样性均值 ( P i( a) = 001627)、密码子有
效值 ( ENC = 29432- 34321< 61)、偏爱指标 ( CBI= 0672- 0750> 0)和 2检验计算 ( 2 = 0 977- 1 092)显示 3种 po lyUBQ
基因间遗传多样性较丰富且呈现较强的密码子偏爱性。Aapo lyUBQ、Agpo lyUBQ和 Cqpo lyUBQ基因的成功电子克隆及丰富
的遗传多态性和较强的密码子偏爱性可为进一步开展其分子进化机制、表达特性和昆虫病毒侵染关系等方面的试验研究提
供基础资料。
关键词: 埃及伊蚊 冈比亚按蚊 致倦库蚊 po lyUBQ基因 电子克隆
收稿日期: 20101009
基金项目:徐州生物工程职业技术学院院级科研课题 ( 2010B07)
作者简介:强承魁,男,博士,副研究员,研究方向:昆虫生化与分子生物学; Em ai:l xzqck@ yahoo. com. cn
通讯作者:王胜永,男,硕士,副教授,研究方向:果树分子育种学; Em ai:l w syxzsw@ s ina. com
In silico Cloning and Sequence Analysis of polyUBQ Gene in
Aedes aegypti, Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus
Q iang Chengku i
1 Zhou Baoya1 FengW ujian1 ZhaoHu2 Su X inlin2 W ang Shengyong1
(
1
D epartm ent of Agr iculture and Landscape Engineering, Xuzhou Bioengineering TechnicalCollege, Xuzhou 221006;
2
Off ice of T eaching Affairs, Xuzhou B ioengineering T echnical College, Xuzhou 221006)
Abstrac:t Accord ing to the im portant function of se lective prote in deg rada tion of ub iqu itin w ith regu lating insect grow th and deve l
opm en,t re lative bio in fo rma tion o f po lyUBQ gene in Aedes aegyp ti, Anopheles gamb iae and Cu lex quinquefasciatus genom e were investiga
ted. The coding sequence o f po lyUBQ genes from three k inds o fm osqu itoes genome were found by in silico c lon ing me thod, then the ir se
quence charac teristics, mo lecular evo lution, genetic po lymo rph ism and code b ias were analyzed. Results showed that po lyUBQ gene se
quences ofA edes aegyp ti, Anopheles gam biae and Culex quinquefasciatus named AapolyUBQ ( GenBank Accession No. AAGE02005963),
AgpolyUBQ ( ABKP02009650) and Cqpo lyUBQ ( AAWU01023041) were obta ined, wh ich cou ld code 1 065, 218 and 533 am ino ac ids
w ith 14, 3 and 7 repea ts of ub iqu itin cod ing un it, respectively. Them a in components of the predicated secondary structures o f three pro
te ins we re extended strands and random co ils, the pr inc iple am ino acids of three prote ins wh ich consisted m ainly o f Leu, I le and Ly s.
Subcells w ere ma in ly lo ca ted in cy top lasm and cell nuc leus, but leade r peptide, signal peptide and transm emb rane doam in w ere not
found. Aapo lyUBQ and Cqpo lyUBQ w ere character istica lly basic accept fo rAgpo lyUBQ. AapolyUBQ, Agpo lyUBQ and Cqpo lyUBQ
2011年第 2期 强承魁等:埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊 po lyUBQ基因的电子克隆及其序列分析
gene sequences showed h igh identity( 83. 8% - 88. 2% ) and short g enetic distances( 0. 129 - 0. 187). During the genetic diversity a
nalysis, to tal 153 po lym orphic sites w ere detected from three po lyUBQ gene sequences and 3 hapo lo types we re so rted. Abundan t g enetic
d iversity and strong codon usage b ias w ere found by haplotype d iversity (H d= 1. 000), average num ber o f nuc leo tide diffe rence ( K =
96. 000), nucleo tide d iversity ( P i= 0. 14679), nucleotide d iversity of synonm yous s ites( P i( s) = 0. 57731), nuc leo tide diversity o f non
synonmyous s ites( P i( a) = 0. 01627), e ffective num be r of codons( ENC = 29. 432- 34. 321 < 61), codon bias index( CB I= 0. 672 -
0. 750> 0) and sca led Ch isquare( 2 = 0. 977- 1. 092). The results o f th is investigation m igh t prov ide som e e lem ents data for further
stud ies on the evo lutionary mechan ism, expressed character istics and insect v ira l infection of A apo lyUBQ, Agpo lyUBQ and Cqpo ly
UBQ genes.
Key words: A edes aegyp ti Anopheles gam bia Cu lex quinquefasciatus po lyUBQ gene In silico
泛素是首次从牛胸腺中分离出的一种由 76个
氨基酸残基构成的小分子热休克蛋白, 广泛分布于
真核生物且极其保守 [ 1 - 3 ]。根据编码泛素前体蛋白
质的差异可分为多聚泛素基因 ( po lyub iqu it in gene)
和泛素延伸基因 ( ub iqu itin ex tension gene) [ 4]。其中
前者多在分生组织、微管组织和衰老组织中被热激
和创伤等诱导表达,其表达产物主要参与 ATP依赖
性的泛素 - 蛋白水解酶复合体通路 ( ub iqu it inpro
teasom es pathw ay, UPP)高效且高度选择性地对细胞
内某些蛋白质进行部分或完全降解 [ 5- 8 ]。其中泛素
在此降解过程中可共价地结合于这些蛋白质作为生
物降解标签, 实现对多种代谢过程的内在生理调
节 [ 9]。因此, 自 20世纪 80年代以来, 泛素及 UPP
途径一直是生物学界的研究热点,其调控机制、信号
转导和生理功能等将成为昆虫泛素研究的重点基础
领域 [ 10, 11]。
多种媒介生物全基因组测序及其注释工作相继
完成,为开展基因组水平研究提供了条件。国内外
现已陆续报道了烟草天蛾 (Manduca sex ta ) [ 12]、黑腹
果蝇 (Drosoph ila melanogaster ) [ 13]和斜纹夜蛾 ( Spo
dop tera litura )
[ 14]等十几种昆虫泛素基因序列。研
究发现,在昆虫中肠、脂肪体、马氏管和飞行肌等组
织中高水平表达,说明该基因在调控昆虫生命活动
过程中具重要作用 [ 13 ]。但有关埃及伊蚊 (Aedes ae
gyp ti)、冈比亚按蚊 (Anopheles gambiae )和致倦库蚊
(Culex quinquefasciatus)多聚泛素基因 ( po lyUBQ)生
物信息学分析的相关报道鲜见。因此, 本研究基于
基因组数据库和生物信息学手段对这 3种重要媒介
生物 po lyUBQ基因进行电子克隆和序列分析, 旨在
为进一步研究该基因的生理功能、分子进化以及与
昆虫病毒侵染关系等方面提供基础资料。
1 材料与方法
1. 1 材料
昆虫 po lyUBQ基因序列源于 NCB I网站 GenBank
数据库:黑腹果蝇 D. melanogaster ( GenBank登录号:
M 37604,后同 )、茶足柄瘤蚜茧蜂 Ly siphlebus testaceipes
(AY961502)、地中海实蝇 Ceratitis cap itata ( Y10639)、
埃及伊蚊 A. aegyp ti ( GU179018)、家蚕 Bombyx mori
( NM _001043374)、冈比亚按蚊 A. gambiae (L 36067)、
大蜡螟 Galleriam ellonella ( AF321440)、赤拟谷盗 Tri
bolium castaneum ( AF506022)、致倦库蚊 C. qu inquefas
ciatus( XM _001863470)和烟草天蛾M. sex ta ( U61404)
等。埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊基因组数据由
NCB I网站下载,相关分析和预测软件、服务器及数据
库均为 Internet免费资源。
1. 2 方法
采用 B ioE dit软件比对 G enB ank中下载的 10种
昆虫 po lyUBQ基因序列, 选取共有片段作为种子序
列, 基于埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊站点进行
Genom ic BLAST钓取 po lyUBQ基因序列。DNAS tar
软件分析氨基酸残基数及比例、分子量和理论等电
点, TargetP 1. 1 Server分析前导肽 ( http: / /www.
cbs. dtu. dk /serv ices/Targe tP / ) , S igna lP 3. 0 Server
分析信号肽 ( http: / /www. cbs. dtu. dk /serv ices /S ig
nalP / ) , TMHMM 2. 0 Server分析跨膜结构域 ( ht
tp: / /www. cbs. dtu. dk /serv ices /TMHMM /), NetPhos
2. 0 Server分析翻译后磷酸化修饰位点 ( http: / /
www. cbs. dtu. dk /services /N etPhos / ), NCB I链接的
CDD分析保守结构域 ( http: / /www. ncb.i nlm. n ih.
gov / cdd) , SOPMA分析二级结构 ( http: / /npsapbi.l
ibcp. fr /cg i- bin /npsa_automa.t p?l page= npsa_ sop
ma. htm l) , PSORT分析亚细胞定位 ( http: / /psor.t im s.
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
utokyo. ac. jp / ), C lustalX ( version 1. 83)软件进行多
序列联配并选择 MEGA ( Version 4. 0)软件构建系统
发育树, DanSP (V ersion 4. 0)软件分析遗传多态性和
密码子偏爱性。
2 结果
2. 1 Aapo lyUBQ、AgpolyUBQ和 CqpolyUBQ基因
电子克隆及序列特征
基于电子克隆的策略,经 G enom icBLAST调取出
序列长度分别为 82 169 bp、45 08 bp和 63 333 bp的
埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊 po lyUBQ基因, 命
名 为 Aapo lyUBQ ( AAGE02005963 )、Agpo lyUBQ
( ABKP02009650)和 Cqpo lyUBQ ( AAWU 01023041)。
开放阅读框 ( ORF )分别位于 53 786 - 56 982 bp、
3 855- 4 507 bp和 55 127- 56 728 bp, 推测编码 1
065个、218个和 533个氨基酸残基。3种 po lyUBQ蛋
白的理论等电点介于 5. 94- 7. 60, 说明除 Agpo ly
UBQ蛋白外均呈碱性。AapolyUBQ氨基酸组成中碱
性氨基酸、疏水氨基酸和带电氨基酸比例均最大
( 1779%、3089%和 3707% ),而酸性氨基酸和亲水
氨基酸所占比例最大者则为 AgpolyUBQ 蛋白
( 1650%和 2603% ) (表 1)。Leu、Ile和 Lys是构成
埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊 po lyUBQ蛋白的主
要氨基酸。
表 1 AapolyUBQ、Agpo lyUBQ和 Cqpo lyUBQ基因的核酸序列及其氨基酸序列组分和理化性质
基因 分子量 ( kD) 等电点 氨基酸残基比例 (% )酸性氨基酸 碱性氨基酸 亲水氨基酸 疏水氨基酸 带电氨基酸 主要氨基酸
Aapo lyUBQ 119. 80 7. 60 15. 78 17. 79 24. 99 30. 89 37. 07 Leu, Ile, Lys, Th r
Agpo lyUBQ 245. 42 5. 94 16. 50 17. 33 26. 03 30. 07 36. 95 Lys, Leu, Ile, G lu
C qpo lyUBQ 599. 59 7. 52 15. 76 17. 77 25. 05 30. 86 37. 04 Leu, Lys, Ile, G lu
采用 TargetP1. 1 Server、S ignalP 3. 0 Server和
TMHMM 2. 0 Server在线程序均未发现 A apo lyUBQ、
Agpo lyUBQ和 Cqpo lyUBQ蛋白具有前导肽、信号
肽和跨膜结构域。经 NCB I链接的 CDD程序预测
出上述 3种 po lyUBQ氨基酸序列分别具有 14、3和
7个保守结构域的泛素家族蛋白, 分别具有 14个、3
个和 7个泛素单体。基于 NetPhos 2. 0 Server分析
出 A apo lyUBQ中丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点数均
为 14个, 分别位于第 57、133、209、285、361、437、
513、589、665、741、817、893、969和 1045与 22、98、
174、250、326、402、478、554、630、706、782、858、934
和 1010位氨基酸位点; Agpo lyUBQ中两种磷酸化
位点数均为 3个,分别位于第 57、133和 209与 22、
98和 174位氨基酸位点; Cqpo lyUBQ中两种磷酸化
位点数均为 7个, 分别位于第 57、133、209、285、361、
437和 513与 22、98、174、250、326、402和 478位氨
基酸位点。由表 2可知, 延伸带和无规则卷曲构成
AapolyUBQ、Agpo lyUBQ和 CqpolyUBQ蛋白二级
结构的主要元件, 该蛋白主要定位于细胞质和细
胞核。
表 2 Aapo lyUBQ、A gpolyUBQ和 CqpolyUBQ基因的氨基酸序列二级结构和亚细胞定位
基因 二级结构 (% )螺旋 延伸带 转角 无规则卷曲
亚细胞定位 (% )
细胞质 细胞核 线粒体 细胞质膜
Aapo lyUBQ 19. 09 31. 55 14. 37 37. 0 43. 5 34. 8 17. 4 4. 3
Agpo lyUBQ 16. 51 33. 94 11. 93 37. 0 52. 2 26. 1 17. 4 4. 3
C qpo lyUBQ 19. 70 29. 27 13. 70 37. 34 47. 8 30. 4 21. 7 0
2. 2 Aapo lyUBQ、AgpolyUBQ和 CqpolyUBQ基因
多序列联配及系统发育树
选择鳞翅目家蚕 po lyUBQ基因 ( Bmpo lyUBQ,
AADK01019318)作为外群, 根据 C lustalX ( version
183)软件联配的 Aapo lyUBQ、AgpolyUBQ和 Cq
po lyUBQ基因序列, 结合其单倍型间的遗传距离经
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2011年第 2期 强承魁等:埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊 po lyUBQ基因的电子克隆及其序列分析
MEGA( Version 4. 0)软件中 Neighbo rJo ining法构建
出分子系统发育树 (图 1)。结果 (表 3 )显示, Ag
polyUBQ和 Cqpo lyUBQ基因序列首先聚于同一分
支,且同源性较高 ( 88. 2% )和相对遗传距离很近 ( 0.
129) ,表明同属蚊科的按蚊亚科冈比亚按蚊与库蚊亚
科致倦库蚊中 po lyUBQ基因间进化关系较近。再与
库蚊亚科埃及伊蚊聚在一起, 且同源性相对偏低
( 838%和 84. 1% )和遗传距离相对偏远 ( 0187和
0181),最后与外群鳞翅目家蚕聚集。基于埃及伊
蚊、冈比亚按蚊、致倦库蚊和家蚕 polyUBQ基因序列
的系统发育关系 (图 1) ,推测该基因可作为昆虫种上
遗传分化研究的重要候选标记基因。
表 3 Aapo lyUBQ、AgpolyUBQ和 CqpolyUBQ
基因序列间的相对遗传距离和同源性 (% )
基因 A apolyUBQ Agpo lyUBQ CqpolyUBQ
AapolyUBQ * * * * 84. 1 83. 8
AgpolyUBQ 0. 181 * * * * 88. 2
CqpolyUBQ 0. 187 0. 129 * * * *
* 对角线左下面为相对遗传距离, * 对角线右上面为同源性
图 1 Aapo lyUBQ、A gpolyUBQ和 CqpolyUBQ基因序列的分子系统发育树
2. 3 Aapo lyUBQ、AgpolyUBQ和 CqpolyUBQ基因
遗传多态性及密码子偏爱性
A apo lyUBQ、A gpo lyUBQ和 CqpolyUBQ 基因
序列经 DnaSP(V ersion 4. 0)软件分析出总位点 684
个,多态位点 135个,突变总数 153个, 不变位点、可
变位点和缺失位点分别为 519个、135个和 30个,
其中单一多态位点 135个 (占 19. 74% )和简约多态
位点 0个 ( 0% )。序列比对发现 3条 po lyUBQ基因
序列中具 3个单倍型, 单倍型多样性 ( Hd)、平均核
苷酸差异数 ( K )和核苷酸多样性 ( P i)分别为
1000、96. 000和 014679, 表明序列间遗传变异较
丰富。所有突变位点经 Fu和 L i检验 ( Fu和 Lis
D= - 0. 22741, Fu和 L is F= - 0. 37432)未见显著
差异 (P > 0. 10), 说明全部变异符合选择中性。
A apo lyUBQ、A gpo lyUBQ和 CqpolyUBQ 基因
序列同义替换位点数介于 151. 50- 153. 33, 同义替
换核苷酸多样性均值 Pi( s)为 0. 57731; 非同义替换
位点数介于 500. 67- 502. 50, 非同义替换核苷酸多
样性均值 Pi( a)为 0. 01627(表 4)。其中 Aapo ly
UBQ基因序列的非同义替换位点数高于 Agpo ly
UBQ和 CqpolyUBQ基因序列, 说明其对应编码区
的非同义替换频率相对较高。3条基因序列的密码
子有效值均低于 61,偏爱指标均大于 0,并结合 2检
验计算未校正的 2值 (表 4), 可见上述编码基因均
具较强的密码子偏爱性。
表 4 Aapo lyUBQ、A gpolyUBQ和 CqpolyUBQ基因
序列间的同义替换位点数、非同义替换位点数、
密码子有效值、偏爱指标和 2值
多聚泛素
基因
同义替换
位点数
非同义替
换位点数
密码子
有效值
偏爱
指标 2值
AapolyUBQ 151. 50 502. 50 34. 321 0. 672 0. 977
AgpolyUBQ 151. 67 502. 33 29. 432 0. 752 1. 092
CqpolyUBQ 153. 33 500. 67 33. 276 0. 680 1. 014
3 讨论
基于生物信息学中电子克隆的策略和 GenBank
中埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊基因组信息成
功获取其 polyUBQ基因序列, 分别命名为 A apo ly
UBQ、Agpo lyUBQ和 Cqpo lyUBQ, 推测编码 1 065
个、218个和 533个氨基酸残基。CDD程序分析显
示, 上述 3种 polyUBQ氨基酸序列分别具 14个、3
个和 7个泛素单体,可能为成串且无内含子插入组
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
成的 po lyUBQ蛋白。此现象与 Bond等 [ 15]报道的鸡
胚成纤维细胞中该基因编码区常无内含子且以 7个
首尾相连的泛素单体一致, 但有别于 polyUBQ基因
一般由 15- 52个随机的 228 bp泛素单体基因首尾
相接而成的结论, 对此有待试验确证。结果 (表 3)
显示, Aapo lyUBQ、Agpo lyUBQ和 CqpolyUBQ基因
序列间同源性和遗传距离分别介于 838% - 882%
和 0. 129 - 0. 187, 此结果符合 G lickm an等 [ 16]及
Sharp等 [ 17]报道的真核生物中泛素一级结构高度相
似,且每种生物 po lyUBQ基因各单元间均编码相同
的氨基酸序列。由此可推测泛素单体基因中不同的
碱基序列可能归属 po lyUBQ基因指纹基序, 借助胞
内外信息剪切和修饰来形成多聚或单体泛素执行
UPP途径。
遗传多态性的传统研究方法是基于不同基因型
个体经电泳获取的蛋白分子量差异, 再结合等位基
因频率来分析该基因遗传变异情况, 而本研究选择
生物信息学的方法对所选取序列中不同核苷酸进行
统计和分析,但两者均基于不同的核苷酸转录翻译
得到不同的氨基酸这一生物学理论。本研究发现,
A apo lyUBQ、Agpo lyUBQ和 Cqpo lyUBQ基因序列
间具高度多态性 ( 135个多态位点 )和丰富的单倍型
( 3个 )。Hershko等 [ 8 ]指出, 特定基因高度多态性
的内因一般为自然选择, 表明这些基因在长期的自
然进化过程中借助 UPP途径参与机体免疫性调控
等方面呈现较强的遗传适应性。如金丰良等 [ 18 ]报
道家蝇泛素抗体不仅可与家蝇泛素融合蛋白呈阳性
反应, 还能与斜纹夜蛾泛素蛋白呈阳性反应,说明该
表达的蛋白质保持原有泛素的免疫原性。另根据
A apo lyUBQ、Agpo lyUBQ和 Cqpo lyUBQ基因序列
间多态位点数、单倍型多样性、平均核苷酸多样性和
核苷酸多样性 (表 4) , 可判定这 3种 polyUBQ基因
间具较丰富的遗传多样性,推测可能成为调控机体
免疫细胞信号转导领域研究的重要候选标记
基因。
研究另发现, A apo lyUBQ、Agpo lyUBQ和 Cq
po lyUBQ基因非同义替换位点数均高于 3倍以上的
同义替换位点数 (表 2), 结合 Guo[ 19]报道非同义突
变利于编码蛋白生理功能发挥而逐渐被固定于物
种,可见上述基因在进化过程中可能受到正选择影
响, 符合中性学说即不会因 polyUBQ基因突变而被
自然选择所淘汰。表 4显示埃及伊蚊、冈比亚按蚊
和致倦库蚊中呈现较多的密码子偏爱现象, 说明
po lyUB基因在编码蛋白时具密码子偏爱。这与
Ghosh等 [ 20]报道源于不同物种或同一物种的基因
在编码特定蛋白质过程中均具密码子偏爱性影响一
致, 此可为 po lyUB基因的克隆和表达提供理论依
据, 但该现象在物种进化中的作用机制尚无定论。
综上所述,基于生物信息学可全面解析 po lyUB
基因中诸多突变位点是否与机体 UPP途径介导的
蛋白选择性降解和细胞免疫性调控机制有关, 以及
该基因在埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊不同发
育阶段、不同组织或器官及逆境胁迫过程中的表达
机理研究提供基础信息。
参 考 文 献
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