全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
内蒙古碱湖中紫色非硫光合细菌的分离和鉴定
杨慧 1 刘芳 1, 2 　王敏 1 　孙军德 2 　孙建光 3 　高俊莲 1
(1北京市农林科学院 北京农业生物技术研究中心 ,北京 100097; 2沈阳农业大学土地与环境学院 ,沈阳 110161;
3中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　从内蒙古碱湖水样中分离得到一株紫色非硫光合细菌 ,命名为 JH126。对该菌株进行了形态学观察、生理生化
鉴定、活细胞吸收光谱以及 16S rDNA序列分析。16S rDNA序列分析结果表明该菌株与沼泽红假单胞菌的 16S rDNA序列同
源性高达 99% ,结合形态特征和生理生化特性以及活细胞吸收光谱特征等 ,确定菌株 JH126在分类地位上属于沼泽红假单胞
菌 (Rhodopseudom onas pa lustris)。
关键词 : 　内蒙古碱湖 紫色非硫光合细菌 分离 鉴定
Isola tion and Identif ication of Purple Nonsulfer Photosynthetic
Bacter ia from Soda Lake in Inner M ongolia
Yang Hui1 L iu Fang1, 2 W ang M in 1 Sun Junde2
Sun J ianguang 3 　Gao Junlian1
(1 Agro2B iotechnology R esearch Center, B eijing Academ y of Agriculture and Forestry, B eijing 100097;
2 College of Land and Environm ent, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161;
3 Institu te of Agricultural R esources and Regional Planning, Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　One purp le non2sulfur bacterial strain isolated from the soda lake in Inner Mongolia was named JH126. In order to i2
dentify the strain, the morphological characteristic, physiological and biochem ical p roperties and 16S rDNA sequence analysis were per2
formed. The results showed that the strain shares 98% sequence identity with the type strain ATCC17001 of Rhodopseudom onas pa lus2
tris. Combined with the results of morphological characteristic, absorp tion spectrum scanning of live cell and physiological and biochem i2
cal p roperties, the strain was identified as Rhodopseudom onas palustris.
Key wo rds: 　Soda lake of inner mongolia Purp le nonsulfer photosynthetic bacteria　 Isolation　 Identification
收稿日期 : 2009208204
作者简介 : 杨慧 ,女 ,助理研究员 ,研究方向 : 微生物资源利用研究
通讯作者 :高俊莲 ,女 ,博士 ,研究员 , E2mail: gaojunlian@ baafs. net. cn;孙建光 ,男 ,博士 ,副研究员 , E2mail: jgsun@ caas. ac. cn　　不产氧光合细菌是地球上最古老的细菌类群之一 ,在厌氧或好氧条件下以有机物、硫化氢或氨等作为供氢体 ,细菌叶绿素通过捕获光能进行不产氧的光合作用。紫色非硫细菌是不产氧光合细菌中种属最多、分布最广、形态及生理生化特征最为多样、系统发育最为复杂的一大类群 [ 1 ]。紫色非硫细菌代谢类型多样 ,不仅具有独特的生理生化特性 ,且细胞富含蛋白质、氨基酸、维生素等多种生理活性物质 ,因此 ,在污水处理、水产养殖、色素提取、饲料添加剂和能源开发等方面具有重要的应用价值。 内蒙古有广泛的碱湖分布 ,蕴藏着丰富的微生物资源。鄂尔多斯地区素以盐碱湖而闻名 ,是世界上著名的盐碱湖密集区之一 ,大于 1 km2的盐碱湖在鄂尔多斯有 61个 ,其中碱湖 48个。碱湖的形成有其独特的地质和气候条件 ,高浓度的碳酸根和碳酸氢根可以导致碱湖的 pH值高于 9,甚至可达 11～12,其中有大量的微生物存在 [ 2 ]。本研究从内蒙古鄂尔多斯查汗淖碱湖中分离出一株耐碱的紫色非硫光合细菌 ,并对其进行了生理特性研究及分类鉴定 ,旨在为进一步的开发应用奠
2009年第 11期 杨慧等 :内蒙古碱湖中紫色非硫光合细菌的分离和鉴定
定基础。
1 材料和方法
1. 1　样品来源及培养基
碱湖水样采自内蒙古鄂尔多斯查汗淖碱湖 , pH
10. 0。初次分离采用 LB培养基 ,再次转接和分离
纯化采用紫色非硫光合细菌分离用培养基 [ 3 ]。
1. 2 菌株的分离与纯化
取 1 m l碱湖水样进行 10倍系列稀释 ,取 10 - 2 ～
10 - 4稀释度的菌液接种于 LB 平板培养基表面 ,
在 28℃下培养 10 d。从稀释平板中挑取单菌落 ,接
种于装满紫色非硫光合细菌分离用液体培养基的
18 mm ×180 mm 厌氧试管中 , 在 28℃、2 000 ～
3 000 lx的光照培养箱中培养 7～10 d,直至培养液
出现红色。再重复半固体培养基深层逐级稀释
法 [ 4 ] ,反复纯化 2～3次 ,直到培养基中没有其他杂
菌菌落出现 ,并通过光学显微镜观察直到获得纯菌
株为止。
1. 3 菌株的形态学观察
1. 3. 1　菌落形态观察 菌株在固体培养基平板上 ,
培养 7～10 d,观察其菌落形态及颜色。
1. 3. 2　菌体形态电镜观察 将菌株在分离用液体
培养基中活化培养 ,培养条件同上 ,待培养液变为红
色时 ,于 10 000 r/m in离心 4 m in,收集菌体。送至
中国科学研究院微生物所电镜室 ,采用透射电镜及
扫描电镜进行光合细菌的细胞形态观察。
1. 4　活细胞吸收光谱的测定
取适量光照厌氧纯培养物在 10 000 r/m in离心
2 m in,生理盐水洗涤 1～2次 ,悬浮于 60%的蔗糖水
溶液中 ,以 60%蔗糖溶液做参比 ,用 UV2721型紫外
可见分光光度计在波长 350～900 nm范围内扫描 ,
记录其活细胞吸收光谱。
1. 5　酸碱度对细胞生长的影响
将所分离菌株在 PNSB液体培养基中活化 ,按
2. 5%的接种量接种于 200 m l PNSB液体培养基中 ,
分别调节 pH为 6. 5, 7. 0, 7. 5, 8. 0, 8. 5, 9. 0, 9. 5,在
28℃、2 000～3 000 lx的光照培养箱中培养 ,定期测
定其 OD600。
1. 6　生理生化特性测定
菌株的生理生化特性鉴定参照《常见细菌系
统鉴定手册 》[ 5 ]的内容进行 ,包括接触酶试验 , H2 S
生成试验 ,吲哚试验 ,硝酸盐还原试验 ,明胶液化
试验等。
1. 7　16S rRNA基因的 PCR扩增及测序分析
细菌基因组提取采用天根生化科技 (北京 )有
限公司离心柱型细菌基因组 DNA提取试剂盒提取。
用细菌通用性引物 ( 27f～1541 r) PCR 扩增细菌的
16S rDNA, PCR反应体系和反应条件参照文献 [ 6 ] ,
PCR扩增产物直接送至上海生工生物工程技术服
务有限公司进行测序。将所测定的 16S rDNA 序
列 ,在 GenBank数据库中利用 BLAST进行同源性分
析和相关信息检索 ,采用 ClustalX进行序列比对 ,采
用 MEGA 4. 1软件构建系统发育树。
2 结果与讨论
2. 1 分离与纯化
碱湖水样经初次 LB平板分离 ,黑暗好氧培养
条件下 10 d获得红色菌落 ,挑取典型菌落进行纯
化 ,经反复镜检确定为纯培养物 ,菌株编号为 JH12
6。将其转接于紫色非硫光合细菌分离用液体培养
基中 ,光照厌氧条件下生长更快更好 ,培养 3～5 d
后培养液呈红色。
2. 2 菌株形态学特征
菌株 JH126在黑暗好氧条件下形成圆形红色菌
落 ,直径约 0. 5～1 mm,表面光滑湿润 ,边缘整齐 ,有
光泽。光照厌氧条件下菌液呈红色 ,单菌落为球状、
红色 ,直径为 2～4 mm;革兰氏染色阴性 ,菌体杆状 ,
稍微弯曲 ,出芽繁殖 (图 1)。这些培养特征显示该
菌株属于紫色非硫细菌。
图 1　扫描电镜下菌株 JH126菌体形态图
2. 3 活细胞吸收光谱
菌株 JH126活细胞经紫外可见光分光光度计连
续扫描 ,其色素吸收光谱如图 2 所示。在 350 ～
950 nm波长范围的特征吸收峰 ,分别位于 365 nm、
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
489 nm、591 nm、806 nm、854～855 nm. 其中 365 nm,
591 nm, 806 nm处为细菌叶绿素 a的特征吸收峰 ;
489 nm处为类胡萝卜素的特征吸收峰。由此可见 :
JH126活细胞中含有细菌叶绿素 a和类胡萝卜素。
图 2　JH126菌株的活细胞吸收光谱
2. 4　酸碱度对菌株生长的影响
如图 3所示 ,菌株 JH126在 pH6. 5～9. 0范围内
生长良好 ,最适生长 pH为 6. 5～7. 0。在 pH高于
9. 0的培养基中 ,菌株 JH126难以生长。在整个生
长周期内 ,培养基 pH并无多大的改变。结果表明
菌株 JH126为耐碱菌。
图 3　菌株 JH126在不同 pH值的生长曲线
2. 5 菌株的生理生化特性
菌株 JH126能利用乙酸 ,丙酸 ,丁酸 ,乳酸 ,苹果
酸 ,乙醇 ,甘油 ,谷氨酸 ;不能利用精氨酸 ,葡萄糖 ,果
糖 ,甲醇 ,山梨醇 ,甘露醇。接触酶试验 ,吲哚试验 ,
硝酸盐还原试验阳性 ,硫化氢生成试验 ,明胶液化试
验阴性。
2. 6　16S rRNA基因序列分析
菌株 JH126扩增出的 DNA片段条带单一 ,测序
后 ,得到长度为 1 389 bp的 16S rRNA基因序列 ( Gen2
Bank序列注册号 : EU703957)。将此序列用 BLAST
软件和 MEGA软件处理 ,并与 GenBank中已发表的
16S rRNA基因序列进行同源性比较 ,选取相关细
菌 16S rRNA基因序列构建系统发育树 (图 4 )。
由系统发育树可知菌株 JH126与已报道的沼泽红
假单胞菌 ( R hodopseudom onas pa lusteris)的模式菌
株 ATCC17001T亲源关系最近 ,有 98%的相似性 ,结
合菌株的形态学和生理学特性 ,可确定分离的菌株
为沼泽红假单胞菌 (R hodopseudom onas pa lusteris)。
图 4 菌株 JH126的 16S rRNA基因
全序列分析系统发育树
3 总结
紫色非硫光合细菌在自然界分布广泛 ,通常见
于淡水、咸水及潮湿土壤等环境中 ,近年来发现紫色
非硫光合细菌也常与紫色和绿色硫细菌一起存在于
湖水及其沉积物中。大多数紫色非硫光合细菌是从
土壤、水沟和污泥等环境中获得的 ,只有个别报道从
非洲苏打湖等极端环境中分离到紫色非硫光合细
菌 [ 7 ]。本研究首次报道从我国内蒙古碱湖中分离
到一株紫色非硫光合细菌 ,该菌株可耐受 pH9. 0的
碱性环境生长 ,内蒙古鄂尔多斯碱湖地处高原 ,阳光
充足 ,蕴藏于其中的各种微生物资源已适应了这种
特定的生境 ,从中获得的紫色非硫光合细菌在光能
利用及产类胡萝卜素方面应具有明显优势。进一步
确定了该菌株的分类地位 ,为其今后开发利用奠定
了良好基础。
参 考 文 献
1　刘如林 ,刁虎欣 ,梁风来 ,光合细菌及其应用 [M ]. 北京 :中国农
业科技出版社 , 1991.
2　张伟周 ,毛文扬 ,薛燕芬 ,等. 生物多样性 , 2001, 9 (1) : 44～50.
3　刘芳 ,王敏 ,杨慧等. 安徽农业科学 , 2008, 36 (18) 7538～7539 .
4　 Norbert P. International Journal of Systematic Bacteriology, 1978, 28:
081
2009年第 11期 杨慧等 :内蒙古碱湖中紫色非硫光合细菌的分离和鉴定
283～288.
5　东秀珠 ,蔡妙英 ,等 ,常见细菌系统鉴定手册 [M ]. 北京 :科学出
版社 , 2001.
6　刘芳 ,王敏 ,杨慧 ,等. 中国生物工程杂志 , 2008, 28 (8) : 91～95.
7　 M ilford AD, Achenbach LA, Jung DO, et al. A rch M icrobiol, 2000,
174 : 18～27.
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