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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
番茄 E8 基因启动子的克隆及其在拟南芥中的表达
张艳云 林卫 李唯 马静芳 王旺田
(甘肃农业大学生命科学与技术学院，兰州 730070)
摘 要: 利用 PCR技术从番茄基因组 DNA中克隆长约 1. 1 kb的 E8 基因启动子与 517 bp的 E8 基因片段，将其二者连
接构建植物表达载体，导入农杆菌，通过花序侵染法转化拟南芥，得到转基因拟南芥。用 RT-PCR分析转基因拟南芥中 E8 基
因启动子驱动 E8 基因小片段的结果表明，E8 基因小片段 mRNA仅在转基因拟南芥长角果中转录，根、茎、叶、花中不转录，提
示 E8 基因的 1. 1 kb启动子在异源植物拟南芥中仍具有驱动外源基因果实特异性表达的特性。
关键词: E8 启动子 拟南芥 E8 基因小片段 基因表达
Cloning E8 Promoter from Tomato and Expression of
E8 Gene in Transgenic A． thaliana
Zhang Yanyun Lin Wei Li Wei Ma Jingfang Wang Wangtian
(Life-Science Institute of Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070)
Abstract: The 1 100 bp 5 flanking sequence and 517 bp partial encode sequence of E8 gene was cloned by PCR． The promoter
was fused with small fragement of E8 gene to construct plant expression vector pCAMBIA2300-E8，which was introduced into A． thali-
ana by Agrobacterium-tumefaciens． RT-PCR results which analysis of E8 1. 1 promoter driving E8 gene in transgenic A． thaliana showed
that E8 partial encode gene only expressed in the siliques，but not in root，leaf，stem，flower． The above results suggest that E8 promoter
also has ability of driving exogenous gene expressed in transgenic A． thaliana． This result can make possible to use E8 promoter in
transgenic peach on subsequent research．
Key words: E8 promoter A． thaliana E8 gene fragement Gene expression
收稿日期:2010-01-13
基金项目:甘肃省科技厅计划项目(0708NKCA070)
作者简介:张艳云，女，硕士生，研究方向:植物生理生化;E-mail:z5623324@ 126. com
通讯作者:李唯，男，博士，教授，E-mail:liwei@ gsau. edu. cn
果实特异性启动子能有效驱动基因在果实中特
异表达，多种果实特异性启动子如 E4、E8、2A11 等
已陆续从西红柿中分离获得，E8 启动子是其中应用
最广泛的果实特异性启动子之一。Michelle 等［1］将
E8 基因-2181 至起始密码子间的全长约 2. 2 kb 的
启动子区替换为 CaMV35S 启动子后，E8 基因在转
基因番茄的花药、种子、果实中均有表达，表明 E8
基因 2. 2 kb的启动子区具有果实特异性表达调控
作用。在此基础上，Dikman 等［2 － 4］运用基因敲除
法，敲除-2181 – -1 088 bp 的 E8 基因启动子区域，
只保留-1 088 至起始密码子间的长约 1. 1 kb 的启
动子区域时，仍能调控 E8基因在番茄果实成熟阶段
的特异性表达，可见 1. 1 kb 的启动子区域是 E8 基
因果实特异性表达所必需的。该启动子在番茄中的
时空表达特性已研究清楚，但该启动子驱动基因在
其它植物中表达的时空特异性仍不清楚。基于此，
本研究根据已报道的 E8 1. 1 kb 启动子序列设计引
物，克隆 E8 基因 1. 1 kb的启动子区及其后长约 517
bp的 E8 基因第一外显子片段，构建重组载体
pCAM2300-E8，转化拟南芥，进而通过对 E8 1. 1 kb
启动子后的 E8 基因 517 bp片段的转录分析来研究
E8 1. 1 kb启动子对基因表达的调控，为下一步利用
E8 启动子驱动外源基因在桃果实中特异性表达作
准备。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
1 材料和方法
1. 1 材料
番茄(Lycopersicon esculentum)种子、植物表达载体
pCAMBIA2300 及大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、农
杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、GV3101 由本实验室
提供，pGEM-T Easy载体购自大连宝生物，生态型拟南
芥(Arabidosis thaliana)种子由兰州大学馈赠。
植物基因组 DNA 提取试剂盒购自百泰克，限
制性内切酶、T4 DNA 连接酶、DNA 胶回收试剂盒、
PCR纯化试剂盒均购自 Fermentance 公司，地高辛
杂交检测试剂盒购自依诺金公司，Plantol 高效植
物总 RNA 提取试剂盒购自深圳莱伯克生物技
术公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 植物 DNA的提取和引物设计 以番茄幼叶
为材料，参照植物基因组 DNA提取试剂盒说明书提
取基因组 DNA。根据 GenBank 上发表的 E8 基因
(登录号:x13437)的启动子及第一外显子序列设计
引物(表 1) ，引物由上海生工生物技术有限公司
合成。
表 1 PCR扩增引物序列
基因 引物名称 引物序列(5-3)
E8 1. 1 kb
启动子
P1
ATCCCATGGTCACGAAATCGGCCCT(划线
部分为 NcoⅠ位点)
P2
CGCGGTACCCTTCTTTTGCACTGTGA(划线
部分为 KpnⅠ位点)
E8 基因
小片段
P3
CGCGGTACCATGGAAAGCCCTAGAGTTGA
(划线部分为 Kpn I位点)
P4
ATCGGATCCGGGTGCTCGAGCACGG(划线
部分为 BamH I位点)
1. 2. 2 E8 1. 1 kb启动子和 E8 基因第一外显子的
克隆 E8 1. 1 kb 启动子的 PCR 反应程序:94℃预
变性 5 min;94℃变性 30 s，47℃退火 l min，72℃延
伸 1 min，30 个循环;72℃延伸 10 min。E8 基因小片
段的反应程序:94℃预变性 5 min;94℃变性 30 s，
49℃退火 l min，72℃延伸 1 min，30 个循环;72℃延
伸 10 min。
PCR产物按 Fermentance公司 PCR 纯化试剂盒
说明书纯化后，依据 TA 克隆的方法分别将两段目
的基因与 pGEM-T Easy vector连接，命名为 E8promoter-
T和 E8517-T，将其分别转入 E． coli DH5α 中，得到阳
性重组子，送宝生物进行测序确认。
1. 2. 3 植物表达载体 pCAMBIA-E8 的构建 植物
表达载体 pCAMBIA-E8promoter是在 pCAMBIA2300 基
础上，将 CaMV35S启动子置换为番茄 E8 1. 1 kb 启
动子构建而成的。利用 NcoⅠ和 KpnⅠ双酶切
E8promoter-T和 pCAMBIA2300，将 E8promoter-T 小片段和
pCAMBIA2300 大片段连接，获得中间载体 pCAM-
BIA-E8promoter。利用 KpnⅠ和 BamHⅠ双酶切 pCAM-
BIA-E8promoter和 E8517-T，将 E8517-T 小片段与 pCAM-
BIA-E8promote大片段连接，最终获得植物表达载体
pCAMBIA-E8(图 1)。
图 1 植物表达载体 pCAMBIA-E8 示意图
1. 2. 4 拟南芥的遗传转化 花序浸染法(Floral-
dip)［5，6］转化拟南芥。
1. 2. 5 转基因植株的 PCR鉴定和 Dot blotting 杂交
鉴定 提取 T1代植株基因组 DNA，以 P1、P4 为引
物，进行 PCR 检测。反应体系为 25 μL 体系:DNA
模板 1 μL，10 × buffer 2. 5 μL，dNTP 0. 5 μL，引物
P1、P4 各 0. 5 μL，Taq 酶 0. 5 μL，补 ddH2 O 至 25
μL。反应条件与 E8 启动子扩增条件相同。
为进一步排除假阳性的干扰。采用质粒
pCAMBIA2300 自带的 NPTⅡ基因(地高辛标记)作
为探针，NPTⅡ基因的引物为(N1:5-ATACCG-
TAAAGCACGAGGAAG-3;N2:5-CTGAAGCGGGA-
AGGGACT-3)。按照依诺金公司的地高辛杂交检测
试剂盒使用手册进行杂交和检测。
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2010 年第 7 期 张艳云等:番茄 E8 基因启动子的克隆及其在拟南芥中的表达
1. 2. 6 转基因植株 mRNA检测 根据 Plantol高效
植物总 RNA 提取试剂盒说明，分别从转基因植株
根、茎、叶、长角果中提取总 RNA，以 GAPDH基因为
内参(上游引物:5-AAGACGCTCCAATGTTTG-3，下
游引物:5-CTGGGAATAATGTTGAATGA-3) ，使用
P3、P4 进行目的基因反转录 RT-PCR 扩增，检测 E8
基因 mRNA。
2 结果与分析
2. 1 E8 启动子的克隆与序列分析
提取番茄基因组，用表 1 中的 P1、P2 进行 PCR
扩增，得到约 1. 1 kb的条带(图 2)。对其进行序列
分析，结果表明，所克隆的基因与 GenBank 上报道
的番茄 E8 启动子序列基本一致，只有一个碱基发
生变化，是 702 bp处的 T 被 C 所代替，但该变异位
点并非位于启动子核心区，对 E8 启动子的功能影
响不大，故所克隆片段即为 E8 1. 1 kb 启动子片段。
用 P3、P4 对 E8 小片段进行 PCR 扩增，得到 500 bp
左右的条带(图 2)。测序结果表明所扩增片段与
GenBank上报道的番茄 E8 基因第一外显子序列同
源性为 100%，故可以确定该片段为 E8 基因小
片段。
1．启动子 1. 1 kb 的扩增片段;2． E8 外显子 517 bp 的扩增片
段;M． DL 2000 Marker
图 2 PCR产物凝胶电泳
2. 2 植物表达载体 pCAMBIA-E8 构建
利用 Nco Ⅰ 和 Kpn Ⅰ 双酶切 E8promoter-T 和
pCAMBIA2300，将 E8promoter-T 小 片 段 和 pCAM-
BIA2300 大片段连接，获得中间载体 pCAMBIA-
E8promoter。用 NcoⅠ和 KpnⅠ双酶切鉴定，可切出
1. 1 kb的 E8 启动子和剩余载体序列(图 3) ，表明中
间载体 pCAMBIA-E8promoter构建正确。利用 KpnⅠ和
BamHⅠ双酶切 pCAMBIA-E8promoter 和 E8517-T，将
E8517-T小片段与 pCAMBIA-E8promoter大片段连接，获
得植物表达载体 pCAMBIA-E8。用 BamHⅠ和 Kpn
Ⅰ双酶切鉴定，可切出 500 bp 左右的小片段和剩余
载体序列(图 3) ，表明 pCAMBIA-E8 构建正确。
1． BamHⅠ/KpnⅠ酶切质粒 pCAMBIA-E8517;2． NcoⅠ/KpnⅠ酶切
质粒 pCAMBIA-E8 promoter;M． DL 15000分子量标准
图 3 植物表达载体 pCAMBIA-E8 酶切鉴定图
2. 3 转基因植株的分子检测
通过花序浸染法获得 NPTⅡ抗性的转基因拟南
芥。待抗性拟南芥植株长至 10 cm 时，从叶片中提
取基因组 DNA，用 P1、P4 进行 PCR 扩增。PCR 结
果表明，从抗性拟南芥基因组中可以扩增到约 1. 6
kb的特异条带(图 4)。
1．阴性对照(非转基因拟南芥基因组为模板) ;2．阳性对照
(质粒 2300-E8 为模板) ;3，4，6，7，8．检测呈阳性的拟南芥
T1 代植株;M． DL 2000 分子量标准
图 4 部分转基因植株 PCR鉴定结果
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
为进一步排除假阳性的可能，以 NPTⅡ基因为
探针，进行点杂交检测。杂交结果(图 5)表明有 9
株出现杂交信号，其中 E8-2 和 E8-4 较强。PCR 结
果与点杂交结果相互印证，最终确认 E8 1． 1 kb 启
动子和 E8 基因小片段基因已整合到拟南芥基因
组中。
+ ．阳性对照(质粒 2300-E8) ;－ ．阴性对照(非转基因拟南芥
基因组) ;1，2，4，6，8，9，16，17，19，21．转基因阳性植株
图 5 转基因植株的 NPTⅡ基因点杂交结果
2. 4 转基因植株 mRNA检测
待转基因植株与非转基因植株长至长角果成熟
期，分别从根、茎、叶、花、长角果中提取 mRNA，进行
RT-PCR扩增(由于 E8 基因小片段序列全部为外显
子，故 RT-PCR引物仍为 P3、P4) ，结果(图 6)表明，
仅在转基因植株长角果中扩增到约 520 bp 的特异
条带，非转基因长角果中未扩增到特异条带。
1．根中 E8 RT-PCR结果;2．茎中 E8 RT-PCR结果;3．叶
中 E8 RT-PCR结果;4 ． 花中 E8 RT-PCR 结果;5．非转
基因长角果中 E8 RT-PCR结果;6．转基因植株长角果
中 E8 RT-PCR结果;M． DL 2000 分子量标准
图 6 转基因植株各组织 E8 mRNA检测
3 讨论
本试验中直接将 E8 1. 1 kb 启动子与 E8 基因
小片段连接，通过 E8 基因小片段在拟南芥这种异
源植物中的表达，了解启动子在异源植物中的调控
情况，为后序试验利用该启动子驱动外源基因在桃
果实中表达作准备。为排除拟南芥自身基因对试验
结果的干扰，在试验初期，通过查阅 GenBank 及前
人有关 E8 基因的研究成果，均未发现拟南芥基因
组中存在类似基因的报道。此外，本试验所设的非
转基因植株阴性对照中也没有扩增出 E8 基因条
带，同时在点杂交结果中阴性对照也显示阴性，因而
可以排除拟南芥自身基因对本试验结果准确性的影
响。因此，通过 E8 小片段在转基因拟南芥中的表
达情况研究 E8 1. 1 kb启动子的方法具有可行性。
经试验分析表明仅在转基因植株的荚果中检测
到了 E8 小片段 mRNA，在转基因拟南芥的根、茎、叶
中均未检测到 E8 小片段 mRNA的存在，这与 lincon
等仅在番茄果实中检测到 E8 基因 mRNA 的结果一
致，表明 E8 1. 1 kb 启动子在转基因拟南芥中依然
具有组织特异性调控特性。本研究所克隆的 E8
1. 1 kb启动子序列与 GenBank 上报道的番茄 E8 启
动子序列经 Blast 比对，仅有一个碱基发生变化，是
－ 702 bp 处的 T 被 C 所代替。通过查阅 Deikman
对 E8 1. 1 kb 的转录调控区功能研究表明，
－ 1088 － － 863之间的序列是 DNA 结合蛋白区域;
－ 409 － － 263区是控制 E8 基因能否在果实成熟过
程中特异性表达的关键区域，因此 － 702 bp 处的碱
基并非位于核心转录调控区，故而对 E8 启动子的
调控功能影响不大，可以确定该序列是 E8 启动子
序列，并且通过 RT-PCR 检测，发现 E8 基因在拟南
芥果实中出现表达，进一步提示 E8 启动子在异源
植物中仍具有果实特异性，－ 702 bp 处的碱基突变
对启动子的活性影响不明显。
目前报道的转基因试验所用的启动子资源较
少，多为组成型启动子，但由于外源基因在转基因植
物体内持续高效表达，而使转基因正常生长发育受
到影响，因此急需开发利用新的启动子。通过本试
验发现 E8 启动子可以在拟南芥中驱动外源基因表
(下转第 124 页)
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
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櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
69-74．
(上接第 116 页)
达，提示 E8 启动子在异源植物中仍具有果实特异
性启动子的特性，为今后 E8 启动子作为新的启动
子种类，运用于桃中研究果实性状，改良品种食用
性，研制食用性疫苗中奠定基础。
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