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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
pGEX-4T-1 /Tα1-TP5 原核表达载体的构建及表达
谢琦1，2 林军1 王凤山2
(1桂林医学院生物技术学院，桂林 541004;2山东大学药学院生化与生物技术药物研究所，济南 250012)
摘 要: 旨在构建胸腺融合肽 Tα1-TP5 原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。化学合成 Tα1-TP5 基因，与原核表达载
体 pGEX-4T-1 融合并转化至 E． coli BL21(DE3) ，IPTG诱导表达，用 SDS-PAGE电泳和 AlphaEase凝胶电泳图像分析系统对工
程菌表达的蛋白进行分析鉴定。表达的 GST 融合蛋白经 GST 琼脂糖凝胶亲和层析和重组肠激酶切割后，电喷雾质谱(ESI-
MS)鉴定胸腺融合肽 Tα1-TP5。结果显示，成功构建 pGEX-4T-1 /Tα1-TP5 原核表达载体，工程菌表达的 GST 融合蛋白占全菌
总蛋白的 27． 8%，且主要以可溶形式表达。经 ESI-MS鉴定，胸腺融合肽 Tα1-TP5 的分子量与理论值相符。胸腺融合肽 Tα1-
TP5 在大肠杆菌中得到了高效表达。
关键词: 胸腺融合肽 Tα1-TP5 GST-融合蛋白 pGEX-4T-1 大肠杆菌 原核表达
Construction and Expression of the Prokaryotic
Expression Vector pGEX-4T-1 /Tα1-TP5
Xie Qi1，2 Lin Jun1 Wang Fengshan2
(1College of Biotechnology，Guilin Medical University，Guilin 541004;
2 Institute of Biochemical and Biotechnological Drug，School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012)
Abstract: It was to construct the prokaryotic expression vector PGEX-4T-1 /Tα1-TP5 and express GST fusion protein in E． coli．
The chemically synthesized Tα1-TP5 gene was fused with prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 and transformed into E． coli BL21
(DE3)． The recombinant expressed proteins induced by IPTG were analyzed and identified with SDS-PAGE electrophoresis and Alpha-
Ease gel electrophoresis image analysis system． GST fusion protein was purified by GST sepharose gel and cut by recombinant enteroki-
nase． Tα1-TP5 fusion peptide was identified with ESI-MS． Results showed that the prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 /Tα1-TP5
was successfully constructed． The expressed fusion protein GST-Tα1-TP5 accounted for 27． 8% of the bacterial total protein，and mainly
in a soluble form． Identified by ESI-MS，the molecular weight of Tα1-TP5 fusion peptide was identical with theoretical value． Tα1-TP5
fusion peptide was efficiently expressed in E． coli．
Key words: Tα1-TP5 fusion peptide GST fusion protein pGEX-4T-1 E． coli Prokaryotic expression
收稿日期:2011-04-22
作者简介:谢琦，女，讲师，研究方向:多肽的合成与活性研究;E-mail:xq@ glmc． edu． cn
通讯作者:王凤山，男，教授，E-mail:fswang@ sdu． edu． cn
随着基因工程和功能蛋白质组学的快速发展，
多肽与蛋白质类药物已成为当今国际市场上的一大
类重要药物。据法国 SENN化学公司统计的数据显
示，目前与多肽药物相关的产品，市场销售额达到了
500 亿美元以上。未来 5 年多肽类治疗药物每年将
以高于 15%的幅度扩张。我国制定的“十五”期间
生物医药研究的重点方向之一就是多肽药物和诊断
试剂。
胸腺素 α1(Tα1)是胸腺组分 5(Thymosin frac-
tion 5)中分离出来的由 28 个氨基酸残基组成的多
肽，胸腺五肽(TP5)是胸腺生成素 II第 32 － 36 位的
氨基酸残基片段。Tα1 和 TP5 均属免疫调节
剂［1，2］，临床上 TP5 和 Tα1 都被用于治疗免疫缺陷、
肝炎、肿瘤和艾滋病等疾病［3，4］。由于 Tα1 和 TP5
具有相似的生物学活性和临床用途，在临床治疗相
关疾病时有联合用药的报道。Gao 等［5］曾对二者的
联合作用作了一些研究，结果表明 Tα1 和 TP5 的联
合作用效果在某些方面要大于单独使用的效果。多
2011 年第 8 期 谢琦等:pGEX-4T-1 /Tα1-TP5 原核表达载体的构建及表达
年的临床实践也证明单一物质对免疫系统的作用不
如多种物质对免疫系统的联合作用。为了进一步研
究两者联合作用的效果，开发适用于临床的具有双
重活性的免疫调节剂，将 Tα1 与 TP5 的基因进行融
合，通过构建 pGEX-4T-1 /Tα1-TP5 重组表达载体，
首次利用大肠杆菌进行表达，并对表达的胸腺融合
肽 Tα1-TP5 进行鉴定。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
表达载体 pGEX-4T-1，大肠杆菌 DH5α 和 BL21
(DE3)为本实验室保存。
限制性内切酶 BamH I 和 Xho I、Taq DNA 聚合
酶、T4 DNA 连接酶、低分子量蛋白 Marker 购自大连
宝生物公司。DNA Marker、中提质粒试剂盒、胶回
收试剂盒购自天根生化科技有限公司。异丙基硫代
β-D-半乳糖苷(IPTG)为 Amresco 公司产品。重组
肠激酶购自上海欣百诺生物技术有限公司。GST琼
脂糖凝胶 4B 购自上海闪晶分子生物科技有限
公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 目的基因的设计与合成 依据人源性的
Tα1 和 TP5 的分子结构，设计了一个由 3 个甘氨酸
构成的连接肽将 Tα1 和 TP5 相连，Tα1 和 TP5 分别
位于融合肽的 N端和 C端，记作 Tα1-(Gly)3-TP5 基
因，同时在 Tα1 前端加入肠激酶酶切位点(方框内
序列)。所合成的序列如下:5-GACGACGATGATA
AA TCTGATGCGGCCGTTGATACCTCTTCTGAAATT-
ACGACCAAAGATCTGAAAGAAAAGAAAGAAGTG-
GTTGAAGAAGCGGAGAACGGCGGTGGCCGCAAAG-
ATGTGTAC-3。
1． 2． 2 引物的设计与合成 根据上海生物工程有
限公司提供的含有目的基因的 PUC57 质粒，用
Primer 5． 0 软件设计用于大量扩增目的基因的引
物。上游引物 P1:5-TAGGATCC CACCATCATCAC
CATCACTGTAAAACGACG-3，下游引物 P2:5-GCA-
GTCAGCACTCGAGAATGATTACGCCAAGC-3。在上
游引物中增加 BamH I酶切位点(下划线序列)和组
氨酸标签(方框内序列) ，下游引物中增加 Xho I 酶
切位点(下划线序列)。
1． 2． 3 目的基因的扩增及纯化 以含有目的基因
的 PUC57 质粒为模板，扩增目的基因。PCR 扩增体
系为 50 μL，含有上下游引物终浓度各 0． 2 μmol /L，
dNTPs 终浓度 200 μmol /L，10 × Buffer for Ex Taq 5
μL，模板 2 μL，Ex Taq 酶 1． 25 U，灭菌去离子水补
足 50 μL。按照 94℃变性 50 s，63℃退火 30 s，72℃
延伸 1 min的程序扩增 30 个循环。用 1． 5%的琼脂
糖凝胶电泳分离 PCR扩增产物，凝胶成像系统观测
并记录结果。在紫外灯下切下目的条带，用胶回收
试剂盒提纯目的 DNA。
1． 2． 4 连接与转化 PCR 扩增并纯化后的目的基
因片段和载体 pGEX-4T-1 分别用 BamH I 和 XhoⅠ
37℃双酶切 4 h，酶切后的目的基因和载体分别经琼
脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收。将回收的目的基因
与载体以摩尔比 5∶ 1 的比例混合，16℃连接过夜，构
建含有目的基因的重组质粒 pGEX-4T-1 /Tα1-TP5，
电转化大肠杆菌 DH5α。
1． 2． 5 重组质粒 pGEX-4T-1 /Tα1-TP5 的筛选与鉴
定 挑取单个菌落于含 50 mg /L 氨苄青霉素的 LB
液体培养基中 37℃培养过夜后，取 1 μL 菌液为模
板，以 P1 /P2 为引物，进行 PCR 反应鉴定。将扩增
出目的基因的重组质粒送上海生工生物工程技术服
务有限公司进行测序，测序结果与所设计的目的基
因进行比对。
1． 2． 6 GST 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析
测序正确的 pGEX-4T-1 /Tα1-TP5 重组质粒和空白
质粒 pGEX-4T-1 电转化 E． coli 表达菌株 BL21
(DE3) ，鉴定正确后，分别取重组质粒和空白质粒的
转化菌，37℃，220 r /min 振荡培养至 OD600值为 0． 8
时，加入 IPTG 至终浓度 1 mmol /L，同时设未诱导组
(不加 IPTG)作阴性对照，继续振荡培养 4 h，离心收
集菌体，用 12% SDS-PAGE作全菌蛋白分析，同时用
AlphaEase凝胶电泳图像分析系统分析样品中所含
GST融合蛋白的比例。取适量重组质粒转化菌的诱
导表达菌体于冰浴中超声破菌，12 000 r /min 离心 10
min，取上清和沉淀与上述菌体一起进行 12% SDS-
PAGE电泳，分析目的蛋白的表达及分布情况。
1． 2． 7 胸腺融合肽 Tα1-TP5 的鉴定 由于融合蛋
白 GST-Tα1-TP5 在表达菌株 BL21(DE3)中是可溶
表达的，可直接用谷胱甘肽-S 转移酶(GST)亲和层
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析法分离纯化融合蛋白 GST-Tα1-TP5。取适量经诱
导表达后菌体于冰浴中超声破菌，12 000 r /min 离
心 10 min，将含 GST融合蛋白的上清与 GST琼脂糖
珠轻柔混合 10 min，弃上清，用 50 mmol /L(pH8． 0)
的 Tris-HCl清洗结合了 GST 融合蛋白的 GST 琼脂
糖珠以除去未结合的杂蛋白。然后用 50 mmol /L
(pH8． 0)的 Tris-HCl 重悬 GST 琼脂糖珠，在结合了
GST融合蛋白的 GST 琼脂糖珠中加入重组肠激酶
(37℃，16 h内降解 0． 5 mg融合蛋白 /单位)于 37℃
反应过夜，经酶解后，GST 仍结合在琼脂糖珠上，而
目的蛋白在上清中。短暂离心沉淀琼脂糖珠，取酶
解液上清至无菌 EP管中。将含有胸腺融合肽 Tα1-
TP5 的酶解液送山大药学院质谱分析室进行 ESI-
MS分析。
2 结果与分析
2． 1 目的基因的扩增
对含目的基因的 PUC57 质粒进行 PCR 扩增，
扩增产物在 1． 5%琼脂糖凝胶电泳结果(图 1)显
示，扩增出的 DNA片段在约大于 200 bp 处形成一
条明亮的条带，与 228 bp 的预期目的片段大小
相符。
M． 100 bp Ladder DNA Marker;1． PCR产物
图 1 目的基因 PCR 扩增产物鉴定
2． 2 重组质粒 pGEX-4T-1 /Tα1-TP5 的鉴定
重组质粒 pGEX-4T-1 /Tα1-TP5 进行菌液 PCR
反应鉴定，扩增产物在 1． 5%琼脂糖凝胶电泳结果
显示，有约 228 bp单一的特异性 DNA条带(结果未
显示)。重组质粒经测序分析证实为 PGEX-4T-1 /
Tα1-TP5，测序结果见图 2，其中方框内为引物序列。
TAGGATCCCACCATCATCACCATCACTGTAAAACGACG GCC-
AGTGAATTCTCCGCGGGTGACGACGATGATAAATCTGATGCGGCCG-
TTGATACCTCTTCTGAAATTACGACCAAAGATCTGAAAGAAAAGAA-
AGAAGTGGTTGAAGAAGCGGAGAACGGCGGTGGCCGCAAAGATGT-
GTACTAATAAGAGCTCAA GCTTGGCGTAATCATTCTCGAGTGCTG
ACTGC
图 2 重组质粒的核苷酸序列
2． 3 GST融合蛋白的诱导表达及可溶性分析
SDS-PAGE 分析表明，重组质粒转化菌的诱导
表达产物可见相对分子质量约 32 kD 的特异蛋白
条带，大小与预期相符，而未诱导组、空载体转化
菌诱导组此处未见表达增强的条带。重组质粒转
化菌诱导表达的 GST 融合蛋白占全菌总蛋白的
27． 8%。同时通过测定诱导表达菌体经超声破菌
后的上清和沉淀可知 GST融合蛋白主要存在上清
中，表明 GST 融合蛋白主要以可溶的形式进行表
达(图 3)。
M．蛋白质 Marker ;1．空载体转化菌(未诱导) ;2．空载体转
化菌(诱导) ;3．重组质粒转化菌(未诱导) ;4．重组质粒转
化菌(诱导) ;5．超声破菌上清;6．超声破菌沉淀
图 3 表达产物的 SDS-PAGE分析
2． 4 胸腺融合肽 Tα1-TP5 的鉴定
工程菌表达的 GST 融合蛋白经 GST 琼脂糖珠
亲和纯化，肠激酶切割后，含目的肽的上清液经电喷
雾质谱(ESI-MS)分析，结果显示其荷质比为 3 900，
与重组胸腺肽 Tα1-TP5 的理论分子量相吻合。质
谱鉴定证明胸腺融合肽 Tα1-TP5 在大肠杆菌中得
到了表达(图 4)。
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图 4 胸腺融合肽 Tα1-TP5 的 ESI-MS分析图
3 讨论
胸腺素 α1(Thymosin α1，Tα1)和胸腺五肽
(Thymopentin，TP5)是临床上使用量较大的多肽类
药物，目前主要是采用化学法合成，价格昂贵，使其
推广应用受到了限制［6］。随着分子生物学和重组
技术的发展，利用现代生物技术生成多肽类药物已
成为多肽类药物开发、生产和改进的主要途径［7］。
利用重组技术研究和开发具有双重活性的胸腺融合
肽必然具有重大的价值。
Tα1 和 TP5 同属胸腺激素类，生物学活性相似，
临床用途也相似，有研究表明 Tα1 和 TP5 联合使用
在某些方面可达到协同作用的效果。Tα1 是一种热
稳定多肽，血浆半衰期(t1 /2)长达 2 h，体内活性较
高。TP5 的 t1 /2很短，仅有 30 s，但却能引起较长时
间的免疫调节效果，而且无论是皮下注射还是静脉
给药，都极少产生毒副作用，是一种比较安全的药
物［8］。如果在两个活性肽之间设计一段 Linker来保
证两边多肽的完整结构和活性，那么由 Tα1 和 TP5
组成的融合肽不仅有可能发挥 Tα1 和 TP5 协同作
用，还有可能提高 TP5 的体内半衰期，起到增效的
作用。基于这样的设想，设计了 Tα1-(Gly)3-TP5 基
因，首次应用原核表达系统表达胸腺融合肽 Tα1-
TP5。同时，为了避免低分子质量多肽在进行表达
时出现翻译效率低，表达产物易受蛋白水解酶降解
的情况，采用了融合表达方式。pGEX-4T-1 是表达
GST融合蛋白的原核高效表达载体，带有 IPTG诱导
启动子，其所表达的蛋白产物在 N端带有 GST序列，
融合蛋白产物可通过 GST层析柱快速、简便的纯化。
此外，本研究还在重组胸腺融合肽基因的前端加上肠
激酶酶切位点，利用肠激酶酶切位点的特殊性，使切
割后可以得到完整的胸腺融合肽 Tα1-TP5。
本研究成功构建了 pGEX-4T-1 /Tα1-TP5 重组
表达载体，在大肠杆菌中实现了胸腺融合肽 Tα1-
TP5 与 GST基因的融合表达，不仅获得了较高的可
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溶性的表达量，表达的 GST 融合蛋白占全菌总蛋白
的 27． 8%，而且提供了一种快速纯化胸腺融合肽
Tα1-TP5 的方法，大大简化了纯化过程，为后续的研
究奠定了基础。
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(上接第 171 页)
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