全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
枯草杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导分泌表达
李海军 王林刚 王治泽 陈芳 高剑峰
(石河子大学生命科学学院,石河子 832003 )
摘 要: 借助生物信息学对已克隆的枯草杆菌脂肪酶 L ipB2全长基因序列进行比对分析。结果显示该脂肪酶基因全长
635 bp, 编码包括 31个氨基酸分泌型信号肽在内的 211个氨基酸, 与 NCB I GenBank中已报道的枯草杆菌属脂肪酶核苷酸序
列有 94. 0%的一致性。将该基因克隆到 pET28a( + )表达载体上,转化大肠杆菌 BL21( DE3), 利用枯草杆菌脂肪酶的信号肽
序列进行了分泌表达。SDSPAGE电泳显示分泌表达的脂肪酶分子质量约为 21 kD。对表达条件优化后,在 30 、大肠杆菌菌
液 OD600值为 18、乳糖诱导浓度为 1 5 mM、摇瓶发酵 10 h后大肠杆菌分泌表达 260 U /mL重组脂肪酶,相比较 IPTG的诱导,
既实现了脂肪酶的高效表达,又节省了成本。
关键词: 乳糖诱导 IPTG诱导 枯草杆菌 脂肪酶基因 分泌表达
Induced Secretion Expression of L ipase Gene
from Bacillus subtili inEscherichia coli
L iH aijun W ang L ingang W ang Zhize Chen Fang Gao J ianfeng
( School of Life Science, Shihezi University, Shihez i 832003)
Abstrac:t B io info rma tics ana lysis resu lts show ed that, the sequence leng th of the ta rget lipase gene is 635 bp, encoding 211 AA
wh ich con tain 31 AA secretion s igna l peptide, w ith the indentify of 94. 0% by com pa ring w ith B acillus subtili lipase reported in NCB I
GenBank. The lipase gene w as inserted into the expression vector pET - 28a ( + ), wh ich was finally expressed in E scherichia coli
BL21( DE3) by its secreto ry signa l peptide. SDS- PAGE detec ted them o lecularw e ight of lipasew as 21 kD. W ith the optima l induc
tion temperature 30 , lactose concentra tion 1. 5 mm o l/L, stra in density OD600 1. 8 and induction tim e 10 h, the spec ific activ ity of the
recomb inant lipase was up to 26. 0 U /mL, whc ich show ed the high e ffic iency and low cost com parew ith IPTG induction.
Key words: Induction o f lactose Induction o f IPTG Bacillus subtili L ipase gene Secretory expression
收稿日期: 20091112
基金项目: 2008年度教育部促进与美大 (美洲与大洋洲 )地区科研合作与高层次人才培养项目
作者简介:李海军,男,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学; Em ai:l lihaijun03102@ 163. com
通讯作者:高剑峰,男,教授,博士生导师,研究方向:基因组学和新能源开发; Em ai:l jian fengg@ sh zu. edu. cn
脂肪酶 ( lipase, E. C. 3113)全称为为三酰基
甘油酯水解酶 ( triacy lg lycero l acy lhydro lase)是重要
的工业酶制剂品种之一, 它既能在油水界面催化油
脂水解,又能在有机相中催化转酯反应,因而在食品
加工、油脂深加工、有机合成、药物制造、日化及能源
等工业领域具有非常巨大的应用潜力, 现已被广泛
应用 [ 1- 3]。
脂肪酶属于丝氨酸酶类,其催化活性中心通常
包括 Ser A sp H is或 Ser G lu H is组成的三联
体催化网络 [ 4] , 类似于蛋白酶的三联体电子中继
网,其催化机制可能与蛋白酶一致。虽然各种来源
的脂肪酶氨基酸序列同源性不高,差异显著,但是底
物结合部位的氨基酸却具有非常高的保守性, 通常
为 G lyXxxSerXxxG ly, 少数 为 A laXxxSerXxx
G ly, 如枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtili)脂肪酶 [ 5]。脂
肪酶的催化活性中心位于脂肪酶的分子内部, 表面
被疏水性氨基酸残基覆盖, 对三联体活性中心起保
护作用,当脂肪酶与底物靠近时, 催化部位附近的疏
水性氨基酸移开,活性中心位点暴露,底物与酶相结
合, 脂肪酶开始发挥催化作用 [ 6]。
枯草杆菌脂肪酶具有较强的疏水性, 因而在大
肠杆菌表达系统中常常以包涵体的形式存在, 表达
2010年第 3期 李海军等:枯草杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导分泌表达
活力不强,且包涵体后续处理成本高,不利于工业化
的应用, 而分泌型表达能够很好地避免这些问
题 [ 7] ,作者针对这些问题开展了相关试验研究。
枯草杆菌 ( Bacillus sub tili ) B2是本实验室筛自
天山脚下的脂肪酶高产菌株,其脂肪酶基因已被克
隆到 PGM T载体上,根据 PGM T载体的测序结果,
经过生物信息学分析,设计出酶切位点引物,并通过
PCR技术获得该脂肪酶基因全长, 将其克隆到大肠
杆菌 pET28a( + )表达载体上, 利用枯草杆菌脂肪
酶自身的信号肽序列在 E. co li BL21( DE3)中获得
分泌表达,并通过乳糖诱导对表达条件进行了优化,
在国内尚属首次。
1 材料与方法
11 材料
111 菌种和质粒 枯草杆菌 (Bacillus subtili ) B2
为实验室自筛,表达宿主菌 BL21( DE3)由石河子大
学动物科技学院陈创夫教授提供, 质粒 pET28a
( + )由石河子大学生命科学学院祝建波副研究员
提供。
112 酶与试剂 限制酶、T4 DNA ligase、PCR所用
试剂均购于 Ferment公司。DNA回收试剂盒购于
TaK aRa公司。基因测序由北京华大基因生物科技有
限公司完成。其它化学试剂均为国产或进口分析纯。
113 PCR引物 根据 PGM TL ipB2克隆载体上
已测序的枯草杆菌脂肪酶基因序列设计如下引物,
由北京华大基因生物科技有限公司合成。
上游引 物 Lsb:f 5!CCGCAAGCCCATGGAAT
TCGTAAAA3!(划线部分为 N co∀酶切位点 ) ,
下游引物 Lsbr: 5!CCCCCTCGAGATTCGTAT
TCTGGCC3!(划线部分为 Xho∀酶切位点 ), 该引物
用于构建 pET28a( + ) L ipB2表达质粒;
上游引物 lip:f 5!GTTCACGGTATTGGAGGAG
3!,下游引物 lipr: 5!AATCAGGCTGTTGACTTGG3!,
该引物用于 PCR检测阳性重组子。
114 培养基 LB、SOB均按 #T aK aRa公司操作
手册∃推荐方法配制, 发酵产酶培养基: 蛋白胨
10%, 酵母膏 05% , 蔗糖 10%, 甘氨酸 10% , K2
HPO 401%, M gSO 4005%。橄榄油LB平板为透明
圈检测平板。
12 方法
121 基因操作 质粒抽提、PCR扩增、酶切反
应、DNA片段回收、连接反应、细菌转化、SDSPAGE
等技术均参考 #分子克隆 ∃[ 8]的方法。
122 大肠杆菌细胞的转化及阳性转化子的筛选
重组大肠杆菌表达载体质粒经提纯后, CaC l2法转化
大肠杆菌 BL21( DE3), 转化物涂布于含 Kan的 LB
平板上, 37 培养 1- 2 d, 然后将在 LB平板上生长
的 BL21pET28a( + )转化子点至含 K an和 IPTG的
LB培养基中, 在 37 、180 r/m in条件下培养 12 h
后碱裂解法抽提质粒。取 2 L该质粒作模板,以目
的基因内部片段两端序列为引物进行 PCR反应 (总
反应体积为 20 L, Taq酶量为 05 U ) , 反应完成
后,取 10 L PCR产物进行 1%琼脂糖电泳鉴定, 从
中选出阳性重组子, 并将其点至橄榄油 LB平板以
确定最佳的产酶重组子。
123 大肠杆菌的诱导分泌表达 将筛选到的大
肠杆菌阳性转化子接种至发酵产酶培养基中, 37
振荡培养 12- 20 h至 OD600为 06- 20,加入诱导
剂 IPTG和乳糖诱导表达,离心收集菌体和上清液。
124 表达产物的鉴定 取发酵液用橄榄油检验
板检测活性, SDSPAGE检测目的蛋白表达分子量
(浓缩胶浓度为 5%, 分离胶浓度为 15% )。以橄
榄油为底物, 用 N aOH滴定法测定酶活 [ 9 ]。酶活
单位定义:在 40 反应条件下, 每分钟催化脂肪水
解产生 1 mol脂肪酸的酶量为一个脂肪酶活力单
位 ( U )。
125 表达条件优化 对不同的诱导剂诱导效果
进行了比较,并对诱导时间长度、诱导剂浓度、诱导
时 OD值、诱导温度等条件进行了优化研究 [ 10]。每
组试验重复 3次,并设相应对照。
2 结果与分析
21 枯草杆菌脂肪酶序列分析
将 PGM TL ipB2克隆测序分析, 该脂肪酶基因
序列全长 635 bp,在 NCB I中比对,结果与枯草杆菌
属脂肪酶基因序列 (登录号: EU4821511)同源性达
940%。在 Expasy网站 ( http: / /www. expasy. org /
tools)对该脂肪酶的多项参数进行预测,得知该酶在
大肠杆菌体内半衰期 > 10 h;疏水性大于 99%,为不
溶性的脂肪酶;信号肽分析显示该酶可能为分泌型
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
的胞外酶; 该脂肪酶活性中心为丝氨酸 ( S ) 108, 天
冬氨酸 ( D ) 164,组氨酸 (H ) 187(图 1)。
下划线部分为推导的信号肽;方框为催化活性中心
图 1 枯草杆菌 B2脂肪酶全基因序列和
推导的 L ipB2氨基酸序列
在 ExPASy网站对该脂肪酶的空间结构进行了
预测, 结果显示该脂肪酶为球状蛋白,酶活性中心位
于酶分子表面的袋状结构底部,表面被氨基酸残基
所遮盖, 底物结合部位保守区序列为 A laH isSer
V alG ly。
22 表达质粒 ET28a( + ) LipB2的构建及转化
以经 E coR∀酶切后的 pGM TL ipB2产物为模
板, PCR扩增带酶切位点的 LipB2脂肪酶基因全
长 (图 2) , 琼脂糖凝胶回收的基因片段经 N co∀ /
X ho∀双酶切后与经同样双酶切的载体质粒 pET
28a( + )相连,构建表达质粒 BL21pET28a ( + ) ,
回收纯化后, C aC l2法转化大肠杆菌 BL21( DE3)。
M. DNA M ark er; 14.带酶切位点 L ipB2基因全长 PCR产物;
5.阴性对照
图 2 PCR扩增带酶切位点 L ipB2基因全长
23 重组大肠杆菌 BL21pET28a ( + ) LipB2的
筛选
脂肪酶可水解橄榄油, 在橄榄油检验板上产生
透明圈,透明圈越大表示酶活越高。试验中,经 LB
平板筛选后, 将长出的菌落分别点至橄榄油 LB平
板,以筛选产酶活性高的重组菌。挑取透明圈大的
菌落,以其质粒 DNA为模板,目的基因内部片段两
端序列为引物, 进行 PCR扩增, 扩增出一条约 483
bp的条带 (图 3), 大小与目的基因内部片段一致,
而对照未扩增出任何条带, 说明 L ipB2基因已整合
入重组大肠杆菌转化子的质粒 DNA中。
M. DNA M arker; 16. BL21pET28 a( + ) L ipB2阳性重组子质
粒 PCR验证; 7.阴性对照
图 3 阳性重组子的质粒 PCR验证
24 表达产物的鉴定
挑取 8株阳性重组子和对照 (野生 B2菌株 )进
行摇瓶发酵,添加不同浓度 IPTG诱导, 取 20 L发
酵液点至橄榄油 LB平板, 观察产生的透明圈, 可以
看出重组表达菌产生的透明圈明显大于野生型 B2
菌株 (图 4)。发酵上清液上样 30 L进行 15% SDS
PAGE,考马斯亮蓝 R250染色 (图 5),扫描图片分析
表明,目的蛋白分子量约为 21 kD,与枯草杆菌脂肪
酶一致,而阴性对照无此条带,说明 L ipB2基因在大
肠杆菌 BL21中得到正确表达和修饰。
2. 5 重组菌的诱导表达及优化
251诱导时间对重组菌诱导分泌表达的影响 如
图 6,乳糖和 IPTG诱导的枯草杆菌脂肪酶在大肠杆
菌中的分泌表达均随着时间的推移逐渐增强,当达到
最高酶活后均表现下降趋势,其中 IPTG诱导 8 h,酶
活达到最高值 ( 188 U /mL), 乳糖诱导 10 h, 酶活达
到最高值 ( 198U /mL)。乳糖诱导的分泌表达酶活
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2010年第 3期 李海军等:枯草杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导分泌表达
17不同 IPTG浓度诱导的 BL21pET28 a( + ) LipB2; 8.对照
野生型 B2菌株
图 4 不同 IPTG浓度诱导重组菌产生的透明圈
M.蛋白 M ark er; 1.无诱导的 BL21pET28 a( + )L ipB2; 2. 0. 1
mM IPTG诱导 8 h的 BL21PET28a( + ) LipB2; 3. 1. 5 mM乳
糖诱导 10 h的 BL21pET28a( + ) L ipB2; 4.对照 BL21 ( DE3 )
图 5 重组菌诱导表达产物的 SDSPAGE分析图
图 6 诱导时间对工程菌产酶的影响
高峰比 IPTG的滞后 2 h,其原因可能是乳糖需要一
定的时间诱导大肠杆菌产生能运输乳糖穿过细胞膜
的各种酶类,且在此过程中, 乳糖也可作为细胞的碳
源为细胞所利用,导致乳糖浓度不断发生变化,进而
在一定程度上推迟了酶活高峰的来临。
252 诱导剂浓度对重组菌诱导分泌表达的影响
如图 7,当 IPTG浓度为 01mmol /L进行诱导时, 酶
活最高 ( 230U /mL), 乳糖浓度为 15 mmo l/L进行
诱导时, 酶活最高 ( 191 U /mL ) , 过高或过低的
IPTG和乳糖都不利于重组菌产酶。这是由于随着
诱导剂浓度的增加。脂肪酶的表达量也在相应增
加, 而大肠杆菌细胞的分泌能力是有限的,当脂肪酶
的表达量低于细胞的分泌能力时, 酶活持续增加。
当脂肪酶的表达量与分泌能力持平时,酶活能够达
到最高值,当脂肪酶的表达量和损耗高于分泌能力
时,脂肪酶的酶活将持续降低。另外, IPTG诱导的
分泌表达脂肪酶增量大于乳糖诱导的增量, 可能
是因为 IPTG不被大肠杆菌所利用, 能够持续性地
诱导脂肪酶基因的表达, 而乳糖可作为大肠杆菌
的碳源, 真正发挥诱导作用的量相对较小, 因此,
利用乳糖作为诱导剂时其用量要远高于 IPTG的
用量。
图 7 诱导剂浓度对工程菌产酶的影响
253 诱导时机对重组菌诱导分泌表达的影响 如
图 8,当 OD600值为 14时开始诱导, IPTG诱导的脂肪
酶分泌表达酶活能够达到最高值 ( 235 U /mL), 当
OD600值为 18时开始诱导,乳糖诱导的脂肪酶分泌表
达酶活也能达到最高值 ( 235 U /mL) ,两者变化趋
势基本一致,说明起始诱导时 OD 600的大小对乳糖
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
诱导的最终酶活影响显著, 而起始诱导 OD600值对
IPTG诱导的影响不大。从两者的最佳起始诱导
OD600值来看, 最佳诱导时期都在重组菌生长的平
稳期,此时的细胞数量增速稳定,细胞各种机能健
全, 分泌系统也已完善, 因而利于脂肪酶的分泌
表达。
图 8 诱导时机对工程菌产酶的影响
254 诱导温度对重组菌诱导分泌表达的影响
如图 9, IPTG在 30 进行诱导时, 酶活达到最高值
( 250U /mL), 高于此温度酶活就会呈现快速下降
趋势; 乳糖在 30- 35 进行诱导时, 酶活达到最高
值 ( 260 U /mL ), 在 35 以下时, 酶活随着温度的
升高稳定增长,当高于 35 时, 酶活开始缓慢下降。
因为温度对大肠杆菌的新陈代谢速度有较强的影
响,进而影响外源基因在大肠杆菌中的表达,温度较
低时, 外源基因的表达量不足, 而温度过高则容易使
表达的脂肪酶不能及时转运至细胞外, 在胞内形成
无活性的包涵体, 所以达不到最高的分泌表达量。
IPTG因其结构稳定, 能够持续诱导且不被细胞利
用, 这种效应表现得非常明显, 而乳糖因可作为大
肠杆菌生长的碳源, 在较高的温度条件下容易被
细胞利用而降低了其诱导的有效浓度, 使脂肪酶
的表达水平下调, 抵消了因温度提高而导致的表
达上调,使酶活维持在一个比较稳定的水平。因
此, 与 IPTG相比, 利用乳糖作为诱导剂诱导枯草
杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的分泌表达具有明
显的优势。
图 9 诱导时间对工程菌产酶的影响
3 讨论
本研究以实验室自筛的枯草杆菌 B2脂肪酶高
产菌株为试验材料,克隆了该菌株脂肪酶基因,并利
用该脂肪酶基因自身的分泌型信号肽序列在大肠杆
菌中成功实现了分泌表达。经优化试验得出, 当
IPTG诱导培养 8 h,乳糖诱导培养 10 h; IPTG诱导
浓度为 01 mmo l/L,乳糖诱导浓度为 15 mmol /L;
IPTG诱导时菌液 OD600值为 14, 乳糖诱导时菌液
OD600值为 18; IPTG诱导时温度为 30 ,乳糖诱导
时温度为 30- 35 时, 两种诱导剂诱导的重组菌胞
外分泌酶活均达到最高值, 其中, IPTG诱导的重组
菌胞外分泌酶活最高值为 250 U /mL,乳糖为 260
U /mL, 分别为野生型枯草杆菌脂肪酶酶活的 25倍
和 26倍。为枯草杆菌 B2脂肪酶的工业化应用奠
定了良好的基础, 但是由于该脂肪酶的热稳定性和
活力都不是很高, 限制了其工业化的应用。目前本
实验室正在致力于通过定点突变技术对该脂肪酶活
性部位加以改造的相关研究,以期获得高产、高脂肪
酶活力的工程菌用于工业化生产。
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94
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
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