全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
猪 PBD1基因乳腺特异性表达载体的构建
黎丽荣1, 2 黄海军 1 高其双 3 董斌科 1 邓兵 1 刘艳 1
陶弼菲3 向敏 3 吴建英 3 蒋思文 1
( 1华中农业大学猪遗传育种农业部重点实验室农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,武汉 430070;
2咸宁职业技术学院,咸宁 437100; 3 武汉市畜牧兽医科学研究所,武汉 430065)
摘 要: 为构建猪 PBD1 基因乳腺特异性表达载体,采用 PCR方法从质粒 pcDNA31BLGHNP1中扩增出山羊乳球蛋
白 (BLG )基因, 插入到真核表达载体 pIRES2EGFPPBD1构建成乳腺特异性表达载体 pIRES2EGFPBLGPBD1。经 PCR鉴
定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,鉴定。结果成功构建了乳腺特异性表达载体 pIRES2EGFPBLGPBD
1。乳腺特异性表达载体 pIRES2EGFPBLGPBD1的成功构建,为进一步研究 PBD1蛋白的抗菌活性、抗菌机理及将进一步
该载体应用于动物乳腺生物反应器的研究奠定基础。
关键词: 猪 防御素 l 山羊乳球蛋白 乳腺特异性表达载体
Construction of theM ammary G land Special Expression Vector for
the Porcine Betadefensin 1
L iL irong
1, 2 HuangH aijun1 GaoQ ishuang3 Dong B inke1 Deng B ing1
L iu Yan
1 Tao B ifei3 XiangM in3 Wu Jiany ing3 Jiang Siw en1
(
1
H uazhong A gricultural University K ey Laboratory of Sw ineB reeding and Genetics, M inistry of Agriculture
& K ey Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Rep roduction, W uhan 430070;
2
X ianning VocationalT echnical
College, X ianning 437100;
3
Wuhan Institute of Animal and Veterinary Science, W uhan 430065)
Abstrac:t It was to construct a mamm ary g land spec ia l expression vector for the porcine be tadefensin 1BLG genew as am plified
from the vector o f pcDNA3 1BLGHNP1 and inserted into a eukaryotic expression p lasm id pIRES2EGFPPBD1The recomb inant
co lon ies were iden tified by them ethods o f restriction enzym e dig estion, PCR and sequenc ing Results show ed that them amm ary g land
spec ia l expression vector pIRES2EGFPBLGPBD1 w as successfully construc ted The estab lishm ent of mamm ary g land specia l expres
sion vector p IRES2EGFPBLGPBD1 w ou ld lays a founda tion in research on an tim icrob ia1 ac tiv ities and its m echan ism of the de
fensins, and a lso would bene fit further research on the establishm ent o f an im a lm amm ary bioreactor.
Key words: PBD1 BLG M amm ary g land spec ial expression vector
收稿日期: 20090224
基金项目:国家 863课题 ( 2007AA100505) ,武汉市科技攻关计划 ( 200820422192 )
作者简介:黎丽荣 ( 1966),女,湖北咸宁人,高级讲师;黄海军 ( 1980),男,湖北钟祥人,在读博士,研究方向:动物生物技术与干细胞研究; Em ai:l hygene_
005@ yahoo com cn;两作者为并列第一作者
通讯作者:蒋思文 ( 1963),男,湖北天门人,教授,博导,研究方向:分子遗传学与猪育种; Em ai:l jiangs iw en@ mailhzau edu cn, Te:l 02787284286
传统抗生素的广泛使用导致耐药菌株大量产
生,给感染性疾病的治疗带来了许多新的问题,因此
寻找和开发无耐药性的新型抗菌药物具有非常重要
的现实意义 [ 1 ]。近年来在生物体内发现的防御素
类物质就具有这种特殊的抗菌活性, G anz等 [ 2]将其
命名为防御素 ( Defensins)。
猪的 防御素 l( porcine defensin 1, PBD1)
广泛分布于肝、呼吸道、胸腺、脾脏、脐带等多种组织
细胞内,在猪防御系统中有重要作用,既可用作畜禽
饲料添加剂,也可用为食品保鲜剂,还可开发成新的
广谱抗菌药物 [ 3] ,因此猪防御素的成功获取能带来
极大的社会、经济效益。但猪体内天然防御素表达
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
量低、分子量小、分离困难以及化学合成防御素成本
又太高,所以利用基因工程技术重组表达外源基因
已成为获取目标蛋白的有效途径之一。国内外已有
采用不同的融合蛋白表达系统表达抗菌肽基因的报
道 [ 3~ 7] ,但目前尚未发现利用哺乳动物乳腺生物反
应器来生产该蛋白的报道。
乳腺生物反应器基于转基因技术平台, 将外源
基因导入动物基因组中并使用哺乳动物乳腺特异性
表达的启动子元件将其定位表达于动物乳腺, 利用
动物乳腺能够天然、高效合成及分泌蛋白质的能力,
从动物的乳汁中获取一些具有重要价值的重组蛋
白 [ 8]。山羊乳球蛋白 ( BLG )是山羊乳汁中主要的
乳清蛋白质,将外源基因置于乳球蛋白基因 5端调
控区的下游,能够有效地控制外源基因在动物乳腺
组织中的特异性表达 [ 9]。
本试验构建的乳腺特异性表达载体 pIRES2
EGFPBLGPBD1,是以 BLG基因作为调控序列,可
以指导目的蛋白 PBD1在动物乳腺组织特异性表
达。此外,该载体还含有增强型绿色荧光蛋白 ( EG
FP) ,可作为评价和预测体外构建的外源基因表达
载体合理性的直观的、快捷的依据。该载体的成功
构建为进一步研究 PBD1抗菌活性、抗菌机理, 以
及最终通过乳腺生物反应器途径获得大量药用蛋白
PBD1奠定基础。
1 材料与方法
11 材料
大肠杆菌 DH5、质粒 pcDNA31BLGHNP1
和 pIRES2EGFPPBD1由本室保存。
12 试剂
限制性内切酶 EcoRI、BamH I、Xho I、T4 DNA连接
酶、TaqDNA聚合酶、DNA M arker、DNA gel extraction
kit、Plasm idm ini preps kit均购自华美生物工程公司。
pMD18T购自 TaK aRa公司。载体 pIRES2EGFP购自
BD B iosciences C lontech公司。
13 引物设计与合成
根据 pcDNA31BLGHNP1中插入的片段 BLG
序列,设计出一对引物,并在上下游引物之 5端分别引
入 Xho I和 E coR I两个酶切位点和保护碱基,由上海生
工公司合成。上游引物: 5CCGCTCGAGTTCCC GCTG
3, 下游引物: 5CCGGAATTCGGGTGACGAT3 PBD1
引物由上海生工公司合成。上游引物: 5ACCAGCAT
GAGACTCCACC3,下游引物: 5GAGCAGCTTCTGAG
CCATA3。
14 PCR扩增 BLG片段
以质粒 pcDNA31BLGHNP1为模板, 用 13
中合成的 BLG引物扩增 BLG片段。 PCR反应体系
为 25 l。反应条件: 94 预变性 4m in, 94 变性 40
s, 58 退火 45 s, 72 延伸 40 s, 35个循环。最后一
轮 72 延伸 10 m in。反应结束后取 3 l产物做
12%琼脂糖凝胶电泳, 以 DL2000作为 Marker, 在
凝胶成像分析系统中观察结果。切取目的条带, 将
含目的片段的琼脂糖凝胶经 DNA纯化回收试剂盒
( DNA ge l extraction kit)回收。
15 质粒 pIRES2EGFPPBD1双酶切及目的片段
的回收
取回收纯化的 BLG产物和质粒 pIRES2EGFP
PBD1, 经 Xho I、E coR I双酶切于 37 孵育 2 h。反
应结束后取 3 l产物做 10%琼脂糖凝胶电泳, 以
DL2000作为分子量标准,在凝胶成像分析系统中观
察结果。切取目的条带, 将含目的片段的琼脂糖凝
胶经 DNA gel ex traction k it回收。
16 pIRES2EGFPBLGPBD1乳腺特异性表达载
体的构建
将回收纯化的 BLG产物和 pIRES2EGFPPBD
1大片段在 T4连接酶的作用下进行粘端连接, 连接
产物转化于 DH5,通过卡那霉素抗性筛选挑出阳
性单克隆菌落进行培养并小量提取质粒。
17 pIRES2EGFPBLGPBD1乳腺特异性表达载
体的酶切鉴定
将克隆检测为阳性的质粒分别进行 E coR I、
BamH I、Xho I、E coR I+ BamH I、BamH I+ Xho I、E coR I
+ Xho I和 EcoR I+ BamH I+ Xho I酶切,于 37 孵育
2 h。酶切产物在 05%琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成
像分析系统中观察结果。
18 pIRES2EGFPBLGPBD1乳腺特异性表达载
体的 PCR鉴定
以克隆检测为阳性的 pIRES2EGFPBLGPBD1
质粒为模板, 用 14中合成 BLG和 PBD1引物进行
PCR反应 ( PCR反应条件同 14), 切取各个目的条
带,将含目的片段的琼脂糖凝胶经 DNA ge l extraction
128
2009年第 5期 黎丽荣等 :猪 PBD1基因乳腺特异性表达载体的构建
kit回收。将回收产物与 pMD18T连接于 4 过夜。
次日转化感受态大肠杆菌 DH5,通过卡那霉素抗性
筛选挑出单克隆菌落, 于 37 摇床摇菌。经克隆检
测为阳性的菌液送上海生工公司测序。
2 结果与分析
21 PCR扩增 BLG片段
利用 PCR方法从猪肝脏组织 cDNA 中扩增
BLG基因,电泳结果表明,扩增产物大小与预期的结
果相符 (图 1)。
M. DL2000 DNA分子量标准; 1~ 2BLG的 PCR扩增产物
图 1 BLG的 PCR扩增
22 pIRES2EGFPBLGPBD1重组质粒的构建
质粒 pIRES2EGFPBLGPBD1构建示意图见
图 2。
图 2 质粒 pIRES2EGFPBLGPBD1构建示意图
23 pIRES2EGFPBLGPBD1重组质粒的酶切鉴定
将构建的 pIRES2EGFPBLGPBD1重组质粒
用 Xho I、E coRI和 BamH I进行酶切, 可以分别得到
约 5 300、879和 252 bp片段 (图 3) ,与理论设计相
符, 初步表明载体构建成功。
M11 kb Ladder DNA分子量标准; M 2 DL2000分子量标准; 1X ho I、
E coR I和 BamH I酶切产物; 2E coRI和 BamH I双酶切产物; 3XhoI和
B amH I双酶切产物; 4X hoI和 E coRI双酶切产物; 5XhoI酶切产物;
6BamH I酶切产物; 7E coRI酶切产物
图 3 重组质粒的酶切鉴定
24 pIRES2EGFPBLGPBD1重组质粒的 PCR
鉴定
以克隆检测为阳性的 pIRES2EGFPBLGPBD
1质粒为模板, 用 14中合成 BLG和 PBD1引物进
行 PCR反应, 分别获得 879 bp和 252 bp的目的片
段 (图 4)。利用 B last软件,将上海生工公司测序结
果与 NCB I网站序列进行比对, 结果完全一致。为
进一步验证构建的载体无移码突变等现象, 将提取
的质粒送往上海英骏生物工程公司,利用 P5通用引
物双向测序,结果证实该载体构建完全正确,且含有
PBD1自身信号肽序列, 能用于下一阶段在细胞水
平上进行蛋白表达的研究。
左图, BLG的 PCR检测 ( DL2000DNA分子量标准 ) ;右图为 PBD1的
PCR检测 ( DL2000DNA分子量标准 )
图 4 重组质粒 PCR完整检测 BLG和 PBD1基因的表达
(下转第 134页 )
129
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型腺病毒活载体疫
苗的研制奠定了基础。
参 考 文 献
1 郭宝清,陈章水,刘文兴 中国畜禽传染病, 1996, 87( 2 ): 1~ 5
2 蔡雪晖,柴文君,翁长江,等 中国预防兽医学报, 2000, 22 : 202
~ 205
3 P irzadeh B, D ea S J Gen V iro,l 1998, 79: 989~ 999
4 L iuGQ, C aiXH, ChouH J, et alCh in JP revenVeterM ed, 2001, 23:
72~ 76
5 In ik S, K lein D JG en V iro,l 2001, 81: 2497~ 2502
6 W eiland E, W ieczorekKrohm er M, Koh l D, et alV eter M icrob io,l
1999, 66: 171~ 186
7 P lana DJ, C lim ent I, S arraseca J, et alV iru s Gen es, 1997, 14: 19
~ 29
8 S iaoKunW an Welch, R ika Jolie, et alVeterinary Imm unology and
Imm unopathology, 2004, 102 : 277~ 290
9 D ea S, Gagnon CA, M ardass iHA rchV irol, 2000, 145: 659~ 688
10 O strow sk iM, Galeota JA, Jar AM J V iro,l 2002, 76: 4241~ 4250
11 Balasuriya UB, T im on ey PJ, M cC ollumWH, et al V irology, 1995,
214( 2 ) : 690~ 697
12 方六荣,肖少波,江云波,等.病毒学报, 2004, 20( 3 ): 249~ 254
13 马友记,柳纪省,赵兴绪,等 甘肃农业大学学报, 2005, 40 ( 6 ):
713~ 17
(上接第 129页 )
3 讨论
哺乳动物的防御素可以抗细菌、真菌等多种微
生物, 尤其是对支原体、衣原体、螺旋体以及一些恶
性细胞 (肿瘤细胞 )和艾滋病病毒有杀伤作用 [ 10 ] ,
极有可能成为新一代抗菌药物的理想选择 [ 11 ]。猪
防御素作为防御素家族重要成员, 具有极高的研
究和开发应用价值。但猪体内天然 防御素表达
量低、分子小、分离困难及化学合成防御素成本又太
高,所以利用基因工程技术重组表达外源基因已成
为获取目标蛋白的最有效途径之一 [ 3 ~ 7 ]。
动物乳腺生物反应器技术是指利用可在哺乳动
物乳腺特异性表达的启动子元件构建重组基因,使
外源基因可在乳腺中表达,从而获得转基因动物,并
从转基因动物的乳液中获取重组蛋白 [ 8]。由于其
巨大的商业和社会价值, 动物乳腺生物反应器已成
为 21世纪生物制药发展的重点方向之一。
本研究构建的 pIRES2EGFPBLGPBD1, 在目
的基因之前插入山羊 BLG调控序列, 利于目的蛋白
在乳腺特异性高效表达 [ 9]。该载体包含的增强型
绿色荧光蛋白确保了试验过程中能够进行直观、及
时地观察和检测 [ 12 ]。此外,经典途径分泌的细胞因
子其基因序列中都含有前导的信号肽序列, 可引导
蛋白质经由高尔基体 -内质网途径分泌。本试验构
建的乳腺特异性表达载体正是包含了 PBD1自身
的信号肽,可以保证表达产物正常分泌到胞外。因
此, 基于以上分析成功构建的猪 PBD 1基因乳腺特
异性表达载体, 为进一步研究其 PBD1抗菌活性、
抗菌机理,以及最终通过乳腺生物反应器途径获得
大量药用蛋白 PBD1奠定了基础。
参 考 文 献
1 M iyasak iKT, et al In t JAn tim icrobAgen ts, 1998, 9 ( 4) : 269~ 280.
2 Gan zT, et a1. J C lin Inves t, 1985, 76: 1427.
3 Sh,i J G Zhang, H W u, et a1. In fect Imm un, 1999, 67: 3121~ 3127.
4 Procht T B iochem is try, 1997, 36 ( 42) : 1 2869~ 12880.
5 Chen Y, W ang YQ, Sun YR, et a1. Cu rr Genet, 2001, 39: 365
~ 370
6 姜丽华,卢海蓉,黄德新,等 生物工程学报, 2006, 22( 6 ): 1036
~ 1039
7 Park SS, et a1 Insect B iochem M ol B io,l 1997, 27 ( 8 ~ 9 ) : 711
~ 720.
8 Palm iterRD, B rinster RL, H amm erRE, et a1. Natu re, 1982, 300: 611
~ 615
9 宋红卫,郑月茂,张明烽,等 西北农林科技大学学报 (自然科学
版 ) , 2005, 33( 5) : 12~ 18
10 N icolas P, M or A. Annu Rev M icrob io,l 1995, 49: 277~ 280.
11 李咏兰, 邵艳红, 邱广亮,等 中国兽医杂志, 2008, 44 ( 2 ) : 9
~ 11
12 Jackson RJ, H ow ellMT, K am insk i ATrends B ioch em Sc,i 1990, 15
( 12) : 477~ 483
134